Gêmeos para estudos epigenéticos do envelhecimento e desenvolvimento humano

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Gêmeos para estudos epigenéticos do envelhecimento e desenvolvimento humano
Resumo
A maioria das características complexas, incluindo fenótipos envelhecidos, é causada pela interação entre o genoma e as condições ambientais e a interface da epigenética pode ser o mecanismo central. Embora as tecnologias modernas nos permitam um alto padrão de produtividade epigenético já no nível do genoma, a nossa compreensão das influências genéticas e ambientais sobre os processos epigenéticos permanecem limitados. Os gêmeos são de especial interesse para estudos genéticos por conta de sua similaridade genética e compartilhamento de ambiente de criação. O design gêmeo clássico tem grande contribuição na dissecação das contribuições genéticas e ambientais para as doenças humanas e para traços complexos. Na era da genômica funcional, a valiosa amostra de gêmeos está ajudando a preencher a lacuna entre a atividade do gene e os ambientes através de mecanismos epigenéticos ilimitados por variações da sequência de DNA. Propomos ampliar o projeto clássico de gêmeos para estudar o envelhecimento dos fenótipos epigenéticos moleculares relacionados e ligá-los com exposições ambientais, especialmente eventos da primeira infância. Diferentes desenhos de estudo e questões de aplicação serão destacados e novas abordagens introduzidas com o objetivo de fazer uso de gêmeos na avaliação do impacto ambiental nas mudanças epigenéticas durante o desenvolvimento e no processo de envelhecimento.
Introdução
A expectativa de vida humana experimentou um aumento notável durante o último século.Um ganho sem precedentes no mundo desenvolvido (Christensen et al. 2009) E melhorias similares foram observadas ou esperadas nos países em desenvolvimento. Ao mesmo tempo, pesquisas têm mostrado melhora ainda maior na expectativa de saúde do que na expectativa de vida. (Jeune e Brønnum-Hansen 2008; Robine 2006). Estes fenômenos sugerem a importância do papel de melhorar o ambiente na determinação do estado de saúde individual e sobrevivência. Embora o desenvolvimento sócio-econômico e conseqüente avanço na biomedicina, da tecnologia em conjunto com a melhoria dos cuidados de saúde e tratamento de doenças possam ser usados para explicar essas mudanças, estudar o mecanismo biológico de como asos atributos afetam a saúde individual é de importância central para a saúde pública. Na literatura,estudos recentes mostraram que o impacto de fatores ambientais pode ser adquiridos pelo epigenoma ou genoma em epigenética (Fraga et al. 2005; Wong et al. 2005; Poulsen et al. 2007; Szyf et al. 2008; Ling e Groop 2009; Tan et al. 2010; Petronis 2010), um dos tópicos atuais em câncer e estudos de doenças complexas que desenham pesquisas ativas. Apesar de evidências moleculares serem técnicas interessantes e atuais, como as oferecidas por Affymetrix e Illumina permitem o perfil epigenético (metilação do DNA) em todo o genoma, identificar e compreender os padrões epigenéticos sob uma determinada predisposição genética e exposições ambientais impõem novos desafios à epidemiologia tradicional, tanto em desenho experimental quanto em questões metodológicas.
