Prática 2 -Roteiro de Inoculação

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Roteiro de Aula Prática 2 – Inoculção
Introdução
O estudo de bactérias exige o prévio isolamento e identificação, para tanto, são utilizados diversos meios de cultura diferentes. Meio de cultura é uma mistura de nutrientes que possibilitam o crescimento in vitro de microrganismos. A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. As exceções são as ricketsias, clamídias, Mycobacterium leprae e Treponema, que são parasitos intracelulares obrigatórios. Neste caso, estes microrganismos podem ser cultivados em culturas de células e ovos embrionados. Inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a transferência de um determinado número de microrganismos para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificação. A inoculação das bactérias em diferentes meios envolve várias técnicas de semeadura.
Toda a manipulação realizada em laboratório (com meios de cultura e material utilizado) requer certos cuidados para evitar a contaminação. Esses procedimentos são denominados técnicas assépticas.
Fundamentação teórica
Meios de Cultura
Os diversos meios de cultura existentes podem ser classificados de diversas formas:
	Meios de Cultura
	
Quanto à composição
	
Naturais
	São aqueles encontrados na natureza, de origem vegetal (pedaço de batata, de abóbora) ou animal
(gema de ovo, pedaço de carne)
	
	
Artificiais
	São aqueles fabricados em laboratório, constituído de substâncias químicas, podendo ser definidos ou indefinidos (complexos)
	
	
	
Definidos
	Possui composição definida, ou
seja,	se	conhece	qualitativa	e quantitativa sua composição.
	
	
	
Indefinidos
	A sua composição real não é conhecida, apenas é feita uma estimativa qualitativa (meios suplementados com sangue, gema
de ovo, alimentos).
	
Quanto ao estado físico
	Líquido
	São desprovidos de Agar à caldo
	
	Semi-sólido
	Apresentam em sua composição físico até 1% de Agar.
	
	Sólido
	Apresentam em sua composição de 1,5 a 2,5% de Agar.
	
Quanto à finalidade e características
	Simples
	Só possui os nutrientes básicos para o crescimento das bactérias em geral.
	
	
Enriquecido
	Além dos nutrientes básicos possui elementos nutritivos a mais, como fatores promotores de crescimento (sangue), mas não é específico.
	
	De enriquecimento
	É suplementado com nutrientes específicos para o microrganismo que se deseja pesquisar. Além disso, possui nutrientes agentes inibidores de determinados microrganismos, mas não permite o isolamento da bactéria, pois é um meio líquido - aminoácidos (lisina à Salmonella)
	
	
Seletivo
	Possui agentes inibidores de determinados microrganismos. Permite a identificação e isolamento da bactéria, pois é um meio sólido
(permite a visualização de UFCs).(Agar EMB à inibe Gram+)
	
	
Diferencial
	Permite a diferenciação de diferentes microrganismos.(a diferenciação de bactérias fermentadoras e não fermentadoras da lactose no
Agar BEM).
	
	
Indicadores
	Possuem agentes que indicam determinadas reações no meio, para a determinação do metabolismo das bactérias.-ferro no meio à pode indicar a produção de H2S pelo enegrecimento do meio.(sulfeto ferroso)
*** geralmente o agente é um indicador de pH
	
	
De estoque
	Meios onde são estocadas culturas puras para
posterior	utilização.	Geralmente	são	meios semisólidos.
Técnicas de Semeadura
As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um outro meio de cultura. Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja semeado, são utilizadas as técnicas assépticas: procedimentos que devem ser adotados visando a não contaminação de materiais, meios e culturas.
As técnicas de assepsia incluem:
1) Fazer a desinfecção da área de trabalho e anti-sepsia das mãos ANTES e DEPOIS de qualquer trabalho.
2) Trabalhar SEMPRE na área de segurança: uma área de aproximadamente 10 cm ao redor da chama do bico de Bunsen.
3) Esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alças e agulhas bacteriológicas) ANTES e DEPOIS de seu uso e sempre aquecer da base para a ponta, evitando a formação de aerossóis.
4) Flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculações, evitando a contaminação da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microrganismo desejado será inoculado.
De acordo com as características físicas dos meios de origem e destino, além da finalidade da inoculação, podem-se utilizar diferentes técnicas de inoculação. A transferência de inóculo de um meio para outro também é denominada genericamente como repique.
A seguir, veremos quais são as técnicas de inoculação:
	Semeadura em meios sólidos
	
Meio inclinado em tubos
	 
Ou
	Objetivo: obtenção de pequena massa de microrganismos.
Picada Central: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste.
Objetivo:	é	utilizado	para	verificar fermentação e motilidade em algumas
técnicas.
	
Meio em camada Alta
	 
	Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste.
	
Meio em placa de Petri
	 
	Pour-plate ou disseminação (método em profundidade): Transferir 1 ml da cultura para placa de Petri vazia, colocar 10 – 20 ml do meio fundido (e resfriado a cerca de 45 – 50°C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente com movimentos circulares.
Objetivo: contagem bacteriana.
	
	 
	Streak-plate ou estria simples: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio.
A estria pode ser realizada em movimento de zigzag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre o meio (estria reta).
Objetivo: Essa técnica é muito utilizada para visualização de determinadas propriedades metabólicas, como a produção de enzimas hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio - gema de ovo, sangue), e produção de pigmentos.
	
	 
Ou
	Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A placa é dividida em 4 quadrantes e a inoculação pode ser feita de 2 tipos:
à em 3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade, girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da placa), girar mais 90° e estriar o meio restante.
à em 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90° e estriar o restante do meio.
Objetivo: obtenção de colônias isoladas.
É importante não cruzar as estrias (não tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as
colônias isoladas.
	
	
 
	Spread-plate, superfície ou distensão: Transferir 0,1 ml da cultura para o meio sólido na placa e espalhar uniformemente com a própria ponta da pipeta, ou alça bacteriológica / swab / alça Drigalsky.
Objetivo: obtenção de crescimento confluente, ou para contagem bacteriana. Esta técnica é muito utilizada na realização de antibiogramas.
	Semeadura em meios líquidos
	 
	Difusão: uma alçada da colônia (Agar em placa) ou da cultura (de outro meio ou líquido) é introduzida no meio líquido, com agitação da alça, para maior difusão dos microrganismos (da alça para o meio e homogeneização no meio). Pode-se inclinar o tubo a 30° e esfregar o inóculo na parede do mesmo, quando o tubo retornar à posição original o inóculo se difundirá no meio.
Objetivo: é um repique genérico para crescimento bacteriano em meio líquido.
Prática
- Na placa com meio PCA (Plate count agar): com auxílio de um suabe coletar amostra de uma mucosa (ou garganta, ou nariz ou ouvido). Proceder com estrias simples na placa com auxílio do suabe. Incubar por 48 horas a 36 graus.
- Na placa de PDA (Potato dextrose agar): expor a placa por 30min em um ambiente. Incubar por 5 dias em 25 graus.
- Naplaca de MH (Mueller hinton): com auxílio do suabe, cobrir toda a placa com amostras de microrganismos. Distribuir o discos de antibiótico na superfície da placa e incubar por 48 horas a 36 graus.
Obs.: Próximas aulas faremos a leitura das placas.