Clonagem Molecular

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Tecnologia do DNA recombinante
Prof. Dr. João Batista 
Centro Universitário Christus - Unichristus
Curso de Biomedicina
Disciplina: Biologia Molecular
Expressões utilizadas com o mesmo significado: 
clonagem molecular 
engenharia genética 
manipulação génica 
clonagem génica tecnologia do DNA recombinante 
modificação genética
Clonagem molecular
É o processo de construção de moléculas de DNA recombinante e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a seleção do DNA recombinante. 
Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter organismos transgénicos e realizar terapia génica.
Clonagem molecular
O principal resultado das aplicações do DNA recombinante é o isolamento e a propagação, em um organismo de moléculas idênticas de DNA. 
Essas abordagens envolvem:
Ligação
Fragmento ou Inserto de DNA
Clonagem molecular
Molécula de DNA Recombinante
Formada pela ligação de um inserto de DNA ao vetor.
Vetor ou Veículo de Clonagem
Transporta o inserto de DNA para o interior 
Clonagem molecular
Introdução da molécula de DNA recombinante
Transformação
Clonagem molecular
A célula hospedeira, divide-se várias vezes, formando uma colônia de células.
Cada célula da colônia possui pelo menos, uma copia da molécula recombinante.
Transformantes/
Células Transformadas
“Gene Marcador”
Vetores de Clonagem de DNA
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Vetores de Clonagem de DNA
Uma molécula de DNA necessita de várias características para atuar como um vetor:
Capacidade de replicar dentro da célula hospedeira
“Replicação Autônoma”
Inserção sítio-especifica
Sítio único de clonagem
“Sítio de restrição que não se repete na molécula”
Relativamente pequeno (< 10kb)
“Moléculas maiores tendem a quebrar”
DNAs de Fagos
Plasmídeos
Vetores de Clonagem de DNA
Plasmídeos
Primeiros vetores desenvolvidos
Derivados de plasmídeos que ocorrem naturalmente em bactérias e alguns organismos eucarióticos.
Moléculas de DNA circular, de fita dupla, extracromossômicas e que possuem capacidade de replicação autônoma.
Plasmídeos de Clonagem
Ampla variedade de características
Apenas uma cópia entra na célula
Marcadores Genéticos Auxotróficos
“Resistência aos Antibióticos”
Vetores de Clonagem de DNA
Plasmídeos
PUC 18
“Mais utilizados”
Resistência a ampicilina
Gene Lac-Z
Origem de replicação do DNA
“Subunidade α da β-galactosidase”
“Colônias azuis”
As bactérias contendo o plasmídeos recombinantes são selecionados pela cor branca.
O inserto causa interrupção do gene Lac-Z
Vetores de Clonagem de DNA
Plasmídeos
O bacteriófago λ como vetor de clonagem
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Vetores de Clonagem de DNA
DNAs de Fagos
Os fagos pertencem à categoria dos elementos genéticos móveis
Bacteriófago λ é um dos fagos mais usados como vetor em clonagem molecular
Segmentos de DNA são inseridos no genoma viral, sendo introduzidos dentro de uma célula hospedeira, como uma partícula viral.
“Transfecção”
DNAs de Fagos
Vetores de Clonagem de DNA
Empacotamento do DNA
“Longas moléculas lineares de DNA”
(substrato)
“Cocatâmeros”
Genomas virais unidos
Genomas virais unidos
Separados pela clivagem de
 sequências específicas
Sequência COS
(coesivas)
Vetores de Clonagem de DNA
DNAs de Fagos
Sequência COS
(coesivas)
Distância necessária para formar uma partícula infectante. 