Os gêmeos são de especial interesse para estudos genéticos devido à sua similaridade genética e ao seu compartilhamento. O último século testemunhou o uso bem-sucedido de gêmeos na exploração das
contribuições genéticas e ambientais para doenças humanas e outras características complexas como, vida útil e envelhecimento. O projeto de gêmeos faz uso de composições genéticas únicas em gêmeos einfere a importância genética em doenças ou traços humanos. Ao comparar o fenótipo de correlação em pares de gêmeos idênticos ou monozigóticos (MZ) e fraternos ou dizigóticos (DZ),vários componentes genéticos e ambientais podem ser avaliados usando o gêmeo clássico. Por exemplo, a herdabilidade para a vida humana foi estimada em cerca de 25% usando Gêmeos dinamarqueses (Herskind et al. 1996; Hjelmborg et al. 2006) significando que cerca de um quarto da variação do tempo de vida humano pode ser explicada por fatores genéticos. Na nossa recente revisão (Tan et al. 2010), o uso de gêmeos em estudos genômicos funcionais do complexo humano em doenças foi resumida e novas abordagens que expandem o design tradicional de gêmeos para estudos genéticos moleculares propostos. Aqui, enfatizamos o novo uso de gêmeos idênticosdiscordantes em fenótipos de doenças em estudos epigenéticos que pode ser uma abordagem que liga ou não a doença com padrões de regulação gênica e exposições ambientais. Da mesma forma,fenótipos do envelhecimento humano são fenótipos complexos que podem ser afetados por um grande número defatores genéticos e ambientais, juntamente com sua interação. Com um bom e eficiente design, os gêmeos podem oferecer oportunidades notáveis ​​para estudos genômicos do envelhecimento humano e desenvolvimento. Neste artigo, destacamos os diferentes projetos de estudo de gêmeos e problemas de aplicação e resumimos o mais recente desenvolvimento em fazer usos de gêmeos para avaliar o impacto ambiental nas mudanças epigenéticas durante o desenvolvimento e no processo de envelhecimento (Figura 1).
Novas tecnologias e novas oportunidades
Logo na concepção, a sequência do DNA genômico é identicamente fixa. No entanto, operfil funcional de um gene é determinado não apenas por sua seqüência, mas também pelo modo como a mesma é regulada por mecanismos epigenéticos, incluindo metilação do DNA, modificação do histona, diferentes espécies de RNAs não-codificantes, etc. Prevê-se que, talvez a mudança mais significativa na genética do século 21 será a mudança estrutural genômica, onde os genes são considerados como um conceito estático, para a genômica funcional, onde padrões dinâmicos de atividade gênica são analisados ​​em conjunto a partir da interação do gene com regulação e à análise genômica funcional (Peltonen & McKnusick, 2001). Entre os vários mecanismos, a metilação do DNA é a principal forma de modificação epigenética que é mais robusta e prontamente mensurável usando técnicas de alto rendimento. Por exemplo, Matrizes de revestimentos de alta densidade Affymetrix usando imunoprecipitação de cromatina (ChIP-on-chip),Illumina Bead Arrays, e Illumina Solexa, com base na análise de metilação do DNA por sequenciamento de DNA tratado com bissulfito (Zhang e Jeltsch, 2010). Todas essas técnicas permitem perfil epigenético massivo na escala genômica.
A modificação epigenética envolve a ligação de pequenas moléculas a sítios específicos no DNA ou na cromatina (Foley et al. 2009), que atua no controle de volume que aumentam ou diminuem a expressão do gene sem alterar sua seqüência de DNA. Por exemplo, um gene é geralmente silenciado por metilação na posição 5 'do anel de citosina pirimidina no DNA em um CpG (nucleotídeos citosina e guanina ligados por fosfato) dinucleotídeos, conhecidos como ilhas CpG, agrupados na região promotora de muitos genes. Em certos momentos durante o desenvolvimento,maquinário celular especializado vasculha o genoma e apaga suas marcas epigenéticas para restaurar um "estado em branco" genético durante o qual uma pequena minoria de genes passa por processos quem passam suas tags epigenéticas inalteradas de pai para filhos (Pál e Hurst,2004). Este fenômeno sugere que os mecanismos moleculares da hereditariedade podem não ser limitados a sequências de DNA. A herança de padrões epigenéticos poderia ajudar a explicar, em parte, a falta de herdabilidade nos estudos atuais de GWAS sobre doenças complexas ou fenótipos (McCarthy e Hirschhorn, 2008).
Das importantes propriedades para a regulação epigenética de atividades gênicas é que ela está sob controle de fatores genéticos e ambientais. Por exemplo, variações individuais nogene da metilenotetrahidrofolato redutase pode variar os níveis de metilação do DNA (Castro ET al. 2004; Friso et al. 2002). Dissecando os componentes genéticos e ambientais no status epigenético e ligando-o com condições de doença ou o processo de envelhecimento impõe um novo desafio para bioestatísticos ebioinformáticos em saúde e envelhecimento.
