O EMPREGO DA FERRAMENTA MOLECULAR CRISPR-CAS9 EM PESQUISAS RELACIONADAS A DOENÇAS HUMANAS COM ENVOLVIMENTO GENÉTICO

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O EMPREGO DA FERRAMENTA MOLECULAR CRISPR-CAS9 EM PESQUISAS RELACIONADAS A DOENÇAS HUMANAS COM ENVOLVIMENTO GENÉTICO. ¹
THE USE OF THE CRISPR-CAS9 MOLECULAR TOOL IN RESEARCH RELATED TO HUMAN DISEASES WITH GENETIC INVOLVEMENT.
Laura Rossi da Motta²
RESUMO
Apesar de ter origem despretensiosa, a descoberta do CRISPR, transformou o mundo da ciência básica e aplicada. Com o intuito de descobrir o motivo pelo qual algumas bactérias não são infectadas por vírus, um lócus, que produz fragmentos de RNA foi identificado, essa posição do genoma com o auxílio de uma enzima CAS9, faz o reconhecimento de material genético externo e por consequência elimina a parte que está infectada com o vírus. O poder de edição da CAS9, concedeu a pesquisadores uma gama imensa de opções tendo em vista que ele pode ser utilizado como um marcador gênico para alterar uma parte específica do DNA, deletando partes indesejadas, ou com algum tipo de erro de expressão constante até que o próprio organismo de reparação do gene consiga substituir por algo funcional ou substituir essa parte do DNA por uma que expresse algo desejado com uma taxa de precisão nunca vista antes, podendo ser aproveitada em pesquisas relacionadas a doenças humanas com envolvimento genético.
Palavras-chave: Edição de genoma, Aplicações clínicas, Doenças genéticas.
ABSTRACT
Though unpretentious in origin, the discovery of CRISPR has transformed the world of basic and applied science. In order to find out why some bacteria are not infected by viruses, a locus, which produces fragments of RNA has been identified, this position of the genome with the help of a CAS9 enzyme, makes the recognition of external genetic material and consequently eliminates the part that is infected with the virus. The editing power of CAS9 has given researchers an immense range of options since it can be used as a gene marker to alter a specific part of the DNA, deleting unwanted parts, or with some kind of constant error of expression until the gene repair organism itself can replace it with something functional or replace that part of the DNA with one that expresses something desired at a rate of accuracy never seen before, and can be used in research related to human diseases with genetic involvement.
Keywords: Genome editing, Clinical applications, Genetic diseases.
INTRODUÇÃO
A descoberta do CRISPR: Cas9 e sua aplicação como uma poderosa ferramenta de edição de genes transformou o mundo da ciência básica e aplicada, especialmente a cúpula da biologia molecular. Um sistema vivo é uma rede complexa de milhares de genes cuja recombinação, replicação, reparo, divisão, diferenciação, progressão e herança são controladas por máquinas altamente complicadas e sofisticadas (Wang et al., 2016). 
Além disso, a natureza suave, rápida, flexível e muito eficiente dessa tecnologia permitiu aos biólogos alterar o genoma dos procariotos sistemas eucarióticos complexos, incluindo plantas e animais. Para regular ou entender esses processos biológicos, manipulação e perturbação de genes específicos é necessário que sejam ativados ou reprimidos através da edição precisa do genoma (Shapiro et al., 2018). 
Usando CRISPR e ferramentas associadas, investigação, controle e modificação de eventos biológicos significativos estão mais acessíveis do que antes. Essas tesouras biológicas agora estão sendo usadas para acelerar programas de reprodução de plantações e animais, criar novos antimicrobianos e controlar patógenos transmissores de doenças. No entanto, como outras técnicas, esses cortadores surgiram como uma espada de dois gumes e colocaram vários desafios para a sociedade científica. Seu sistema aplicação como uma poderosa ferramenta de edição de genes transformaram a ciência biológica por sua capacidade de realizar manipulações genéticas em diversos organismos (Zhang et al., 2017). 
