Unidade I - Microscopia

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Instrumentação 
Biomédica
Material Teórico
Responsável pelo Conteúdo:
Prof.ª Dr.ª Renata Torres
Revisão Textual:
Prof. Me. Claudio Brites
Microscopia
• Microscopia;
• Unidades de Medida;
• Tipos de Microscopio;
• Preparo da Amostra.
• Conhecer as unidades de medida utilizadas para calcular o tamanho das amostras anali-
sadas em um microscópio;
• Reconhecer os componentes de um microscópio óptico composto e identifi car a trajetória 
da luz até a obtenção da imagem;
• Identificar as aplicações dos diferentes tipos de microscópio e saber quando devem 
ser utilizados;
• Explicar as principais diferenças entre a microscopia óptica e a eletrônica;
• Entender a importância do preparo da amostra antes da visualização no microscópio;
• Conhecer os princípios e aplicações de corantes ácidos e básicos;
• Discutir alguns tipos de coloração comuns na prática de laboratório clínico. 
OBJETIVOS DE APRENDIZADO
Microscopia
Orientações de estudo
Para que o conteúdo desta Disciplina seja bem 
aproveitado e haja maior aplicabilidade na sua 
formação acadêmica e atuação profissional, siga 
algumas recomendações básicas:
Assim:
Organize seus estudos de maneira que passem a fazer parte 
da sua rotina. Por exemplo, você poderá determinar um dia e 
horário fixos como seu “momento do estudo”;
Procure se alimentar e se hidratar quando for estudar; lembre-se de que uma 
alimentação saudável pode proporcionar melhor aproveitamento do estudo;
No material de cada Unidade, há leituras indicadas e, entre elas, artigos científicos, livros, vídeos 
e sites para aprofundar os conhecimentos adquiridos ao longo da Unidade. Além disso, você tam-
bém encontrará sugestões de conteúdo extra no item Material Complementar, que ampliarão sua 
interpretação e auxiliarão no pleno entendimento dos temas abordados;
Após o contato com o conteúdo proposto, participe dos debates mediados em fóruns de discus-
são, pois irão auxiliar a verificar o quanto você absorveu de conhecimento, além de propiciar o 
contato com seus colegas e tutores, o que se apresenta como rico espaço de troca de ideias e de 
aprendizagem.
Organize seus estudos de maneira que passem a fazer parte 
Mantenha o foco! 
Evite se distrair com 
as redes sociais.
Mantenha o foco! 
Evite se distrair com 
as redes sociais.
Determine um 
horário fixo 
para estudar.
Aproveite as 
indicações 
de Material 
Complementar.
Procure se alimentar e se hidratar quando for estudar; lembre-se de que uma 
Não se esqueça 
de se alimentar 
e de se manter 
hidratado.
Aproveite as 
Conserve seu 
material e local de 
estudos sempre 
organizados.
Procure manter 
contato com seus 
colegas e tutores 
para trocar ideias! 
Isso amplia a 
aprendizagem.
Seja original! 
Nunca plagie 
trabalhos.
UNIDADE Microscopia
Microscopia
Células e diversos micro-organismos são muito pequenos para serem visualiza-
dos a olho nu, sendo essencial o uso de um microscópio. Esses aparelhos permitem 
visualizar imagens milhares de vezes maiores do que o tamanho original. Veja a 
Figura 1 como medida de comparação e note como a limitação do olho humano é 
superada com o uso dessa tecnologia. Você verá nesta unidade que antes de serem 
visualizadas em um microscópio, muitas células precisam de um preparo especial 
de coloração, pois seu estado natural é incolor. Além disso, você conhecerá as par-
tes de um microscópio óptico, saberá como funcionam e em quais situações devem 
ser utilizados outros tipos de microscópio.
Microscópio: micro (latim) significa pequeno e skopos (grego) significa olhar.
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Limite de resolução do olho humano e dos microscópios óptico e eletrônico, 
disponível em: https://goo.gl/WJowtEEx
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Importante!
Robert Hooke foi a primeira pessoa a observar células em um microscópio, em 1665. 
Entretanto, a resolução de seu microscópio permitia a observação de células grandes, 
mas não microrganismos. Entre 1673 e 1723, Anton van Leeuwenhoek descreveu uma 
série de microrganismos presentes na água da chuva, em suas próprias fezes e dentes 
após a observação em seus microscópios. Até então, esse mundo era invisível e desco-
nhecido aos olhos humanos e à comunidade científica.