Uso moderno de um design clássico
Envelhecimento é um processo natural que todos devem sofrer em seu próprio ritmo e tempo. Embora a genética possa determinar inicialmente como uma pessoa envelhece, o meio ambiente pode desempenhar um papel maior do que os genes durante o envelhecimento.Ambientes, especialmente os da infância, são modificadores importantes do processo de envelhecimento (Szyf 2012, 2009; Murgatroyd e Spengler, 2011). Desde os mecanismos genéticos por trás do envelhecimento não são controláveis, entendender como os fatores ambientais retardam ou aceleram o envelhecimento é de impacto mais prático. Para esse propósito, é essencial dissecar a genética e componentes ambientais para os quais os gêmeos podem contribuir. Em resumo, a importância relativa de componentes genéticos e ambientais na variação de um fenótipo pode ser avaliada por comparar a correlação fenotípica dentro de pares de gêmeos idênticos que compartilham seu DNA nuclear com isso dentro de pares de gêmeos DZ que compartilham apenas 50% da sequência de DNA em média. Na literatura, o design clássico duplo tem sido aplicado a vários fenótipos de envelhecimento, incluindopor exemplo, físico (Frederiksen et al. 2002) e cognitivo (Greenwood et al. 2011;Reynolds et al. 2005) funciona em idosos. Um método duplo semelhante foi aplicado ao gene de expressão de gêmeos dinamarqueses idosos (Tan et al. 2005). Esta análise deu relativamentealta herdabilidade estimada para os níveis de atividade dos genes mais ativos.Recentemente, o método duplo foi aplicado ao estudo de perfis globais de metilação do DNA em Gêmeos MZ e DZ (Kaminsky et al. 2009) com diferenças epigenéticas altamente significativas relatados em gêmeos DZ, em comparação com gêmeos MZ. O resultado sugere que tanto fatores genéticos e ambientais influenciam a regulação epigenética de atividades gênicas efornece um modelo para medir suas contribuições relativas. Note que na metilação do DNA os níveis são dinâmicos e mudam ao longo do curso de vida de um indivíduo. No entanto, ambos os animais e os dados humanos sugerem que o meio da vida precoce (incluindo a vida intra-uterina) tem um grande impacto sobreo epigenoma que pode ser ligado ao desenvolvimento da obesidade (Lillycrop e Burdge,2011), diabetes (Fradin e Bougneres, 2011), estresse (Murgatroyd e Spengler, 2011) e doenças mentais de início tardio (Szyf et al. 2007; McGowan e Szyf, 2010). Isso pode ser devido ao fato de que muitas das expressões gênicas diferenciais na determinação da estrutura e
a diferenciação funcional de jaulas em um organismo multicelular surgem durante o desenvolvimento.As mudanças epigenéticas desencadeadas pelo ambiente precoce da vida oferecem um mecanismo plausível para quais experiências precoces poderiam ser integradas no genoma para programar os efeitos hormonais e respostas comportamentais, facilitando assim a adaptação de um organismo a mudanças de ambiente através de alterações na atividade gênica. De especial interesse no clássico gêmeomodelo que contém genética aditiva (A), ambiental comum (C) e únicaefeitos ambientais (E), ou seja, o modelo ACE, o componente C reflete oambiente de criação em suas primeiras vidas. Quando aplicado a dados de medio epigenica (tratamento do nível de metilação do DNA como fenótipo), o modelo ACE pode ser comparado ao modelo aninhado, o modelo AE, para examinar se as condições ambientais de criação ou início da vida contribuem para os regulamentos epigenéticos. Isso significa que o modelo ACE atende bem a necessidade de vincular a exposição ambiental precoce com o status epigenético da velhice. O mesmo modelo pode ser aplicado aos fenótipos de expressão gênica, bem como com o objetivo de avaliar modificações genéticas e ambientais em atividades de transcrição depois. O envelhecimento é acompanhado por vários fenótipos alterados que podem estar ligados à mudança epigenética.Um número crescente de relatos na literatura demonstrou que a metilação do DNA é um processo ativo em células pós-mitóticas e que o epigenoma matura continuamente ao longo da vida com os efeitos do envelhecimento emergindo gradualmente ao longo do tempo como um resultado da exposição a uma variedade de fatores ambientais durante o envelhecimento. Como exemplo, foi demonstrado que mudanças na modificação epigenética podem formar a base molecular para envelhecimento cognitivo (Peleg et al. 2010; Sweatt 2010).
