IMUNOLOGIA CLÍNICA _ IMUNOENSAIOS

Prévia do material em texto

AFINIDADE
Força de ligação do Ag com
o AC, em um único sítio.
AVIDEZ
Força Total de ligação ,
nos dois sítios.
ISOTIPO
A composição determina a
função dos Ac e os locais
onde são encontrados.
REAÇÕES CRUZADAS
É a habilidade de uma população de
moléculas de Acs reagirem com mais
de um Ag.
IMUNOLOGIAIMUNOLOGIA
 Detecção , quantificação e caracterização de
anticorpos (Acs) ou de antígeno (ags) e seu
uso como ferramenta para pesquisa e
diagnóstico.
Imunodiagnóstico
Diagnóstico laboratorial
por meio de técnicas
imunológicas.
ESPECIFICIDADE
Habilidade do Ac distinguir
seu imunógeno de outros Ag.
RESPOSTA DE ANTICORPOS
Entre os fatores físico-químicos e
imunológicos que interferem na
quantidade de precipitado formado:
concentrações de Ag e Ac.
 A Reação entre antígeno e anticorpo
é reversível.
A curva de precipitação clássica pode
ser obtida quando o anticorpo em
concentração constante interage com
o antígeno em diferentes
concentrações, apresentando aspecto
parabólico.
A precipitação será máxima na zona
de equivalência ou de proporções
ideais de antígeno e anticorpo. No
entanto, à medida que se adiciona
mais antígeno, o imunocomplexo se
dissolve.
A zona de excesso de anticorpo (ou
falta de antígeno) é chamada de pró-
zona e proporciona resultado falso-
negativo para a pesquisa de
anticorpo, o qual é inaceitável, pois
ocorrerá justamente quando a
concentração de anticorpos for maior
que a de antígeno.
Reação de precipitação
Reação de aglutinação
ELISA
Imunofluorescência
Western Blotting
Métodos Sorológicos 
Reagentes não marcados 
Reagentes não marcados 
Os ensaios com reagentes não marcados
possuem sensibilidade de detecção
menor, pois é necessário que se forme 
 grande quantidade de imunocomplexos
para que se processe a visualização do
fenômeno.
A utilização de sistemas de marcação de
reagentes torna possível a amplificação
do sinal final e detecção através de
instrumentos , elevando a sensibilidade à
ordem de 10 ^-19/ 10^-21.
Reações de Precipitação -
IMUNOPRECIPITAÇÃO
Interações antígenos-anticorpos
 
As interações multivalentes entre Ag-Ac
são biologicamente significativas, e suas
características também podem ser
estudadas em sistemas de ensaios in vitro,
pois imunocomplexos podem ser formados
ao misturar o antígeno multivalente com
anticorpo específico.
 Os antígenos podem estar ligados aos
anticorpos formando uma extensa rede
estável, indicada como zona de
equivalência
Os complexos podem ser dissolvidos
quando a concentração de antígeno é
aumentada (região de excesso de
antígenos). Isso ocorre porque a região
de ligação do anticorpo fica livre para
se ligar ao antígeno que foi adicionado,
diminuindo assim a formação de
complexos insolúveis
A redução de imunocomplexos pode
ocorrer com o aumento da
concentração de anticorpo (região de
excesso de anticorpo), onde todo o
antígeno estará precipitado e haverá
anticorpo livre no sobrenadante
A ligação do anticorpo ao antígeno não é
covalente. 
Vários tipos de interações, como forças
eletrostáticas, pontes de hidrogênio, forças
de van der Waals e hidrofóbicas podem
contribuir para essa ligação. 
A interação Ag-Ac é reversível e segue os
princípios termodinâmicos básicos de
qualquer interação bimolecular reversível,
ou seja, segue a lei das massas de Guldberg e
Waage.
Combinação de antígenos solúvel com
anticorpo solúvel para formar complexos
insóluveis que são visíveis.
Moléculas antigênica tem que ser
multivalente ( (número de epitopo).
Permite quantificação
Visualização do precipitado em meio
líquido é difícil: soro com Ac e soluções
com Ags turva e com colorações próprias.
Automação: turbudimetria e
nefelometria. 
Técnicas manuais de precipitação em
uso: Utilizam meios gelificados (ágar ou
gel de agarose) que facilitam a leitura e
reduz volume necessário para interação. 
Requerem períodos de horas a dias para
migração molecular e formação do
imunocomplexo.
Baseia-se na difusão de substâncias
solúveis por movimentos moleculares
ao acaso em meio gelificado, como o
ágar ou gel de agarose. 
Enquanto as moléculas de anticorpos
e/ou antígenos estão livres, ocorre a
difusão no meio. 
No momento em que ocorre a interação
entre as moléculas, são formados
imunocomplexos de elevado peso
molecular que, devido ao tamanho,
ficam imobilizados no gel, o que
permite visualizar o imunocomplexo em
decorrência da formação de turvação
nítida visível a olho nu, o
imunoprecipitado.
Imunodifusão
Imunodifusão Simples : Um dos
componentes está fixado ao gel 
 enquanto o outro migra até formação
do imunocomplexo( linear ou radial ).
Imunodifusão Dupla: os dois migram
simultaneamente , um em direção ao
outro ( migração linear ou radial ).
Imunodifusão Simples Linear
O anticorpo é incorporado ao meio
gelificado e a mistura é colocada em
um tubo até atingir cerca de 40 mm
de altura. 
Após a gelificação, coloca-se o
antígeno no topo da coluna em
concentração superior à do
anticorpo.
 O tubo é selado e mantido à
temperatura constante. Após 1
semana, observa-se a formação da
linha de precipitação na área de
equivalência.
 A concentração do antígeno
adicionado é proporcional à
espessura da linha de precipitação e à
distância percorrida pelo antígeno
até formar o imunocomplexo.
Uma quantidade padronizada de
anticorpo específico é incorporada ao
meio gelificado, e a mistura, alocada
sobre uma placa ou lâmina. 
Após a gelificação, são feitos orifícios no
ágar para se colocar o antígeno em
volumes precisos e a amostra-padrão
com concentrações conhecidas do
antígeno.
 O antígeno difunde-se de acordo com
seu tamanho molecular e encontra o
anticorpo imobilizado no gel, formando
o imunocomplexo. 
À medida que aumenta a concentração
de antígeno no gel, o precipitado se
dissolve (zona de excesso de antígeno) e
o antígeno migra mais, encontrando
novas moléculas de anticorpo. Após
algumas horas de difusão, atinge-se a
zona de equivalência e forma-se um halo
bem definido de precipitado. 
O tempo para difusão depende do
coeficiente de difusão da molécula
antigênica. Moléculas maiores, como
IgM e alfa-2-macroglobulina,
necessitam de até 96 h para completar a
migração, enquanto as pequenas podem
fazê-lo em 24 h.
 Imunodifusão simples radial
 
Nesta técnica, os dois componentes,
antígeno e anticorpo, difundem-se
radialmente em todas as direções, a
partir de orifícios no meio gelificado, e
encontram-se formando linhas ou
arcos de precipitação correspondentes
aos imunocomplexos possíveis nessa
interação, ou seja, cada arco
corresponde a um par de
imunocomplexo antígeno-anticorpo. 
A técnica permite a comparação
simultânea de diferentes sistemas, por
exemplo, vários antígenos contra o
mesmo anticorpo de especificidade e
reatividade conhecidas, desde que a
interação antígeno-anticorpo tenha
atingido a zona de equivalência e esteja
presente em quantidade suficiente para
formar turvação ou precipitado visível .
Imunodifusão dupla radial