Mesmo com a descoberta da existência de microrganismos, foi somente por volta de 
1840-1870 que pesquisadores começaram a associar microrganismos como causadores 
de infecções cirúrgicas e doenças. Até então, as doenças eram associadas a punições que 
demônios impunham a seres vivos como represália a pecados e mal comportamentos. 
Pasteur iniciou a era de ouro de microbiologia quando inúmeros avanços e descobertas 
foram realizados e a microbiologia foi elevada à categoria de “ciência”. Nessa época, as 
técnicas de microscopia foram aprimoradas e o mundo microscópico e invisível ao olho 
nu passou a ser estudado em detalhes.
Trocando ideias...
Vamos primeiramente conhecer o sistema métrico utilizado para medir células? 
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Unidades de Medida
Estamos habituados a utilizar o sistema métrico para medir distâncias, por exem-
plo, “minha casa fica a 300 metros da universidade” ou “a 30 km (30.000 m) do 
polo sede”. Também utilizamos no dia-a-dia as medições em centímetros e milíme-
tros, por exemplo, “esses legumes devem ser cortados em tiras de 5 cm (0.05 m)” 
ou “encontrei uma larva de 5 mm (0.005 m) na minha salada”. Percebam que todas 
as medidas podem ser convertidas em metros por um fator de conversão igual a 10, 
ou seja, multiplicando-se ou dividindo-se por 10.
O mesmo acontece para medir as células e microrganismos, só que as unidades são 
menores. Um micrometro (μm) equivale a 0,000001 m (10-6 m), o nanômetro equivale 
a 0,000000001 m (10-9 m) e o Angström (A) equivale a 10-10 m. Veja a Tabela 1.
Tabela 1 – Unidades de medida de comprimento e conversão em metros
Unidade de medida Símbolo Conversão em metros
1 quilômetro km 1 km= 1000 m, ou, 103 m
1 metro m unidade-padrão
1 decímetro dm 1 dm= 0,1 m, ou, 10-1 m
1 centímetro cm 1 cm= 0,01 m, ou, 10-2 m
1 milímetro mm 1 mm= 0,001 m, ou, 10-3 m
1 micrômetro μm 1 μm= 0,000001 m, ou, 10-6 m
1 nanômetro nm 1 nm= 0,000000001 m, ou, 10-9 m
1 angstrom A 1 A= 0,0000000001 m, ou, 10-10 m
1 picômetro pm 1 pm= 0,000000000001 m, ou, 10-12 m
Como medida de comparação, o olho humano consegue detectar objetos acima 
de 200 μm (2 x 10-4 m). Algumas bactérias medem cerca de 1 μm, ou seja, preci-
samos de um instrumento especial para visualiza-las.
Tipos de Microscopio
Os microscópios podem ser ópticos, eletrônicos e de acústica de varredura. 
Cada microscópio possui suas particularidades e deve ser utilizado em situa-
ções específicas, de acordo com a amostra que você quer analisar realçando os 
detalhes importantes em cada caso. Na sua rotina profissional, você precisará 
identificar o melhor método e utilizá-lo para emitir os laudos que envolvam o 
uso dessa tecnologia.
Microscópio Óptico
Dentro da categoria de microscópios ópticos, existem os campo claro, campo 
escuro, contraste de fase (CF e CID), fluorescência, confocal e dois fótons. Todos 
eles utilizam a luz para visualizar as amostras, mas têm aplicações distintas. O tipo 
de luz também varia acarretando em efeitos específicos na obtenção da imagem.
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UNIDADE Microscopia
Microscópio óptico de campo claro
Esse é o tipo de microscópio mais comum. É muito utilizado pela maioria dos 
pesquisadores, estudantes e na rotina biomédica. Aprenderemos quais são as par-
tes e como funciona um microscópio óptico composto (veja a Figura 1). Os demais 
microscópios são variações desse tipo e cada um possui suas peculiaridades.
