Aulão Prova 2 Microbiologia Geral

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Hereditariedade e Mutações
Importância da genética
Papel dos microrganismos em estudos genéticos
Circular
Molécula de DNA fita dupla
Replicação semiconservativa
Não apresenta membrana nuclear
Genoma haplóide
Cromossomo Bacteriano
Cromossomo Bacteriano
~ 4,6 Mb
Etapas do Fluxo da Informação Genética
DNA polimerase, Helicase, Primase, Ligase, DNA girase
RNA polimerase DNA dependente
mRNA, Ribossomos,
tRNA (anticódon)
Replicação do DNA
Organização do DNA
Replicação semiconservativa
Complementariedade de bases
DNA polimerase, DNA ligase, etc.
Nucleotídeo
Ribose	Desoxirribose
Pirimidinas
Purinas
Componentes do DNA
Replicação Semiconservativa do Cromossomo
Replicação Semiconservativa do Cromossomo
Replicação do Cromossomo Bacteriano
Código Genético
Segunda letra do códon
Primeira letra do códon (final 5’)
Organização Gênica e Fluxo da Informação Genética em Eucariotos
Transcrição
Transcrição
Tradução
Tradução
Tradução
Transcrição e Tradução em Bactérias
Genótipo
Alterações genotípicas:
Mutação
Mutação pontual
Deslocamento do quadro de leitura
Recombinação
Mutação Pontual
Missense- Errônea ou de sentido trocado
Nonsense - Sem sentido
Silenciosa
Adição e Deleção
DNA: AGA TGA CGG TTT GCA
RNA: UCU ACU GCC AAA CGU
Proteína: ser – tre – ala – lis - arg
DNA: AGT ATG ACG GTT TGC A
RNA: UCA UAC UGC CAA ACG U
Proteína: ser – tir – cis – gln – tre
DNA: AGA TGA CGG TTT GCA (original)
DNA: AGA GAC GGT TTG CA RNA: UCU CUG CCA AAC GU
Proteína: ser – leu – pro – asn
As adições e deleções de um único par de bases no DNA causará uma mudança no quadro aberto de leitura do gene a partir desse ponto. Assim toda a sequência de aminoácidos traduzida a partir do sítio mutante é alterada, não tendo relação com a sequência original
Mutação silenciosa: a substituição de bases não altera a seqüência de aminoácidos na cadeia polipeptídica
Ex:
Substituição de base
DNA: AGC → AGG RNA: UCG → UCC
Prot.: Serina – Serina
Mutação de sentido errado: a substituição altera um aminoácido na cadeia polipeptídica
Ex:
DNA: AGC → AAC RNA: UCG → UUG
Prot.: Serina – Leucina
Mutação sem sentido: causa o aparecimento de um códon de terminação no mRNA, impedindo a síntese completa da cadeia polipeptídica
Ex:
DNA: AGC → ATC RNA: UCG → UAG
Prot.: Serina – Códon de terminação
Alterações Fenotípicas
Causada por modificações nas condições ambientais; são alterações reversíveis do fenótipo
Ex: Produção de -galactosidase por
E. coli na presença de lactose
Ex: Produção de pigmentos em
Serratia marcescens
Serratia marcescens
37ºC
28ºC
Agentes Mutagênicos
Agentes físicos
Luz ultravioleta
Radiação ionizante (ex: raios X)
Agentes químicos Análogos de bases
Agentes químicos que reagem com o DNA
Agentes biológicos Elementos transponíveis
Efeito da
Luz Ultravioleta e Mecanismo de Reparação
Ácido Nitroso (HNO2)
Reage com o DNA causando desaminação de adenina e citosina. Causa substituição (transição) de ATGC e GCAT
Análogos de Bases
Elementos Transponíveis
Elementos transponíveis: Elemento genético que tem a capacidade de se mover (transposição) de um local para outro no genoma.