Sequências de 12 pb
Devem ser repetidas (35-50kb)
Stuffer
Não é necessária para infecção/replicação 
Substituído pelo DNA exógeno
O DNA remanescente compreende a 60% do genoma viral
Vetores de Clonagem de DNA
DNAs de Fagos
λEMBL4
Cosmídeos
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Cosmídeos
I) Uma origem de replicação
São plasmídeos bacterianos que possuem:
II) Resistência ao antibiótico
III) Um ou mais sitio de clonagem
IV) Sequencias COS do Bacteriófago λ 
Excelentes vetores para a clonagem de fragmentos grandes de DNA
Podem ser empacotados no bacteriófago
Número de cópias por células hospedeiras é menor
Ocorrência de rearranjos por recombinação de insertos
Introdução de moléculas de DNA em células bacterianas
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Transformação
Introdução de moléculas de DNA em células bacterianas
Mandel e Higa (1970)
Soluções geladas de 
cloreto de cálcio
Permeabilização da membrana
Plasmídeo
Eletroporação
Método alternativo
Procariotos
Eucariotos
Células submetidas a um campo elétrico
Abertura de pequenos poros
Introdução de moléculas de DNA em células bacterianas
Transdução
DNAs de fagos derivados do Bacteriófago λ 
Ligam-se a receptores proteicos 
Membrana externa da bactéria
(lamB)
Maltose dependentes
Temperatura de 37ºC
Ciclo lítico
Adsorção de partículas virais
Introdução de moléculas de DNA em células bacterianas
Transdução
O DNA de
um fago penetra
na célula de
uma bactéria.
O DNA do fago 
integra-se ao DNA
da bactéria como
um profago.
Quando o profago inicia o ciclo
lítico, o DNA da bactéria é
degradado e novos fagos podem
conter algum trecho do DNA
da bactéria.
A célula
bacteriana se
rompe e libera muitos fagos, que
podem infectar outras células.
O fago infecta
nova bactéria.
Genes de outra bactéria
são introduzidos e 
integrados ao DNA
da bactéria hospedeira.
DNA do fago
com genes da
bactéria
Produtos da engenharia genética de microrganismos
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Produtos da engenharia genética de microrganismos
Transformação dos microrganismos em pequenas fábricas para a produção
de produtos valiosos como combustíveis, substâncias químicas,
fármacos e hormônios humanos como a insulina.
Biotecnologia: 
produção de proteínas humanas 
uso de organismos geneticamente modificados na agricultura
A engenharia genética tem sido utilizada para transformar microrganismos em pequenas fábricas para a produção de produtos valiosos como combustíveis, substâncias químicas, fármacos e hormônios humanos como a insulina. Até este ponto, discutimos as técnicas utilizadas para manipular, clonar
e expressar o DNA. Agora discutiremos como estas técnicas podem ser diretamente aplicadas para a biotecnologia, incluindo alguns dos principais desafios que existem com a expressão de genes eucariotos em bactérias e a subsequente purificação dos produtos proteicos. Também abordaremos a alteração genética de organismos superiores e suas aplicações na agricultura e medicina.
Atualmente, as áreas da biotecnologia mais robustas economicamente são a produção de proteínas humanas e o uso de organismos geneticamente modificados na agricultura. Muitas proteínas de mamíferos apresentam alto valor farmacêutico, mas geralmente são encontradas em quantidades muito pequenas no tecido normal, tornando sua purificação extremamente dispendiosa. Mesmo que a proteína possa ser produzida em cultura de células, isso é muito mais dispendioso 
e difícil que em culturas microbianas, que a produz em altas quantidades. Por essa razão, a indústria biotecnológica dispõe de microrganismos geneticamente modificados para a produção de muitas proteínas diferentes de mamíferos. 
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Produtos da engenharia genética de microrganismos
Somatotrofina: 
polipeptídeo codificado por um único gene
Nanismo hereditário: 
Ausência do hormônio
somatotrofina humana recombinante (HSTr)
Ausência do receptor de somatotrofina
O hormônio de crescimento, ou somatotrofina, consiste em um polipeptídeo codificado por um único gene. A ausência de somatotrofina resulta em nanismo hereditário. Pelo fato de o gene da somatotrofina humana ter sido clonado e expresso com sucesso em bactérias, crianças apresentando crescimento retardado podem ser tratadas com a somatotrofina humana recombinante (HSTr). Contudo, o nanismo pode também ser causado pela ausência do receptor de somatotrofina. Nesse caso, a administração de somatotrofina não exibe qualquer efeito. (Indivíduos das tribos de pigmeus africanos apresentam concentrações normais de somatotrofina humana, porém raramente apresentam estatura maior que 1,47 metro, porque são deficientes nos receptores do hormônio de crescimento.)
