Relatório técnicas de conservação e coloração de amostras biológicas

Prévia do material em texto

Aula 3 – Bloco 1 (05/09/2019)
Técnicas de conservação e coloração de amostras biológicas
 Conservação
Após a coleta dos microrganismos, as amostras biológicas precisam ficar preservadas de maneira segura, por isso é necessário estarem devidamente guardados em recipientes apropriados para cada tipo de amostra coletada. A conservação do material precisa ser feita da melhor forma possível, de modo que deve ser analisado a integridade e estabilidade específica de cada material biológico para que sofram menor alteração possível da forma original.
Tipos de conservação:
- Métodos para análise física: desacelera a atividade metabólica das amostras através da diminuição da temperatura que causa secura, impedindo assim, a decomposição do material.
Refrigeração: é um método mais comum e prático em que a amostra biológica é conservada em temperatura de 2 °C a 8 °C. Não mata seres homeotérmicos, apenas diminui o metabolismo, conservando-os por um curto período, por isso este método é eficaz somente por alguns dias.
Congelamento: conserva agentes em temperaturas entre -4 e -20°C. Pode-se ocorrer mudanças na amostra, como perda de seu pigmento natural, mudança na estrutura celular e/ou perda de algumas de suas propriedades, tornando esse método ineficaz para análises químicas. Apresenta-se como um dos métodos de manutenção mais simples e baratos, além de oferecer boa segurança para o armazenamento de diversos microrganismos por períodos de três meses a dois anos, devido a uma redução significativa no metabolismo celular. Após o congelamento, o material entra em estado de inércia, deixando de promover atividades biológicas e reações químicas.
Um dos principais danos que podem ocorrer com o material biológico é a formação de cristais de gelo, que podem causar danos mecânicos, bioquímicos e osmóticos para a célula. Para diminuir o efeito de desidratação e formação de cristais de gelo, os materiais biológicos devem ser conservados dentro de tubos de ensaio com tampa rosqueavel ou seladas, em ambientes protegidos da luz e do aumento de temperatura, mantendo uma média na temperatura.
Cristais de gelo – o congelamento ultra-rápido em alguns métodos de conservação podem ocasionar a formação de gelo intracelular, provocando danos na estrutura celular, degradando enzimas presentes no citosol, causando a morte da célula.
Criopreservação: congelamento por tempo indeterminado. Utilizada apenas para amostras microbiológicas, como suspensão de células animais ou vegetais, pedaços de tecido, bactérias, fungos ou vírus. Para essa célula ser mantida viva após seu congelamento, é necessário tratamento químico através de crioprotetores para que o material consiga se manter vivo após o descongelamento.
Crioprotetores – substâncias utilizadas para proteger tecidos biológicos de danos de congelamento, através do aumento da concentração de solutos nas células. Convencionalmente, os crioprotetores são: glicol ( etilenoglicol, propilenoglicol e glicerol) e dimetilsulfóxido.
A criopreservação consiste na manutenção de tipos celulares sob baixas temperaturas (-20°C a -80°C em freezers) ou ultra baixas temperaturas (-150°C a -196 °C em containeres de nitrogênio líquido ou freezeres específicos), objetivando reduzir danos das amostras biológicas durante o processo de congelamento e estocagem dos materiais. Enquanto a temperatura em freezers pode variar, em sistemas de nitrogênio líquido é muito mais seguro e duradouro. Este método protege os cultivos contra possíveis problemas derivados de contaminação microbiana, erros de manipulação e identificação de frascos de cultivo. Além disso, requer menor espaço para estocagem (armazena-se apenas 1,0 ml ou 2,0 ml de cada cultura. O rendimento costuma ser maior à longo prazo, por precisar de pouca manutenção. Porém, a criopreservação precisa de equipamento especializado e da duplicação de todas as culturas realizadas para prevenir possíveis problemas de descongelamento.
Vitrificação – método de criopreservação mais barato e rápido que mantém as células congeladas ainda vivas, sem danos químicos e sem formação de gelo. São utilizados altas concentrações de crioprotetores para se comportarem como sólidos sem cristalizar. O material é resfriado tão rapidamente que evita o congelamento, apresentando um estado amorfo conhecido como vítreo sólido.
Freezer científico - temperaturas de -50°C à 150°C. São guardados os tubos criogênicos com o conteúdo celular.