Tipos de elementos transponíveis:
Sequências de inserção
Transposons (Genes de resistência)
Repetições Terminais
Duplicação do sitio-alvo
Gene que codifica a enzima responsável pela transposição
Exemplos de Mutantes
Mutantes resistentes a antibióticos
Mutantes auxotróficos
Mutantes morfológicos
Mutantes resistentes a bacteriófagos
Seleção de Mutantes
Seleção positiva (direta)
Ex: Resistência a antibióticos
Selação negativa (indireta)
Ex: Mutações auxotróficas
Análise de Mutantes Auxotróficos
(Plaquemento de réplica)
Teste de Ames
Plasmídeos
Plasmídeos Conjugativos
Plasmídeos de Dissimilação - Os plasmídeos de dissimilação codificam enzimas que ativam o catabolismo de certos açúcares e hidrocarbonetos incomuns.
Ex: Espécies de Pseudomonas - Utilização de hidrocarbonetos do petróleo
Plasmídeo de Patogenicidade
Fatores R - Genes que conferem resistência a múltiplos antibióticos
Transferência de DNA em bactérias
Transferência vertical
Transferência horizontal
Recombinação em Bactérias
Transformação
Griffith (1928)
Colônia lisa (S)	- cápsula - virulenta
Colônia rugosa (R) - s/ cápsula - não virulenta
Avery, MacLeod & MacCarty (1944) Princípio transformador - DNA
Experimento de Avery, MacLeod e MacCarty (1944)
Competência
Final da fase logarítmica
Fatores de competência - Proteínas específicas
Etapas da transformação
Competência
Presença de DNA livre no meio
Ligação do DNA à célula receptora
Entrada do DNA
Integração e replicação do DNA
Mecanismos de transferência de DNA
Conjugação
Lederberg & Tatum (1948)
É necessário o contato entre as células
Depende da presença do fator de fertilidade
Experimento de Lederberg e Tatum
Experimento de Davis
Conjugação
Características do Fator F
Molécula de DNA circular
Contém cerca de 40 genes
Responsável pela formação do pilus
Replicação autônoma ou integração no
cromossomo - Epissoma
Fator F
Possibilidades de Transferência de DNA por Conjugação
x
F+	F-
=	F+	+
F+
Hfr	x
F-
F’	x
F-
=	Hfr	+	F- recombinante
=	F’	+	F’’
Conjugação
X
Recombinação
Formação de uma célula Hfr
Cromossomo
Fator F integrado ao cromossomo
Fator F
IS
Conjugação
Formação de uma célula F’
Cromossomo de E. coli	Cromossomo de E. coli
Fator F carregando genes cromossômicos
Deleção no cromossomo
Transferência de F’
Etapas da Conjugação
Formação de pares específicos
Conexão celular
Mobilização do fator F
Transferência do fator F
Replicação
Transdução
Bacteriófago
Ciclo lítico e ciclo lisogênico
Ciclo lítico - adsorção, penetração, replicação,
montagem e liberação
Ciclo lisogênico - adsorção, penetração,
integração e replicação
Fagos virulentos e temperados
Mecanismos de transferência de DNA
Ciclo Lítico
Figure 13.10.1
Ciclo Lítico
Consequências da Lisogenia
Células lisogênicas são imunes à reinfecção pelo
mesmo fago
As células receptoras podem exibir novas propriedades (conversão)
Ex: Corynebacterium diphtheriae – Gene que codifica
para a toxina está localizado em um profago
Torna possível a transdução especializada
Tipos de Transdução
Generalizada - Qualquer fragmento do cromossomo da bactéria pode ser transferido
Especializada - Transferência de genes adjacentes ao profago
Transdução Generalizada
Transdução especializada
Alguns exemplos que mostram a importância dos mecanismos de transferência de DNA em bactérias
Transferência de genes entre bactérias originando cepas resistentes a diferentes antimicrobianos.
Introdução de genes modificados em bactérias e produção de compostos de interesse médico e de interesse industrial.
	Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA Recombinante (1973)
Micro-organismos importantes ferramentas
Vantagens da utilização de micro-organismos
Fácil cultivo – Baixo custo
Obtenção de um grande número de células em um curto período de tempo
Produção de compostos por tempo indefinido
Cristais de insulina produzidos pela E. coli
E. coli produtora de insulina
E. coli geneticamente modificada
2. Vetor
1. Gene de
interesse
3. Hospedeiro
Visão Geral da Engenharia Genética
Características do hospedeiro ideal
	Aceitar o DNA exógeno sem provocar modificação no gene
	Permitir a seleção das células que apresentarem o DNA exógeno
	Baixo potencial de proliferação no meio ambiente
Exemplos do micro-organismos hospedeiros
Fonte: Paulo Donato Castellane
Leveduras: S. cerevisiae
Bactérias: E. coli
Características do vetor ideal
Apresentar propriedades que facilitem sua ligação ao	DNA que vai ser clonado
Duplicar o DNA exógeno
Apresentar marcadores para a seleção
Vetor de clonagem ideal
Plasmídeo Vetor de clonagem
Região em que o DNA Exógeno será inseridoPurificação
do DNA
1. Isolamento do DNA doador
Célula intacta
DNA
Lise celular
Liberação do DNA
Produz várias cópias do gene de interesse
Isolamento do gene de interesse
PCR:	Reação em cadeia da polimerase 	Replicação in vitro
Fita molde - DNA ou cDNA
dNTPS (A, G, T, C)
DNA-polimerase (Taq pol)
- Primers - que flanqueiam a sequência do gene de interesse
2. Reação de PCR
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
30-40 ciclos em 3 passos:
Passo 1: Desnaturação
Passo 2:
Anelamento
Passo 3: Extensão
Cromossomo
Plasmídeo
Lise celular
Liberação do DNA plasmidial e cromossômico
Cloreto de césio e brometo de etídeo
DNA cromossomal DNA plasmidial
Centrifugação em gradiente de CsCl
3. Isolamento do DNA plasmidial
4. Enzimas de restrição
Presentes em quase todos os micro-organismos
Reconhecem e clivam sítios específicos na sequência do DNA (4-6 pares de bases)
Produção de terminais cegos ou coesivos
Terminais cegos
Terminais coesivos
Aula 8: Micro-organismos e Engenharia Genética
Ação das enzimas de restrição
Exemplos kits de biologia molecular
Kit de extração de DNA genômico
Kit de extração de DNA plasmidial
Kit de clonagem de DNA
Transformação
Método utilizado para inserir os plasmídeos nas células hospedeiras
Transformação com cloreto de cálcio e choque térmico
Transformação por eletroporação
Transformação com CaCl2 e Choque Térmico
Preparo de células competentes
Transformação de E. coli
Íons de CaCl2 neutralizam cargas negativas da membrana e do DNA plasmidial
Transformação por Eletroporação
Preparo de células competentes
Identificação das bactérias recombinantes
Uso de plasmídeos com genes que conferem resistência a antibióticos
Uso de plasmídeos com genes que permitam a detecção de	bactérias recombinantes
Hibridização de colônias para identificar bactérias recombinantes
Plasmídeo
recombinante
1)	Mistura de E. coli com os
plasmídeos
Aplicado estímulo
Cultivo em ágar nutriente
contendo AMPICILINA
Cromossomo de
E. coli
Plasmideo
recombinante
Plaqueamento dos
transformantes
Células transformadas sobrevivem em
placa com ampicilina
Células que NÃO receberem o plasmídeo morrerão em placa com ampicilina
Detecção da bactéria recombinante
Seleção branca-azul
Seleção branca-azul
DNA de interesse inserido no meio do gene lacZ
Apresentam dois marcadores de seleção
Colônias branca - azul
Todas as colônias contêm o
plasmídeo
Colônias azuis  plasmídeo
Colônias brancas  plasmídeo recombinantes
Membrana
sonda de DNA
Hibridação de colônias
Emprego de sonda de DNA para identificar colônias contendo o gene de interesse
As sondas de DNA são complementares ao gene desejado
Tais sondas são marcadas por radioatividade ou fluorescência
marcação
DNA de interesse
Hibridação de colônias
Presença de íntrons
A bactéria não reconhece as sequências reguladoras de eucariotos
Formação de agregados protéicos insolúveis
Problemas com a clonagem de genes eucarióticos em bactérias	de colônias
Síntese em excesso da proteína
Destruição da nova proteína
Dificuldades na extração e purificação da nova proteína
Problemas com a clonagem de genes eucarióticos em bactérias	de colônias
Rafael R. de Rezende
97
Oparin e Haldane, 1920.
