Imunoensaios (1)

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“IMUNOENSAIOS”
Salvador
2019
Prof. João Cotrim
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INTRODUÇÃO
Imunoensaios: Métodos analíticos que utilizam imunocomplexos para gerar um resultado perceptível desta interação.
Analito: 
 Antígeno ou anticorpo?
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Interação Antígeno - Anticorpo
Pontes de hidrogênio
Ligações hidrofóbicas
Forças de Van der Waals
Forças eletrostáticas
INTRODUÇÃO
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Teste de Referência (padrão-ouro)
Sensibilidade
Especificidade
Reprodutibilidade
Índice Kappa
Valor Preditivo Positivo
Valor Preditivo Negativo
Parâmetros e Controle de Qualidade de Imunoensaios
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Teste de Referência (padrão-ouro)
Parâmetros e Controle de Qualidade de Imunoensaios
Teste ou procedimento que é utilizado para definir o verdadeiro estado do paciente. É definitivo e independente do teste que está sendo avaliado.
Sensibilidade
Proporção de todos os pacientes com a doença que apresentam resultados positivos quando o teste em particular é utilizado.
Sensibilidade = VP /(FN + VP)
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Parâmetros e Controle de Qualidade de Imunoensaios
Especificidade
Proporção de todos os pacientes sem a doença que apresentam resultados negativos quando o teste em particular é utilizado.
Especificidade = VN /(FP + VN)
Reprodutibilidade
Obtenção de resultados iguais em testes do mesmo formato, realizados com a mesma amostra biológica por diferentes técnicos em diferentes locais. É influenciada pela qualidade dos reagentes e condições técnicas e operacionais do laboratório.
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Parâmetros e Controle de Qualidade de Imunoensaios
Índice KAPPA (Ҡ)
Mede a avaliação da reprodutibilidade pelo grau de concordância entre os resultados de dois ou mais observadores.
Ҡ = (PO-PE)/(1-PE)
Resultado quase perfeito:
(0,81 – 1,0)
Valores Preditivos
Precisão de um teste prever uma condição médica.
VPP = VP /(VP + FP)
VPN = VN /(FN + VN)
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IMUNOPRECIPITAÇÃO
IMUNOENSAIOS
ENZIMOIMUNOENSAIO
IMUNOENSAIOS FLUORESCENTES
IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO
IMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE
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IMUNOPRECIPITAÇÃO
Quantificação de precipitados em uma solução em que Ag ou Ac estão diluídos. 
Os testes de precipitação são utilizados para a detecção de antígenos solúveis (proteínas, glicoproteínas). Preferencialmente anticorpos policlonais para antígenos multivalentes.
Pró-zona:
Falso-negativo
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IMUNOPRECIPITAÇÃO
Técnicas de Imunoprecipitação
Manuais:
Imunodifusão
Imunoeletroforese
Imunofixação
Eletroimunodifusão
Automatizadas:
Turbidimetria
Nefelometria
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IMUNOPRECIPITAÇÃO
Imunodifusão
 
- Difusão de substâncias solúveis por movimentos moleculares ao acaso em meio gelificado (ágar ou gel de agarose).
 - Enquanto as moléculas estão livres continua ocorrendo difusão, até que se formam IMUNOCOMPLEXOS de elevado peso molecular e que, devido ao tamanho, ficam imobilizados no gel
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IMUNOPRECIPITAÇÃO
Imunoeletroforese
 
Combina eletroforese e difusão. Antígenos são evidenciados por diferenças de carga elétrica sendo detectados a partir da migração dos mesmos, carregados em um solvente condutor sob a influência de um campo elétrico.
Gamopatias monoclonais como o mieloma múltiplo.
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IMUNOPRECIPITAÇÃO
Imunofixação
 Combinação de eletroforese e imunoprecipitação para detecção de anticorpos.
 Utilizada para a detecção precoce de gamopatias monoclonais, biclonais, além de auxiliar no diagnóstico e monitorização de outras doenças linfoproliferativas.