Tubo criogênico – tubo feito de polipropileno resistente à baixas temperaturas que armazenam materiais biológicos em equipamentos. É grandemente utilizado no congelamento com nitrogênio.
Liofilização: é a remoção de toda a água intracelular de materiais biológicos através da sublimação, desidratando as amostras que ficam em condições de vácuo, capacitando o retardamento do relógio biológico natural, evitando também a formação de cristais de gelo. Após o estado inicial de congelamento, a amostra sofre desidratação e temperaturas de secagem, a partir de condições de baixa pressão. Processo de secagem à frio que não altera a composição química da amostra, as únicas alterações possíveis na substância é murchar ou enxugar. Também pode ser utilizado o gel de sílica para preservar a substância desidratada. É feito através do liofilizador, que - possui compartimentos que recebem as amostras e uma bomba de vácuo que retira a unidade das amostras, deixando-as totalmente secas após algumas horas.
A liofilização e a criopreservação são as técnicas mais empregadas na conservação de amostras microbianas por garantir a durabilidade dos materiais e por ser aplicável em diversos agentes, excluindo as algas e os protozoários.
Imagem 3 - Liofilizador
FONTE: Imagem cedida pelo professor Sérgio Lourenço
 Após o descongelamento e a reanimação celular, a célula permanece com a mesma maturidade que tinha no momento que foi congelada.
Frasco de Dewar ou botijão nitrogênico - constituído de cerâmica (isolante térmica), uma camada preenchida por vácuo e nitrogênio líquido que precisa ser reabastecido frequentemente. Suas vantagens são o aumento da durabilidade da baixa temperatura e não precisas de equipamentos de refrigeração com custo elevado.
Imagem 1 – Botijão criogênico
FONTE: Imagem cedida pelo professor Sérgio Lourenço
Montagem de exsicatas: após ser coletado o exemplar de alguma planta, ela é submetida à herborização (prensada e desidratada) em folhas de jornais e prensas de madeira e levadas para secagem em estufa. Propicia a conservação de plantas secas por tempo indeterminado em um ambiente sem umidade. Durante esta aula, foram feitas exsicatas de exemplares de Ulva fasciata diretamente de dentro da água em uma folha.
Imagem 2 – Montagem de exsicatas
FONTE: Imagem cedida pelo professor Sérgio Lourenço
Secagem em estufa - utilizado para a secagem de exsicatas, normalmente dentro de câmaras (comumente de madeira), com lâmpadas para auxiliar a secagem, estando o local com aproximadamente 60ºC, levando até 3 dias para total secagem, dependendo da amostra. A desvantagem é que mata o material, além de deixar quebradiço e/ou enrugado. 
Também pode ser conservado em gel de sílica que ajuda no processo de ultrassecagem, um processo rápido e asséptico que retira grande quantidade da umidade do material.
-Métodos para análise química: feito a partir da utilização de compostos químicos para impedir o desenvolvimento de microrganismos. São incompatíveis com amostras vivas.
Orgânicos: formados principalmente por substâncias que apresentam Carbono em suas fórmulas.
Formaldeído (CH2O): é o composto mais simples da família dos aldeídos, é inflamável, solúvel em água e nocivo à saúde. A concentração depende do tamanho de cada organismo. Não é bom conservante para seres que possuem carbonato de cálcio.
Glutaraldeído (C5H8O2): é um dialdeído saturado com preço mais elevado. É eficaz contra uma variedade de microrganismos, não descolore e sofre por influência do meio externo( pH, temperatura, tempo de imersão). Também é volátil mas possui toxicidademenor que o aldeído.
Glicerol (C3H803): é um dos mais versáteis e valiosos compostos orgânicos, com função álcool, é líquido, viscoso e inodoro, não é tóxico e é bom agente de conservação.
Inorgânicos: substâncias formadas por moléculas que não possuem átomos de Carbono ligados ao Hidrogênio.
Cloreto de mercúrio (HgCl2): altamente tóxico e corrosivo, era utilizado como desinfetante.
Lugol : composto pela mistura de quatro componentes: iodo molecular, ácido acético, iodeto de potássio e água. Não é tóxico e além de ser utilizado como conservante, também serve como corante, desinfetante e antisséptico.
Corantes
São utilizados para uma identificação eficaz de estruturas e funções biológicas. Essas substâncias, quando expostas à radiação UV, tem o com