Tan et al. (2008) relataram as mudanças associadas à idade na expressão gênica no CEPH das famílias. Embora as alterações dependentes da idade observadas na expressão gênica possam ser regulação epigenética e alterações genéticas acumuladas por danos no DNA, pode serque uma parte considerável das mudanças pode ser explicada pela epigenética. De modo a tratar a expressão gênica medida ou os níveis de metilação do DNA como fenótipos de interesse,a modelagem de gêmeos pode ser aplicada em diferentes idades para estimar mudanças associadas à idade sobre influências genéticas e ambientais. Os resultados desses estudos poderiam ajudar a estabelecer se a modificação epigenética associada à idade promove mudanças associadas à idade na expressão gênica e como fatores genéticos e ambientais contribuem para essas mudanças.
Gêmeos monozigóticos: uma fonte única
Alterações na expressão gênica devido a mudanças epigenéticas globais desencadeadas porefeitos ambientais e estocásticos se acumulam com o tempo (Fraga et al. 2005) e podem ter impacto substancial nas suscetibilidades às doenças associadas ao envelhecimento e ao estado de saúde (Gronniger et al., 2010; Gilbert, 2009; Poulsen et al., 2007; Holiday, 2010; Bockland et al. 2011), acrescentando novas evidências de que a natureza e a criação estão, de fato, intrinsecamente ligadas. Elucidar a interação complexa entre gene e ambiente que contribui para fenótipos complexos representa um novo desafio.
Gêmeos idênticos servem como uma fonte boa e valiosa para estudar a epigenética dos complexos fenótipos como o envelhecimento, porque o fundo genético é perfeitamente compatível dentro de cada par (Petronis 2006; Poulsen et al. 2007). Usando o design discordante de gêmeos MZ (Figura 2), MZ gêmeos discordantes para um fenótipo de interesse são amostrados de famílias independentes com quais diferenças epigenéticas no par genérico intra-par podem ser determinadas pela alta taxa de transferências técnicas para medir modificações epigenéticas diferenciais (Tan et al. 2010). No design de gêmeos MZ discordantes, as influências genéticas sobre as mudanças epigenéticas são canceladas para que a metilação diferencial do DNA desencadeada por fatores ambientais possa ser identificada (Figura 3). Na literatura, o design foi aplicado na análise da expressão gênica por Pietilainen et al. (2008), que estudaram os perfis transcritos globais de gordura em gêmeos MZ discordantes para o IMC e relataram achados interessantes, sugerindo os papéis substanciais de energia mitocondrial e metabolismo de aminoácidos por trás de obesidade adquirida e resistência a insulina. O design foi aplicado em estudos epigenéticos de outras características complexasincluindo esquizofrenia (Petronis et al. 2003), características de comportamento (Kaminsky et al. 2008), e envelhecimento (Fraga et al. 2005; Gronniger et al. 2010; Wang et al. 2008). Por exemplo, usando MZ gêmeos que são derivados de um único zigoto e, portanto, são considerados geneticamente idênticos, Fraga et al. (2005) descobriram que os gêmeos jovens são epigeneticamente mais parecidos que os gêmeos sugerindo modificação epigenética induzida pela estimulação acumulada por fatores externos, incluindo a exposição ambiental.