A descoberta do CRISPR: Cas9 simplificou a criação de novos modelos animais, o que está permitindo que o biólogo amplie seus horizontes em termos de escolhendo um modelo específico para a realização de um estudo. Nos últimos anos, vários modelos animais como peixes, ratos, coelhos, cães até mesmo macacos foram desenvolvidos usando o sistema CRISPR (Chang et al., 2013)
Além disso, o ativador e repressor mediado CRISPR empregando proteínas cas9 inativas ou mortas também foi utilizado com sucesso para ativar ou inativar genes relacionados ao crescimento, supressão, diferenciação, regulação e sensibilidade celular a toxinas em mamíferos (La Russa e Qi, 2015). Não apenas como uma ferramenta de edição de genoma, mas o CRISPR: O sistema Cas9 também pode ser usado a partir de seu sistema original; servir como um sistema imunológico, eliminando genomas antigênicos de indivíduos doentes.
A tecnologia CRISPR não apenas contribui para compreender processos complexos de doenças, mas também subsidia o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. Com base em estudos realizados por pesquisadores, espera-se que em quase futuras ferramentas baseadas no CRISPR seriam as armas significativas para lutar contra várias doenças/desordens ou para corrigir as mutações da linha germinal (Brokowski et al., 2015)
Embora vários estudos tenham fornecido a prova de conceito de que as ferramentas CRISPR podem ser úteis para eliminar as doenças/desordens, numerosos desafios práticos, técnicos e éticos estão bloqueando seus caminhos.
METODOLOGIA
Este estudo foi realizado através de uma pesquisa bibliográfica, principalmente, por meio de artigos. Foram consultadas as publicações em língua inglesa disponíveis nas bases de dados eletrônicas ScienceDirect (a principal fonte mundial de pesquisa científica, técnica e médica) e PubMed (acervo online da Biblioteca Nacional de Medicina dos Estados Unidos). Os descritores utilizados foram "CRISPR-Cas9", "doenças genéticas", "edição do genoma", "sequenciamento de próxima geração", "doenças humanas". As recomendações da SBB (Sociedade Brasileira de Bioética), relativas a não maleficência, a beneficência, a autonomia e a justiça, também foram aproveitadas para compor essa revisão.
O período estudado foi de 2015 a 2020, correspondente ao solicitado. A análise de dados foi realizada através da leitura e tradução dos artigos, que visou identificar os conceitos teóricos de interesse para essa pesquisa, as metodologias aplicadas e os principais resultados encontrados. Nesse trabalho, os resultados foram subdivididos em: edição do genoma, avanços biomédicos, fatores que afetam a eficácia do sistema CRISPR /Cas9, e questões de bioéticas envolvidas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
EDIÇÃO DO GENOMA
	A edição do genoma, engenharia genética, é um poderoso meio para infindas aplicações na pesquisa da medicina e biomedicina. O desenvolvimento do sistema de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) -Cas9, revolucionou o campo da edição de genes, facilitando assim a edição eficiente do genoma por meio da criação de quebras de fita dupla direcionadas de quase todos os organismos e tipos de células.
	A edição precisa do genoma tem o potencial de curar doenças permanentemente através da interrupção de genes causadores de doenças endógenas, corrigindo mutações causadoras de doenças ou inserindo novos genes protetores. Por meio da desativação de genes de virulência ou da inserção de genes protetores, os ZFNs (Nucleases de dedo de zinco são uma classe de proteínas projetadas de ligação de ADN, gerada por fusão de dedo de zinco, que facilitam a edição do genoma) têm sido usados para induzir resistência à infecção por vírus em células humanas e aumentar a eficiência das imunoterapias. Como as nucleases de engenharia mais recentes, CRISPR / Cas9 fornece uma nova ferramenta de edição de genoma altamente eficiente para estudos de terapia genética.
Ademais, a tecnologia CRISPR-Cas9 foi usada com sucesso para muitos outros fins, incluindo regulação da expressão de genes endógenos, edição de epigenoma, marcação de células vivas de loci cromossômicos,edição de RNA de fita simples e triagem de genes de alto rendimento. A implementação do sistema CRISPR-Cas9 aumentou o número de alternativas tecnológicas disponíveis para estudar a função dos genes, permitindo assim a geração de modelos de doenças baseados em CRISPR. 