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Produtos da engenharia genética de microrganismos
O gene de somatotrofina foi clonado na forma DNAc, a partir do RNAm, conforme descrito na Seção 11.11 (Figura 11.26). O DNAcfoi então expresso em um vetor de expressão bacteriano. O principal problema na produção de hormônios polipeptídicos relativamente curtos, como a somatotrofina, refere-se a sua suscetibilidade à digestão por proteases. Tal problema pode ser solucionado pelo uso de linhagens bacterianas deficientes em várias proteases.
A somatotrofina bovina recombinante (rBST) é utilizada na indústria de laticínios (Figura 11.26). A injeção de rBST em vacas não resulta em um maior crescimento; e, em vez disso, estimula a produção de leite. Isso ocorre porque a somatotrofina possui dois sítios de ligação. Um deles liga-se ao receptor de somatotrofina e estimula o crescimento, o outro liga-se ao receptor de prolactina e promove a produção de leite. A produção excessiva de leite pelas vacas provoca alguns problemas
de saúde nos animais, incluindo uma maior frequência de infecções do úbere e a diminuição da capacidade reprodutiva. Quando a somatotrofina é utilizada no tratamento de distúrbios no crescimento humano, é desejável evitarem-se os efeitos colaterais da atividade prolactina (a prolactina estimula
a lactação) decorrentes do hormônio. A mutagênese sítio-dirigida (Seção 11.5) do gene de somatotrofina foi utilizada para modificá-la geneticamente, impedindo sua ligação ao ceptor de prolactina. Para realizar-se isso, vários aminoácidos necessários à ligação ao receptor da prolactina foram alterados por mutação da sequência codificadora. Assim, é possível não apenas produzir hormônios humanos genuínos, mas também alterar suas especificidade e atividade, a fim de torná-los produtos
farmacêuticos melhores. 
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Produtos da engenharia genética de microrganismos
Organismos transgênicos na agricultura e na aquacultura
Resistência a insetos: toxina Bt
Introdução de genes que codificam a proteína tóxica de Bacillus thuringiensis em plantas
Proteína cristalina (tóxica): larvas de borboletas, besouros, moscas, mosquitos e mariposas
A resistência a insetos foi também introduzida geneticamente em plantas (Figura 11.30). Uma abordagem amplamente utilizada baseia-se na introdução de genes que codificam a proteína tóxica de Bacillus thuringiensis em plantas. B. thuringiensis produz uma proteína cristalina, denominada toxina Bt ( Seção 15.8), que é tóxica para larvas de borboletas e mariposas. Existem muitos variantes da toxina Bt, específicos para diferentes insetos. Algumas linhagens de B. thuringiensis produzem
proteínas adicionais, as quais são tóxicas para larvas de besouro e moscas e para mosquitos.
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Produtos da engenharia genética de microrganismos
Organismos transgênicos na agricultura e na aquacultura
Resistência a insetos: toxina Bt
Transferência diretamente para o genoma da planta
Gene natural da toxina Bt 
Vetor plasmidial 
Cloroplastos de tabaco 
BOMBARDEAMENTO DE MICROPROJÉTEIS 
Plantas transgênicas
Níveis extremamente tóxicos às larvas de várias espécies de insetos
Várias abordagens diferentes foram utilizadas para aumentar a eficácia da toxina Bt no controle de pragas em plantas. Uma abordagem foi o desenvolvimento de um conjunto único de toxinas Bt, eficaz contra vários insetos diferentes. Uma abordagem efetiva para a obtenção da expressão e estabilidade do transgene Bt foi sua transferência diretamente para o genoma da planta. Por exemplo, um gene natural da toxina Bt foi clonado em um vetor plasmidial sob o controle do promotor de RNAr de cloroplasto, o qual foi transferido para cloroplastos de tabaco por bombardeamento de microprojéteis (Figura 11.28). Empregando-se tal metodologia,
foram obtidas plantas transgênicas que expressavam essa proteína em níveis extremamente tóxicos às larvas de várias espécies de insetos.