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IMUNOPRECIPITAÇÃO
Quando um feixe de luz incidente atravessa meio contendo partículas, estas interferem com a passagem de luz, fazendo com que seja dispersa em todas as direções – Efeito Tyndall
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IMUNOPRECIPITAÇÃO
Reação de precipitação entre antígeno e anticorpo é medida por um equipamento específico que mede a difração (desvio) da luz ao passar por uma solução contendo complexos imunológicos.
Importante na determinação de proteínas de significado clínico.
Nefelometria
Lâmpadas de halogênio
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IMUNOPRECIPITAÇÃO
Nefelômetro
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IMUNOPRECIPITAÇÃO
Imunoturbidimetria
 Imunoturbidimetria mede a diminuição da luz ao passar por um complexo antígeno-anticorpo. Em outras palavras, a turbidimetria mede o quanto a solução antígeno-anticorpo absorve da luz e o quanto ela deixa passar.
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AGLUTINAÇÃO
São reações que tem como base a formação de agregados visíveis pela interação Ag-Ac. Um dos componentes se apresenta insolúvel em suspensão, em células, ou adsorvidos a micropartículas.
Aplicação:
Diagnóstico de doenças infecciosas;
Diagnóstico de doenças autoimunes;
Detecção de hormônios;
Tipagem sanguínea.
* Teste de Coombs
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AGLUTINAÇÃO
Aglutinação Direta
A célula, contendo antígenos, serve de fase sólida da reação. (Hemaglutinação) – Tipagem sanguínea.
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AGLUTINAÇÃO
Aglutinação Indireta
Antígeno ou anticorpo é adsorvido a uma partícula ou célula que não interfere na reação Ag/Ac. Ex. Látex e Hemácias formolizadas de aves e carneiro.
Látex
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AGLUTINAÇÃO
Vantagens:
Sensibilidade elevada;
Fácil execução;
Barato.
Desvantagens:
Leitura subjetiva;
Reações cruzadas;
Pró-zona.
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ENZIMOIMUNOENSAIO
Teste que utiliza atividade catalítica de uma enzima para quantificação da reação antígeno-anticorpo.
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
Consiste num anticorpo conjugado a uma enzima capaz de modificar um cromógeno, através da reação com seu substrato específico, gerando colorações diferentes de acordo com o cromógeno.
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ENZIMOIMUNOENSAIO
Fase sólida ou suporte
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
Amostra
Bloqueio
Diluente da amostra
Solução de lavagem
Conjugado
Substrato
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ENZIMOIMUNOENSAIO
ELISA Indireto
Detecção de anticorpos.
Resultado positivo: Presença de coloração
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ENZIMOIMUNOENSAIO
ELISA de Captura ou Sanduíche
Detecção quantitativa de antígenos.
Resultado positivo: Presença de coloração
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ENZIMOIMUNOENSAIO
ELISA Competitivo
Detecção quantitativa de antígenos ou anticorpos.
Resultado positivo: Ausência de coloração
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ENZIMOIMUNOENSAIO
Dot-ELISA ou Immunodot
Variação do teste de ELISA, em que o substrato cromogênico forma uma mancha colorida na fase sólida (nitrocelulose).
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ENZIMOIMUNOENSAIO
Immunoblot
Utilizada para caracterizar antígenos em uma amostra biológica. Utiliza eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), fracionando os antígenos pelo peso molecular. Eletrotransferência para membrana de nitrocelulose. Se realiza immunoblot.
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ENZIMOIMUNOENSAIO
Aplicação
Sorodiagnóstico de infecções
Quantificação de citocinas e quimiocinas
Pesquisa de autoanticorpos
Dosagens hormonais
Quantificação de marcadores tumorais
Monitorização de drogas terapêuticas
Detecção de drogas de abuso
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Imunofluorescência
Emprega conjugados constituídos de anticorpos ou antígenos ligados covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos.
Fluorocromo: Emite fluorescência ao absorver luz em comprimento de luz baixo (UV).
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Imunofluorescência
Direta: Detecção do antígeno diretamente em células ou tecidos.
Indireta: Anticorpo marcado com fluorocromo para detecção de anticorpos que se fixaram em antígenos celulares ou particulados.
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Quimioluminescência
Muito utilizados para determinação quantitativa de hormônios, marcadores tumorais, peptídeos e drogas.