AVANÇOS BIOMÉDICOS
	O número de doenças identificadas que são associadas a alterações no genoma humano ultrapassa a marca de 7.000, entretanto tratamentos eficazes foram desenvolvidos apenas para cerca de 500. Nos últimos anos, as abordagens baseadas em genes para terapia de doenças ganharam tração significativa na pesquisa, como evidenciado pelo interesse emergente em tecnologias de edição de genes. Embora eficazes, essas técnicas já existentes exigem notoriamente um projeto extenso ao escolher novos alvos genéticos e podem sofrer barreiras na eficiência da edição. O CRISPR tornara-se um facilitador das atuais abordagens baseadas em edição de genes para a cura de doenças humanas. Os sistemas CRISPR / Cas9 são soluções simples e refinadas para alteração seletiva e demarcação do genoma. Essas estratégias se beneficiam de um direcionamento de sequência flexível, mas de alta fidelidade, e de edição eficaz, ressaltando sua posição como talvez a técnica mais importante para a edição de genes de mamíferos.
Embora os métodos mecânicos de introdução sejam eficazes in vitro e in vivo, sua aplicação clínica são inerentemente limitados pela acessibilidade das regiões-alvo. A entrega dos componentes CRISPR / Cas9 nos núcleos das células alvo é necessária para a modificação do gene. Os componentes da maquinaria CRISPR / Cas9 são macromoléculas e, portanto, são incapazes de entrar espontaneamente no citosol e no núcleo. Várias abordagens foram tomadas para a entrega celular do sistema CRISPR / Cas9, tais como abordagens baseadas em plasmídeo/vetor viral, mRNA codificado por Cas9 ou entrega direta de proteína Cas9. Vários vetores sintéticos foram desenvolvidos para distribuir componentes CRISPR in vivo, incluindo nanopartículas inorgânicas e formulações de polímero / lipídio. No entanto, embora tenha havido progresso no uso de cada um desses formatos de entrega, ainda existem desafios significativos na transição dessas tecnologias para na Vivo inscrição.
	Além da edição de genes específicos, as propriedades de ligação ao DNA de CRISPR / Cas9 podem ser úteis em outras aplicações importantes. CRISPR reaproveitado em uma plataforma guiada por RNA para controlar a expressão gênica através do desenvolvimento de uma enzima Cas9 cataliticamente morta (dCas9) que reteve sua capacidade de reconhecer e ligar uma sequência de DNA alvo. Em vez de clivar o DNA ligado, a enzima dCas9 permaneceu ligada à sequência de DNA alvo, interrompendo a RNA polimerase ou a ligação do fator de transcrição. Eles mostraram que este sistema, denominado interferência CRISPR (CRISPRi), pode reprimir a expressão de vários genes simultaneamente sem alterar o genoma.
	O sistema CRISPR também pode servir como uma ferramenta poderosa para estudos epigenéticos, permitindo a manipulação direcionada de marcadores epigenéticos para interrogar relações de controle epigenético e transcricional. Uma proteína de fusão de dCas9 e acetiltransferase foi desenvolvida por Hilton et al. (2015), catalisando a acetilação da histona H3 lisina 27 em locais alvo. Eles mostraram ativação de genes altamente específicos em todo o genoma. Outros marcadores epigenéticos (por exemplo, grupos metil) podem ser modulados usando esta abordagem.
FATORES QUE AFETAM A EFICÁCIA DO SISTEMA CRISPR /CAS9
	Embora o sistema CRISPR / Cas9 tenha demonstrado grande promessa para a edição de genes específicos in loco e outras aplicações, existem vários fatores que influenciam sua eficácia que devem ser abordados, especialmente quando usados na abordagem clínica. 
O efeito fora do alvo configura principal desafio para a efetividade do CRISPR. Nos últimos anos, os pesquisadores buscaram fazer melhorias otimizando o sgRNA ou modificando artificialmente a proteína estrutura de Cas9, como a estrutura PAM. Além disso, existem investigações sobre proteínas anti-CRISPR que prometem ser um interruptor Cas9 útil para evitar efeitos fora do alvo, limitando a quantidade de tempo que Cas9 está ativo no núcleo. 
A eficiência de entrega de Cas9 em células ou tecidos é outro problema que está impedindo a edição de genoma mediada por CRISPR com sucesso. A edição inicial do genoma mediada pelo CRISPR cujas abordagens basearam-se na entrega de plasmídeos ou vetores virais que codificam Cas9 e sgRNAs. Vetores de vírus adeno-associados (AAV), que podem facilitar a transferência de genes e episomais que se expressão em células que não se dividem, são os vetores mais usados na entrega de Cas9. 