Miller e Urey, 1953. 
A principal diferença entre a atmosfera primitiva e a atmosfera atual é fato de a primeira não possuir Oxigênio (O2).
Atmosfera primitiva:
Amônia
Hidrogênio
Metano
Vapor de água
Atmosfera atual:
Nitrogênio
Oxigênio
Gás carbônico
Vapor de água
outros gases
Rafael R. de Rezende
102
Rafael R. de Rezende
104
Hipóteses:
Heterotrófica 									Autotrófica
A hipótese autotrófica diz que os primeiros seres vivos produziam seu próprio alimento assim como as plantas atuais. 
A hipótese heterotrófica é a linha de pensamento mais aceita para explicar a origem da vida. Conta que os organismos se desenvolveram a partir de substâncias inorgânicas.
pode	ser	empregada	como	medida	comparativa	da
divergência evolutiva.
Taxonomia	–	Ciência	da	identificação,	classificação	e nomenclatura.
•
Taxon (plural - Taxa) – Grupo taxonômico onde são agrupados organismos que compartilham características comuns.
Conceitos Básicos
Filogenia – História evolutiva dos organismos.
Cronômetro	evolutivo	–	Molécula	cuja	sequência
Principais sistemas de classificação dos organismos vivos
	Esquemas de classificação	Reinos/ Domínios	Organismos incluídos no esquema de classificação
	Carolus
Linnaeus (1753)	Plantas Animais	Bactérias, fungos, algas e plantas Protozoários e animais superiores
	Ernest Haeckel (1865)	Plantas Animais Protistas	Algas multicelulares e plantas Animais
Bactérias, protozoários, algas, fungos e leveduras
	Robert Whittaker (1969)	Plantas Animais Fungos Protistas Monera	Algas multicelulares e plantas Animais
Fungos filamentosos e leveduras
Protozoários e algas unicelulares Todas as bactérias (procariotos)
	Carl Woese (1977)	Archaea
Bacteria Eukarya	Procariotos metanogênicos, halofílicos e termoacidófilos
Bactérias patogênicas, do solo, da água, fotossintetizantes, etc.
Protozoários, algas, fungos, plantas e animais
Aula 10: Filogenia e Taxonomia de Micro-
organismos
Sistema de Carl Woese – Três domínios
LUCA
Primeiras	tentativas	utilizaram	sequências	de
proteínas (1965 – 1977):
Sequenciamento de proteínas foi desenvolvido antes do sequenciamento de DNA.
Algumas proteínas podem ser facilmente isoladas.
Mudanças	na	sequência	de	proteínas	geralmente
refletem mudanças na sequência de DNA.
Proteínas	utilizadas:	citocromos	e	proteínas	de	ferro- enxofre
Filogenia Molecular
genoma	de	organelas	(mitocôndrias	e
cloroplastos).
Possuir	a	mesma	função	em	todas	as células.
Conter	regiões	com	taxas	de	evolução distintas.
Possuir tamanho adequado para estudos comparativos e análise estatística.
Ribossomo 70S
21 Proteínas
rRNA 16S (~ 1500 pb)
rRNA 23S
rRNA 5S
34 Proteínas
30S
50S
corresponde ao rRNA 18S (eucariotos)
Filogenia Molecular
Cronômetro evolutivo - preferência pela utilização do SSU rRNA (small subunit RNA ribossomal) como ferramenta para estudos de filogenia molecular devido ao fato de:
1. Ser encontrado em todas as células e no
Aula 10: Filogenia e Taxonomia de Micro-
organismos
Árvore filogenética – Três domínios
Aula 10: Filogenia e Taxonomia de Micro-
organismos
Características que diferenciam os três domínios
Taxonomia de Microrganismos
Nomenclatura científica
específico
Sistema	binomial:	Gênero	+	epíteto (espécie)
Ex: Escherichia coli; Streptococcus pyogenes; Lactobacillus brevis; L. acidophillus;
Bacillus sp.; Bacillus spp.