Emissão de luz utilizada para identificação de reação antígeno-anticorpo. Identificada por luminômetro, fotomultiplicador, ou filme fotográfico. Ex. Éster de acridina – Agentes oxidantes.
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BOM ESTUDO!!!
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No imunoensaio, o sítio combinatório do anticorpo (Ac) ou paratopo interage especificamente com porções mais superficiais (determinantes antigênicos ou epitopos) do antígeno (Ag) ou hapteno (substância não protéica de baixo pesomolecular que pode se ligar a sítios específicos de combinação de anticorpos
 
Essa interação é mantida por forças fracas, como forças iônicas, ligações de hidrogênio, forças eletrodinâmicas (van der Waals) e hidrofóbicas, garantindo o fenômeno da especificidade antígeno-anticorpo.
Pontes de hidrogênio: existentes entre átomos eletropositivos (hidrogênio) e átomos eletronegativos (oxigênio ou nitrogênio).
 
Forças eletrostáticas: representadas pela atração exercida entre dois grupamentos de cargas opostas, por exemplo, os grupos NH3+ e COOH- nasestruturas do anticorpo e do antígeno.
 
Forças de Van der Waals: ligadas ao movimento dos elétrons. Com aaproximação máxima, as nuvens eletrônicas de antígeno e anticorpo interagem formando uma nuvem única em torno do complexo “Ag-Ac”, estabilizando-o.
Ligações hidrofóbicas: associação de grupos hidrofóbicos não polares, de modo que o contato com moléculas de água é minimizado.
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Imunodifusão Dupla de Ouchterlony: Utiliza como meio de difusão o gel de agarose. Antígeno e anticorpo se difundem em todas as direções. Ao se encontrarem forma-se uma linha de precipitação. É de grande utilidade na identificação de microrganismos patogênicos e auto anticorpos em doenças auto-imunes. Porém somente pode ser utilizada em reações antígeno-anticorpo que formem precipitado, e requer grande tempo para que ocorra a difusão e precipitação (até 24 horas). 
Imunodifusão Radial de Mancini: Método realizado em gel de agarose com anti-soros específicos já incorporados ao gel. As amostras são aplicados em “poços” circulares já feitos no gel. À medida que a difusão ocorre, a reação antígeno-anticorpo forma anéis de precipitação e a concentração de antígeno é proporcional ao raio do anel de precipitação. Ao medir o diâmetro do círculo de precipitado, utiliza-se com uma tabela contendo os valores de diâmetro relacionados com a concentração de antígeno. 
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Imunodifusão Dupla de Ouchterlony: Utiliza como meio de difusão o gel de agarose. Antígeno e anticorpo se difundem em todas as direções. Ao se encontrarem forma-se uma linha de precipitação. É de grande utilidade na identificação de microrganismos patogênicos e auto anticorpos em doenças auto-imunes. Porém somente pode ser utilizada em reações antígeno-anticorpo que formem precipitado, e requer grande tempo para que ocorra a difusão e precipitação (até 24 horas). 
Imunodifusão Radial de Mancini: Método realizado em gel de agarose com anti-soros específicos já incorporados ao gel. As amostras são aplicados em “poços” circulares já feitos no gel. À medida que a difusão ocorre, a reação antígeno-anticorpo forma anéis de precipitação e a concentração de antígeno é proporcional ao raio do anel de precipitação. Ao medir o diâmetro do círculo de precipitado, utiliza-se com uma tabela contendo os valores de diâmetro relacionados com a concentração de antígeno. 
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Imunodifusão Dupla de Ouchterlony: Utiliza como meio de difusão o gel de agarose. Antígeno e anticorpo se difundem em todas as direções. Ao se encontrarem forma-se uma linha de precipitação. É de grande utilidade na identificação de microrganismos patogênicos e auto anticorpos em doenças auto-imunes. Porém somente pode ser utilizada em reações antígeno-anticorpo que formem precipitado, e requer grande tempo para que ocorra a difusão e precipitação (até 24 horas). 