Entretanto, essa aplicação sofre de limitações associadas ao tamanho dos transgenes encapsulados, a imunidade pré-existente contra vetores AAV e resposta adaptativa mediada por células T CD8 + contra o capsídeo AAV. Vários estudos têm mostrado que o formato de entrega de ativos Cas9 proteína / gRNA ribonucleoproteína (RNP) complexo através microinjeção, transfecção, eletroporação ou nucleofecção mediada por lipossomas tem mais vantagens devido a menores efeitos fora do alvo e edição rápida do gene quando comparado com o plasmídeo.
A Transfecção de DNA, no entanto, in vivo nos formatos de entrega de mRNA e proteína representam certos desafios técnicos, incluindo a incapacidade de entregar globalmente às células ou órgãos alvo, ou até mesmo dificuldades de desencadear respostas imunes inatas de detecção de RNA em células humanas e murinas, levando a citotoxicidade. 
A melhoria adicional no desempenho dos componentes CRISPR e no meio de entrega é necessária para aumentar a eficiência da edição do genoma in vivo, como entrega de nanopartículas carregando sgRNA e proteína Cas9. 
Em suma, existem algumas dificuldades que precisam ser superadas para o uso eficaz da edição de genes baseada em CRISPR, especialmente em terapia clínica. Contudo, a edição do genoma tende a tornar-se uma ferramenta poderosa para modificar linhas celulares e organismos para investigar a biologia e mecanismos fisiopatológicos de várias doenças genéticas. 
Mais estudos continuarão a fim de melhorar a precisão e eficiência do direcionamento de genes, potenciais de entrega em particular células, tecidos ou órgãos, eficiência de detecção e modulação de tempo de atividade, área de atividade de Cas9 in Vivo, eficiências de predição e tratamento de mutações indesejadas causadas por edição de genes. 
Outra questão importante é representada pela preocupação ética relacionada ao uso da tecnologia CRISPR em humanos, e as diretrizes éticas e regulamentadoras adequadas que devem ser desenvolvidas para julgar o uso razoável dessas ferramentas. Que mencionarei a seguir.
QUESTÕES BIOÉTICAS ENVOLVIDAS
A adaptação do sistema CRISPR como uma ferramenta de edição de genes levou a uma revolução em muitos campos de aplicação, uma vez que esta técnica é consideravelmente mais rápida, fácil de executar e mais eficiente do que as técnicas anteriores. Porém, algumas dessas aplicações levantam questões éticas objetivas que devem ser abordadas. Neste artigo discutirei, com base nos dados mais recentes, as diferentes questões relacionadas com as aplicações do CRISPR na linha germinativa e a sua introdução em ensaios clínicos. 
Entre as aplicações clínicas, sem dúvida a mais polêmica é a possibilidade inédita de editar a linha germinal humana, ou seja, modificar o genoma de gametas e embriões. Os riscos dessas modificações são imprevisíveis, agravados pelo fato de que as mudanças serão transferíveis de geração em geração. Além disso, isso abre a porta para a possibilidade de expandir o uso do CRISPR na linhagem germinativa, não só para evitar a transmissão de doenças hereditárias, mas também para melhorar nossas capacidades ou selecionar as características do futuro bebê (crianças de design).
Numa importante reunião internacional convocada pela National Academy of Sciences e pela National Academy of Medicine dos EstadosUnidos, em dezembro de 2015, estas questões foram debatidas e, com base nas conclusões alcançadas, foi elaborado um relatório que foi publicado em junho de 2017. Ele confirma essa opinião e declara que, no futuro, a aplicação clínica da edição de genes da linhagem germinativa pode se tornar uma opção realista. Posteriormente, em agosto de 2017, onze organizações lideradas pela American Society na of Human Genetics (ASHG) publicou um relatório em que a porta não está fechada para um possível uso futuro da terapia gênica germinativa, mas é apontado que hoje, questões éticas, científicas e políticas não resolvidas tornam a edição de genes em embriões inadequada para implantação posterior. No entanto, aprova e de fato recomenda essas experiências para fins de pesquisa para favorecer uma possível aplicação clínica no futuro. Da mesma forma, o Hinxton Group, um consórcio internacional de cientistas, bioeticistas e especialistas em políticas, pediu a continuação da pesquisa em embriões, mas não levou a discussão nenhuma aplicação reprodutiva.