Conceito de espécie em procariotos
Similaridade da sequência de rRNA  97%
Taxa de hibridização do DNA	 70%
Taxonomia de Microrganismos
Manuais de Classificação
Ex: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology
Hierarquia taxonômica
Espécie – Gênero – Família – Ordem – Classe – Divisão (ou Filo) – Reino – Domínio
Ex: Escherichia coli – Escherichia – Enterobacteriacea – Enterobacteriales – Gammaproteobacteria – Proteobacteria – Bacteria
Taxonomia de Microrganismos
	Domínio	Archaea	Bacteria	Eukarya
	Reino	-	-	Fungi
	Filo	Crenarchaeota	Proteobacteria	Ascomycota
	Classe	Thermoprotei	α-proteobacteria	Saccharomycetes
	Ordem	Sulfolobales	Legionellales	Saccharomycetales
	Família	Sulfolobaceae	Legionellaceae	Saccharomycetaceae
	Gênero	Sulfolobus	Legionella	Saccharomyces
	Espécie	Sulfolobus acidocaldarius	Legionella pneumophila	Saccharomyces cerevisiae
Métodos para Classificação e Identificação de Microrganismos
Taxonomia Clássica - Características Fenotípicas Características morfológicas (estruturais)
(Identificação)
Forma, arranjo, presença deflagelos, endosporos, etc.
Coloração diferencial (Classificação e Identificação)
Bactérias Gram positivas x Gram negativas
Bactérias álcool-ácido resistentes
Características metabólicas
(Identificação)
(1) Taxonomia Clássica
Características metabólicas
(Identificação)
(1) Taxonomia Clássica
Kits miniaturizados de identficação: Enterotube, API, etc.
Teste de aglutinação em lâmina
Características antigênicas
(Classificação e Identificação)
Teste positivo	Teste negativo
Técnica de Western blot:
Separação de proteínas por eletroforese
Detecção com o uso de anticorpos
(1) Taxonomia Clássica
Baseada no perfil de susceptibilidade a diversos bacteriófagos
(Placas de lise são regiões de lise de células decorrente da infecção pelo bacteriófagos)
(1) Taxonomia Clássica
Fagotipagem
(Identificação)
(2) Taxonomia Molecular
Sequenciamento de Aminoácidos
(Classificação)
Aminoácidos conservados
Comparação do padrão de picos com os padrões de um banco de dados
Cromatografia Gasosa
Extração de ácidos graxos
Identificação do microrganismo
Picos de vários ácidos
(2) Taxonomia Molecular
Quantidade
gPircaoxsosd (mveátriloéssátceirdso) s
raxos (met	é t	rs
Perfil de Ácidos Graxos
(Identificação)
Cultura Bacteriana
Clivagem com enzima de
restrição
Extração
do DNA
Célula
(2) Taxonomia Molecular
Métodos baseados em características genotípicas
Fingerprinting de DNA
(Identificação)
(2) Taxonomia Molecular
Aplicação	de
Fingerprinting de DNA
(Identificação)
P1	P2
P3	A	B
P1 – Salmonella P2 – Citrobacter P3 – Escherichia
A – amostra 1 - Escherichia
B – amostra 2 - Salmonella
PCR e Sequenciamento do RNA Ribossomal
(Classificação e Identificação)
Organismo
rRNA 16S
+
Separação das fitas de DNA e adição de primers
Extensão dos primers
com DNA polimerase
Repetição dos ciclos de amplificação - Obtenção de cópias múltiplas de rRNA 16S
Sequenciamento do DNA amplificado
(2) Taxonomia Molecular
Extração do DNA
AMPLIFICAÇÃO
PCR e
Sequenciamento do
RNA Ribossomal
(Classificação)
A B C D E F G
G
F
E
C
D
B
A
A B C D E F G
								
								
								
								
								
								
(2) Taxonomia Molecular
Comparação das sequências
Sequenciamento do DNA
Construção de cladogramas baseada em % de similaridade
Hibridização de Ácidos Nucleicos
(Classificação)
(2) Taxonomia Molecular
Utilização de Sondas de DNA
(2) Taxonomia Molecular
Hibridização de Ácidos
Nucleicos
(Identificação)
Chaves Dicotômicas	X 	Cladogramas
Identificação
Análise Filogenética
Integração dos Métodos de Classificação Baseados em Características Fenotípicas e Genotípicas:
Taxonomia Polifásica