Imunodifusão Radial de Mancini: Método realizado em gel de agarose com anti-soros específicos já incorporados ao gel. As amostras são aplicados em “poços” circulares já feitos no gel. À medida que a difusão ocorre, a reação antígeno-anticorpo forma anéis de precipitação e a concentração de antígeno é proporcional ao raio do anel de precipitação. Ao medir o diâmetro do círculo de precipitado, utiliza-se com uma tabela contendo os valores de diâmetro relacionados com a concentração de antígeno. 
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A amostra é aplicada em 6 posições diferentes do gel de agarose, seguido da separação eletroforética de acordo com a carga.
Soros mono-específicos contendo anticorpos específicos são adicionados individualmente sobre cada posição respectiva.
Em seguida, aplica-se uma solução fixadora de proteínas.
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Segundo o princípio da nefelometria, as reações de precipitação entre antígeno e anticorpo em soluções diluídas produzem um aumento da reflexão da luz, que pode ser diretamente medida pela dispersão da luz incidente.
A turbidimetria é utilizada para medir a intensidade da luz dispersa. Fotômetros ou espectrofotômetros são frequentemente utilizados como turbidímetros, uma vez que medidas turbidimétricas são facilmente executáveis nesses equipamentos, exigindo pouca otimização. A principal preocupação relacionada às medidas turbidimétricas é a relação entre o sinal e ruído de fundo. Sistemas fotométricos com ruído eletroóptico no intervalo dê 0,0002 unidade de absorbância ou inferiores são úteis para medições de turbidez.
A nefelometria é definida como a detecção de energia da luz dispersa ou refletida em direção a um detector que não se encontra na trajetória direta da luz transmitida. Nefelômetros comumente medem luz dispersa em ângulo reto em relação à luz incidente. Alguns nefelômetros são projetados para medir a luz dispersa em ângulos diferentes de 90°, para aproveitar o aumento na intensidade para frente causada pela dispersão da luz por partículas maiores.
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Segundo o princípio da nefelometria, as reações de precipitação entre antígeno e anticorpo em soluções diluídas produzem um aumento da reflexão da luz, que pode ser diretamente medida pela dispersão da luz incidente.
A turbidimetria é utilizada para medir a intensidade da luz dispersa. Fotômetros ou espectrofotômetros são frequentemente utilizados como turbidímetros, uma vez que medidas turbidimétricas são facilmente executáveis nesses equipamentos, exigindo pouca otimização. A principal preocupação relacionada às medidas turbidimétricas é a relação entre o sinal e ruído de fundo. Sistemas fotométricos com ruído eletroóptico no intervalo dê 0,0002 unidade de absorbância ou inferiores são úteis para medições de turbidez.
A nefelometria é definida como a detecção de energia da luz dispersa ou refletida em direção a um detector que não se encontra na trajetória direta da luz transmitida. Nefelômetros comumente medem luz dispersa em ângulo reto em relação à luz incidente. Alguns nefelômetros são projetados para medir a luz dispersa em ângulos diferentes de 90°, para aproveitar o aumento na intensidade para frente causada pela dispersão da luz por partículas maiores.
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Segundo o princípio da nefelometria, as reações de precipitação entre antígeno e anticorpo em soluções diluídas produzem um aumento da reflexão da luz, que pode ser diretamente medida pela dispersão da luz incidente.
A turbidimetria é utilizada para medir a intensidade da luz dispersa. Fotômetros ou espectrofotômetros são frequentemente utilizados como turbidímetros, uma vez que medidas turbidimétricas são facilmente executáveis nesses equipamentos, exigindo pouca otimização. A principal preocupação relacionada às medidas turbidimétricas é a relação entre o sinal e ruído de fundo. Sistemas fotométricos com ruído eletroóptico no intervalo dê 0,0002 unidade de absorbância ou inferiores são úteis para medições de turbidez.
A nefelometria é definida como a detecção de energia da luz dispersa ou refletida em direção a um detector que não se encontra na trajetória direta da luz transmitida. Nefelômetros comumente medem luz dispersa em ângulo reto em relação à luz incidente. Alguns nefelômetros são projetados para medir a luz dispersa em ângulos diferentes de 90°, para aproveitar o aumento na intensidade para frente causada pela dispersão da luz por partículas maiores.