Um local identificado de regulação epigenética significativa pode ser um resultado do efeito acumulado de múltiplos estímulos ambientais que atuam através de um mecanismo biológico compartilhado. Em ambos a exploratória (análise de componentes principais, PCA) e confirmatória (equação estrutural modelo, SEM) análises multivariadas são úteis na análise dessesdados. Com o discordante Projeto de gêmeos MZ, o SEM pode ser aplicado para ligar os múltiplos fatores com os fenótipos epigenéticos moleculares medidos. Este modelo, age como um modificador para os ambientes e os mecanismos biológicos latentes (Figura 4). Note que, no diagrama, as influências da idade na variável latente incluem efeitos estocásticos acumulados ao longo do tempo durante os estágios de desenvolvimento ou no processo de envelhecimento. O modelo pode ser alargado para cobrir agregados de variáveis ​​ambientais que podem funcionar através de mecanismos biológicos que levam a padrões alterados de regulação epigenética.
Gêmeos DZ para mapeamento de QTL
O rápido desenvolvimento de técnicas de genotipagem de SNP de alto rendimento usando DNA microarray plataformas, como Illumina e Affymetrix, e mais recentemente, a próxima geração técnica de sequenciamento, está revolucionando a maneira como projetamos e conduzimos estudos epidemiológicos de características ou doenças complexas humanas. Alta resolução de varreduras do genoma são ativadas pelos arranjos de marcadores SNP de alta densidade e informativos tornam possível pesquisadores mapearem loci de características quantitativas (QTL) que são responsáveis ​​pelos traços humanos complexos ou doenças.Duplos gêmeos DZ ou gêmeos fraternos são basicamente irmãos. Ao comparar o fenótipo dependentecompartilhamento de alelo idêntico-por-decente (IBD) dentro de um par, a análise de ligação não-paramétrica pode ser conduzido usando análise de componentes de regressão ou variância (Kruglyak et al. 1996).
Em vez dos fenótipos da doença, o estado epigenético molecular medido (por exemplo,níveis de metilação) pode ser empregada como característica quantitativa ou fenótipo de interesse. Enfatizar que as varreduras de ligação usando gêmeos DZ são favorecidas pelo fato de que os gêmeos DZ são combinados para fatores de criação compartilhada e, especialmente, correspondido por suas idades. Esses fatores podem estar potencialmente associados ao estudo de fenótipos e, portanto, precisam ser ajustados para análise de ligação baseada em par de irmãos. O gêmeo baseado mapeamento não-paramétrico de QTL de fenótipos epigenéticos pode ser ainda maior baixa probabilidade de não-paternidade (MacGregor et al. 2000) que causa erro de cálculo de Probabilidade da DII e, portanto, afeta os resultados de ligação quando a informação do genótipo . Isso é especialmente relevante para os estudos sobre envelhecimento, porque geralmente é impossível os genótipo dos pais dos participantes do estudo antigos. Os gêmeos DZ têm sido freqüentemente usados para mapeamento de ligação de QTLs, especialmente nos últimos anos (De Moor et al. 2007; Livshits et al.2007; Perola et al. 2007; O'Connor et al. 2008). Da mesma forma, métodos baseados em pares de irmãos paramapeamento de associação como S-TDT (Spielman & Ewens, 1998) ou QTDT (Abecasis et al. 2000; Ewens et al. 2008) pode ser aplicado aos dados gêmeos DZ também.
Na literatura, tanto a ligação (Schadt et al. 2003; Morley et al. 2004; Monks et al. 2004) como abordagens de associação (Cheung et al. 2005) foram aplicadas para mapear regiões genômicas que mostram controle epigenético sobre as atividades transcricionais de genes específicos, incluindo cis (local) ou regulamentos de atuação trans (distantes). Embora o nível de mRNA possa ser correlacionado comestado epigenético molecular (por exemplo, níveis de metilação do DNA), aplicação direta da ligação e mapeamento de associação a um fenótipo epigenético molecular (metilação do DNA, histona e etilação, expressão de ncRNA) deve produzir resultados mais eficientes e específicos.
Os níveis de mRNA podem ser afetados por diferentes mecanismos epigenéticos envolvendo diferentes regulamentos. Finalmente, ambas as abordagens podem ser aplicadas a amostras de gêmeos DZ de jovens, e as idades antigas para examinar como esses padrões de regulação mudam com o tempo.