Outra questão é se isso pode levar a uma sociedade menos inclusiva e a situações de discriminação. “Em primeiro lugar, existe o risco de que certas forças sociais, econômicas e políticas influenciem aqueles que são considerados 'inaptos' em um esforço para pressioná-los a mudar sua genética de maneiras que se adaptem melhor a certas normas ou expectativas externas. Em segundo lugar, há o risco de que aqueles que resistem à pressão para se conformar experimentem (mais) opressão”. Não apenas a autonomia individual seria violada neste caso, mas o uso da edição de genes para fins eugênicos também representaria um desafio insuperável na busca por equidade, uma vez que dois grupos diferentes poderiam ser estabelecidos em nossa espécie: seres humanos imperfeitos e “melhorados”. Estas são certamente situações que podem acontecer e é algo que deve ser antecipado se a edição do gene germinativo chegar à clínica, para antecipar esses cenários e estabelecer as medidas adequadas para evitá-los. de antemão.
Em termos de edição de genes somáticos, o CRISPR já foi usado com considerável sucesso em vários modelos animais e celulares de várias doenças, incluindo câncer, Aids, Distrofia muscular de duchenne, epidermólise bolhosa, imunodeficiência combinada grave, glaucoma, e síndrome do X frágil.
No que diz respeito à avaliação ética destas aplicações, existem várias questões relacionadas com a equidade no acesso a novas terapias, a proteção de populações vulneráveis, o consentimento informado, o estabelecimento de marcos regulatórios específicos (nacionais e internacionais), a possibilidade de um “turismo de saúde”, a necessidade de adaptar os princípios e protocolos dos ensaios clínicos, a liberdade das empresas comerciais de oferecerem tratamentos de terapia gênica diretamente ao consumidor, critérios de seleção de doenças, etc. Não obstante, os principais problemas que emergem nesse contexto são segurança. Numerosos estudos descreveram o aparecimento de mutações fora do alvo (fora do alvo) ao usar CRISPR o que pode ser muito perigoso se ocorrer em humanos, dada a natureza permanente das mudanças.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
CRISPR-Cas9 revolucionou a ciência biomédica ao permitir modificações no genoma com resolução de nucleotídeo único em quase qualquer tipo de célula e organismo. A velocidade com que o CRISPR avança reflete sua utilidade, simplicidade e eficiência. O amplo uso de aplicativos subsequentes baseados em CRISPR o tornaram uma plataforma multifuncional cuja aplicabilidade vai além da edição de um único gene para realizar a edição multiplexada, regulação específica da sequência da expressão do gene e telas do genoma de outras plataformas. Esses novos desenvolvimentos metodológicos aumentaram consideravelmente as alternativas tecnológicas para o estudo da função gênica e para modelagem em diversos organismos e doenças.
Outrossim, apesar do rápido desenvolvimento da tecnologia CRISPR, muitas questões mecanicistas permanecem sem resposta e vários desafios ainda precisam ser resolvidos. Em primeiro lugar, os métodos de entrega existentes devem ser otimizados e novas abordagens criadas para a entrega de elementos CRISPR à célula alvo para atingir níveis suficientes de eficiência. Em segundo lugar, a eficiência deve ser acoplada à especificidade, e novos métodos para controlar os efeitos fora do alvo, evitando a edição direcionada, precisam ser investigados. Em resumo, uma pesquisa considerável é necessária antes que o CRISPR possa ser aplicado de forma abrangente na pesquisa e terapia básicas e biomédicas. Por fim, acredito que as tecnologias de engenharia de genoma baseadas em CRISPR-Cas9 nos ajudarão a entender melhor os processos de doenças e seu tratamento em um futuro próximo.
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Revisão de Literatura¹
Acadêmica do Curso de Medicina – Universidade Franciscana – UFN. ²
Email: laurarossimotta@gmail.com
Professor: Bruno Stefanello Vizzotto
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