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Segundo o princípio da nefelometria, as reações de precipitação entre antígeno e anticorpo em soluções diluídas produzem um aumento da reflexão da luz, que pode ser diretamente medida pela dispersão da luz incidente.
A turbidimetria é utilizada para medir a intensidade da luz dispersa. Fotômetrosou espectrofotômetros são frequentemente utilizados como turbidímetros, uma vez que medidas turbidimétricas são facilmente executáveis nesses equipamentos, exigindo pouca otimização. A principal preocupação relacionada às medidas turbidimétricas é a relação entre o sinal e ruído de fundo. Sistemas fotométricos com ruído eletroóptico no intervalo dê 0,0002 unidade de absorbância ou inferiores são úteis para medições de turbidez.
A nefelometria é definida como a detecção de energia da luz dispersa ou refletida em direção a um detector que não se encontra na trajetória direta da luz transmitida. Nefelômetros comumente medem luz dispersa em ângulo reto em relação à luz incidente. Alguns nefelômetros são projetados para medir a luz dispersa em ângulos diferentes de 90°, para aproveitar o aumento na intensidade para frente causada pela dispersão da luz por partículas maiores.
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A técnica é mais sensível do que as reações de precipitação, embora seja semiquantitativa. Necessita de uma quantidade de anticorpos 500 vezes menor, pois as partículas ampliam a reação.
A característica principal da imunoaglutinação é que um dos componentes é apresentado na forma insolúvel em suspensão, de forma natural em células ou adsorvido artificialmente em micropartículas ou células. 
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ocorre quando a quantidade de anticorpos presente na amostra de soro puro é desproporcional em relação à quantidade de antígeno do teste, gerando resultados falso-negativos no exame. Utilizar diferentes diluições de anticorpos.
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Fase sólida: Poliestireno, poliacrilamida, partículas da agarose...
Amostra: soro ou plasma. Sem hemólise ou lipólise.
Bloqueio: Leite desnatado, caseína, albumina... 
Diluente: Diminuir a adsorção de componentes inespecíficos ao suporte sólido. Tween 20 ou bloquei diduído.
Solução de lavagem: Soluções isotônicas (solução salina tamponada com fosfatos contendo 0,01-0,05% de tween 20)-PBS
Conjugado: Ant´´igeno ou anticorpos ligados covalentemente às enzimas. Preservam suas funções.
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O método indireto é utilizado para detecção de anticorpos. Neste caso o antígeno fica aderido aos poços da microplaca. Em seguida coloca-se o soro problema e em seguida um anticorpo marcado com uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos poços indica a presença do anticorpo, e os poços que não mudarem de cor indica a ausência do anticorpo em questão.
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O método de sanduíche, ou captura, é indicado para identificação de antígenos, e este antígeno fica entre dois anticorpos. Assim, um anticorpo primário específico ao antígeno é adsorvido no poço da microplaca. Em seguida o antígeno na solução problema é adicionado. Depois o segundo anticorpo específico ao antígeno é marcado com uma enzima é adicionado. Esta enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos poços indica a presença do antígeno, e os poços que não mudarem de cor indica a ausência do antígeno em questão.
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Neste método primeiro se adsorve o anticorpo no poço da micro placa. Após a adsorção do anticorpo, uma solução que possivelmente contém o antígeno é adicionada sobre os anticorpos adsorvidos. O próximo passo é adicionar o antígeno marcado com uma enzima. Os poços que não possuem o antígeno primário (da solução problema) aderido ao anticorpo ficam coloridos, enquanto que os poços que possuem antígenos aderidos aos anticorpos não mudam de cor.
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Antígenos são adsorvidos à membrana. Incubada com amostra, e conjugado. Produto colorido.
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Antígenos são adsorvidos à membrana. Incubada com amostra, e conjugado. Produto colorido.
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Antígenos são adsorvidos à membrana. Incubada com amostra, e conjugado. Produto colorido.
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Antígenos são adsorvidos à membrana. Incubada com amostra, e conjugado. Produto colorido.
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Antígenos são adsorvidos à membrana. Incubada com amostra, e conjugado. Produto colorido.
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