Gêmeos e RNAs não-codificantes
O dogma central do “DNA faz o RNA produzir proteínas” está sendo desafiado por recentes observações sobre a extensão da transcrição de RNA não codificante (ncRNA) nos eucariotos e a gama de fenómenos genéticos e epigenéticos dirigidos por ARN (Esteller 2011). As principais espécies atualmente identificadas de ncRNAs incluem micro-RNAs curtos(miRNAs), pequeno RNA interferente (siRNA), ncRNAs intergênicos longos (lincRNAs) (Mercer et al.al. 2009), e muitos outros, ainda, ncRNAs desconhecidos. Entre eles, os miRNAs são um dos principaisnos ncRNAs que regulam negativamente a expressão gênica no nível pós-transcricional, degradando as mensagens de destino ou inibindo sua tradução. RNAs reguladores desempenham papéis cruciais em uma ampla variedade de processos celulares até a regulação de grupos específicos de mi RNAs para suprimir expressões gênicas indesejadas de outros miRNAs cuja expressão dos genes alvo é necessária para a função. Estudos utilizando modelos de sistemas mostraram que, com a idade, há uma tendência de aumento
de expressão de miRNA que leva à diminuição da regulação de genes alvo sugerindoque o controle epigenômico do envelhecimento pode ser devido, em parte, ao aumento da expressão de miRNAs que, por sua vez, regulam seus genes alvo (Liang et al. 2009). Recentes estudos de associação revelaram que, um grande ncRNA chamado ANRIL (ncRNA anti-sentido no locus INK4) tem associação compartilhada com doença coronariana, aneurisma intracraniano e também diabetes tipo 2, que em geral sugere alta implicação no envelhecimento celular (Pasmant ET al. 2011; Gonzalo 2010). Ignorar e amortecer a ativação desses ncRNAs pode revelar se uma nova fronteira para futuras pesquisas com o objetivo de retardar o processo de envelhecimento e ampliar a expectativa de saúde.
Estudos atuais sobre ncRNAs estão limitados à análise de expressão. Para elucidar papéis genéticos e ambientais na atividade reguladora dos ncRNAs, é importante estudar a genética de ncRNAs (Wapinski e Chang 2011). As diferentes abordagens usando gêmeos para estudos genéticos de RNAs codificadores de proteínas (Tan et al. 2010) genética de ncRNAs (Figura 1). Por exemplo, a análise de ligação em gêmeos DZ pode ser usada para mapear genes que regulam a atividade de expressão de um ncRNA que pode ser trans-ou cis-regulação.
Da mesma forma, o design de gêmeos MZ discordantes pode ajudar a associar Variações fenotípicas com expressões de ncRNA enquanto controlam para antecedentes genéticos(Figura 3). Embora as diferentes análises da Figura 1 possam ser realizadas em diferentes idades ou estágios de desenvolvimento para exibir os padrões dependentes da idade em amostras epigenéticas baseadas em ncRNAs. Regulamentações, a abordagem SEM na Figura 4 avalia diretamente os efeitos da idade sobre exposição e nos mecanismos biológicos latentes não observados (incluindo o acúmulo de eventos estocásticos) que levam a modificações epigenéticas.
Observações conclusivas
A maioria das características complexas, incluindo doenças e fenótipos de envelhecimento, são causadas por interação entre genoma e ambiente através da interface da epigenética. Apesar de tecnologias modernas nos permitirem um perfil de alta produtividade de padrões epigenéticos em nível genômico, nossa compreensão das influências genéticas e ambientais na epigenética e aos processos permanece limitada. Com design adequado e abordagens analíticas, os gêmeos podem nos ajudar identificar marcas epigenéticas e ligá-las a exposições ambientais, especialmente eventos da primeira infância para medir suas influências em mecanismos epigenéticos na população usando modelagem dupla, mapeamento de ligação, design de gêmeos MZ discordantes, etc.
Espera-se que a amostra valiosa de gêmeos vai fazer novas contribuições em revelar e compreender os mecanismos genéticos e epigenéticos do envelhecimento e desenvolvimento humanos.