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Produtos da engenharia genética de microrganismos
Organismos transgênicos na agricultura e na aquacultura
Peixes transgênicos
Salmão transgênico: modificado para um crescimento rápido 
Introdução de genes clonados em ovos
 fertilizados por microinjeção
Muitos genes exógenos já foram incorporados e expressos em animais de laboratório de pesquisa e também em animais com importância comercial. A engenharia genética utiliza técnicas como a microinjeção para introduzir genes clonados em ovos fertilizados; em seguida, por recombinação genética, o DNA exógeno é incorporado ao genoma dos ovos. Mais recentemente, animais domésticos, incluindo os peixes, foram geneticamente modificados para melhorar o rendimento.
Um exemplo prático da transgenia animal muito interessante é o salmão transgênico, modificado para um crescimento rápido (do inglês, fast-growing salmon) (Figura 11.31). Esse salmão transgênico não ficará maior do que os animais comuns, mas atinge o tamanho de mercado muito mais rápido. O gene do hormônio de crescimento no salmão selvagem é ativado pela luz. Consequentemente, o salmão tem um crescimento acelerado somente durante os meses do verão. Nos salmões geneticamente modificados, o promotor do gene do hormônio de crescimento foi substituído pelo de outra espécie desse peixe que cresce a uma taxa mais ou menos constante durante todo o ano. O resultado é um salmão com o crescimento constante e, consequentemente, mais rápido. Esses salmões podem ter um maior rendimento comercial em operações de aquacultura e atingem o tamanho de venda muito mais rápido que os salmões que não são OGM quando criados em cativeiro. 
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Produtos da engenharia genética de microrganismos
Vacinas produzidas por engenharia genética
Vacinas recombinantes
Normalmente: 
suspensões de microrganismos patogênicos 
vírus mortos ou modificados (ou de componentes específicos isolados deles)
Deletar genes do patógeno que codificam fatores de virulência, mantendo aqueles cujos produtos induzem uma resposta imune
adicionar genes de um vírus patogênico em outro vírus relativamente inofensivo, denominado vírus carreador
vacina recombinante atenuada viva
vacinas de vetores
Técnicas de DNA recombinante podem ser utilizadas para modificar o próprio patógeno. Por exemplo, pode-se deletar genes do patógeno que codificam fatores de virulência, mantendo aqueles cujos produtos induzem uma resposta imune. Isso gera uma vacina recombinante atenuada viva. Por outro lado, podem-se adicionar genes de um vírus patogênico em outro vírus relativamente inofensivo, denominado vírus carreador. Tais vacinas são denominadas vacinas de vetores e induzem imunidade à doença causada pelo vírus patogênico. De fato, pode-se até mesmo associar as duas abordagens. 
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Produtos da engenharia genética de microrganismos
Vacinas recombinantes
Vírus vaccínia: 
Deletar genes do patógeno que codificam fatores de virulência, mantendo aqueles cujos produtos induzem uma resposta imune
não é patogênico
utilizado há mais de 100 anos (varíola)
clonagem de genes no vírus vaccínia requer um marcador seletivo (gene da timidina-cinase)
Vírus vaccínia
converte o análogo de base 5-bromodesoxiuridina em um nucleotídeo que é incorporado no DNA
Reação letal
O vírus vaccínia é amplamente utilizado na preparação de vacinas recombinantes vivas de uso humano ( Seção 9.6). O vírus vaccínia geralmente não é patogênico para seres humanos, e tem sido utilizado há mais de 100 anos como uma vacina contra o vírus da varíola relacionado. Entretanto, a clonagem de genes no vírus vaccínia requer um marcador seletivo. Ele é o gene da timidina-cinase. O vírus vaccínia, contrariamente a vários outros vírus, possui sua própria timidina-cinase, uma enzima que converte o análogo de base 5-bromodesoxiuridina em um nucleotídeo que é incorporado no DNA. Entretanto, essa é uma reação letal. Portanto, células que expressam timidina- -cinase (seja a partir do genoma da célula hospedeira, seja de um genoma viral) são mortas pelo 5-bromodesoxiuridina. Genes a serem inseridos no vírus vaccínia são inicialmente clonados em um plasmídeo de Escherichia coli que contém um fragmento do gene da timidina-cinase (tdk) do vírus vaccínia (Figura 11.32). O DNA exógeno é inserido no gene tdk, o qual se torna, portanto, inativo. Esse plasmídeo recombinante é então transformado em células animaiscujo gene de timidina-cinase encontra-se inativado. As mesmas células são também infectadas com o vírus vaccínia selvagem. Ocorre a recombinação homóloga entre as duas versões do gene tdk – uma do plasmídeo e outra do vírus. Portanto, alguns vírus adquirem um gene tdk inativo, contendo o inserto exógeno (Figura 11.32). As células infectadas pelo vírus selvagem, contendo a timidina-cinase ativa, são mortas pela 5-bromodesoxiuridina. As células infectadas pelo vírus vaccínia recombinante, contendo o gene tdk inativo, crescem o suficiente para originar uma nova geração de partículas virais (Figura 11.32). Como resultado, os vírus cujo gene tdk contém um inserto de DNA exógeno clonado são selecionados. O vírus vaccínia, na realidade, não requer a timidina-cinase para a sua sobrevivência. Consequentemente, os vírus vaccínia recombinantes podem, ainda, infectar células humanas e expressar os genes exógenos que carreiam. De fato, podem ser
construídos de modo a carrearem genes de múltiplos vírus (ou seja, correspondem a vacinas polivalentes). Atualmente, várias vacinas de vetor de vaccínia foram desenvolvidas e licenciadas para o uso veterinário, incluindo uma contra a raiva. Muitas outras vacinas de vaccínia encontram-se em fase de testes clínicos.
As vacinas de vaccínia são relativamente benignas, altamente imunogênicas em seres humanos e, provavelmente, apresentarão uso crescente nos próximos anos.
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Produtos da engenharia genética de microrganismos
Vacinas recombinantes
O vírus vaccínia é amplamente utilizado na preparação de vacinas recombinantes vivas de uso humano ( Seção 9.6). O vírus vaccínia geralmente não é patogênico para seres humanos, e tem sido utilizado há mais de 100 anos como uma vacina contra o vírus da varíola relacionado. Entretanto, a clonagem de genes no vírus vaccínia requer um marcador seletivo. Ele é o gene da timidina-cinase. O vírus vaccínia, contrariamente a vários outros vírus, possui sua própria timidina-cinase, uma enzima que converte o análogo de base 5-bromodesoxiuridina em um nucleotídeo que é incorporado no DNA. Entretanto, essa é uma reação letal. Portanto, células que expressam timidina- -cinase (seja a partir do genoma da célula hospedeira, seja de um genoma viral) são mortas pelo 5-bromodesoxiuridina. Genes a serem inseridos no vírus vaccínia são inicialmente clonados em um plasmídeo de Escherichia coli que contém um fragmento do gene da timidina-cinase (tdk) do vírus vaccínia (Figura 11.32). O DNA exógeno é inserido no gene tdk, o qual se torna, portanto, inativo. Esse plasmídeo recombinante é então transformado em células animais cujo gene de timidina-cinase encontra-se inativado. As mesmas células são também infectadas com o vírus vaccínia selvagem. Ocorre a recombinação homóloga entre as duas versões do gene tdk – uma do plasmídeo e outra do vírus. Portanto, alguns vírus adquirem um gene tdk inativo, contendo o inserto exógeno (Figura 11.32). As células infectadas pelo vírus selvagem, contendo a timidina-cinase ativa, são mortas pela 5-bromodesoxiuridina. As células infectadas pelo vírus vaccínia recombinante, contendo o gene tdk inativo, crescem o suficiente para originar uma nova geração de partículas virais (Figura 11.32). Como resultado, os vírus cujo gene tdk contém um inserto de DNA exógeno clonado são selecionados. O vírus vaccínia, na realidade, não requer a timidina-cinase para a sua sobrevivência. Consequentemente, os vírus vaccínia recombinantes podem, ainda, infectar células humanas e expressar os genes exógenos que carreiam. De fato, podem ser
construídos de modo a carrearem genes de múltiplos vírus (ou seja, correspondem a vacinas polivalentes). Atualmente, várias vacinas de vetor de vaccínia foram desenvolvidas e licenciadas para o uso veterinário, incluindo uma contra a raiva. Muitas outras vacinas de vaccínia encontram-se em fase de testes clínicos.
As vacinas de vaccínia são relativamente benignas, altamente imunogênicas em seres humanos e, provavelmente, apresentarão uso crescente nos próximos anos.
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OBRIGADO!!!