• Braço (haste entre os números 2 e 9 da Figura 1): Faz parte do arcabouço 
do microscópio. Sempre que precisar transportar um microscópio, utilize o 
braço para não danificar as demais estruturas;
• Mesa (número 6 da Figura 1): Local onde é colocada a lâmina que deve ser 
presa por presilhas para fixação;
• Charriot (número 9 da Figura 1): Parafuso que possibilita o deslizamento 
preciso nas quatro direções, permitindo ao usuário modificara posição da lâ-
mina para visualização do campo desejado;
• Parafuso macrométrico (número 4 da Figura 1): Permite o ajuste do foco 
grosseiro. Esse ajuste deve ser feito sempre com a objetiva de menor aumento 
para facilitar a focalização da amostra e não danificar o microscópio;
• Parafuso micrométrico (número 5 da Figura 1): Permite o ajuste fino no 
momento de focalizar a amostra;
• Iluminador (número 7 da Figura 1): É a fonte de luz branca utilizada para 
iluminar a amostra. O comprimento de onda da luz branca é longo e só per-
mite a visualização de estruturas maiores do que 0,2 μm. Caso seja necessário 
observar amostras menores, outro tipo de microscópio deve ser utilizado;
• Diafragma (número 8 da Figura 1, próximo ao condensador): Controla a 
quantidade de luz que passa da fonte ao condensador;
• Condensador (número 8 da Figura 1, próximo ao diafragma): Possui len-
tes cuja função é direcionar os raios de luz que passarão pela amostra presente 
na lâmina;
• Lentes objetivas (número 3 da Figura 1): São as lentes próximas da lâmina 
que fazem a ampliação primária da amostra. Estão presentes em um carrossel 
(número 2 da Figura 1), contendo 4 lentes objetivas que aumentam o objeto 
de estudo em 4x ou 10x (objetivas de baixo alcance), 40 x (alto alcance) ou 
100 x. Cada microscópio possui um conjunto específico de lentes objetivas, 
mas essas são as mais comumente encontradas;
• Lente ocular (número 1 da Figura 1): Amplia novamente a amostra em 
10 x. Dessa forma, a ampliação final da amostra é 10x vezes a ampliação da 
objetiva, ou seja, o aumento final das amostras visualizadas com a objetiva de 
4x, é 40x (10x da ocular vezes 4x da objetiva), e com as objetivas de 10x, 40x 
e 100x é 100 x, 400 x e 1000 x, respectivamente.
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Figura 1 – Partes de um microscópio óptico composto: 1. Lentes oculares; 
2. carrossel; 3. lentes objetivas; 4. parafuso macrométrico; 5. parafuso micrométrico; 
6. mesa; 7. iluminador; 8. diafragma e condensador; 9. charriot
Fonte: Wikimedia Commons
A quantidade de luz branca que sai do iluminador é controlada pelo diafragma 
antes de atravessar o condensador. Esse, por sua vez, focalizará a luz e permitirá 
que a mesma ilumine a amostra. A luz atravessa a lente objetiva, aumentando a 
imagem de acordo com a lente e chegando na lente ocular onde a imagem é au-
mentada em mais 10 x. A imagem obtida é uniformemente iluminada. 
O microscópio de campo claro é utilizado rotineiramente para a visualização de 
cortes histológicos (tecidos), de diferentes tipos de células e microrganismos, sendo 
muito útil em laboratórios de análise clínica e de pesquisa.
Para a visualização de bactérias, você precisará de um aumento final de 1000x, 
ou seja, utilizar a lente objetiva 100x. Nesse caso, um cuidado especial deve ser to-
mado porque deve-se obrigatoriamente utilizar óleo de imersão. O óleo de imersão 
diminui a refração da luz e permite que você tenha uma visão nítida da amostra e 
que a mesma seja visualizada na coloração correta. Atenção, a única lente que pode 
ter contato com o óleo de imersão é a objetiva 100x, jamais permita que as demais 
lentes entrem em contato com o óleo, pois o mesmo danifica essas lentes.
Durante a rotina biomédica, você deve ser capaz de focar e visualizar as amostras 
rapidamente, então preste bastante atenção nas aulas práticas. 
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UNIDADE Microscopia
Resolução: é a capacidade de distinguir dois pontos da amostra que estão separados por 
uma distância muito próxima. Quanto maior a resolução, mais detalhes e estruturas podem 
ser diferenciados, resultando em melhor definição da imagem. Quando você ler que a reso-
lução de um microscópio é 0,3 nm, significa que você conseguirá diferenciar dois pontos se a 
distância entre eles for no mínimo 0,3 nm.
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Muitas amostras são transparentes em seu estado original e não podem ser visu-
alizadas no microscópio óptico de campo claro. Para contornar esse problema, as 
células devem ser coradas previamente para contrastar com o meio ao redor, como 
veremos no item 4. 
Figura 2 – Trypanosoma brucei (agente causador da doença do sono) 
entre células sanguíneas visualizados em microscópio de campo claro
Fonte: Wikimedia Commons
Em algumas situações, o protocolo de coloração distorce as peculiaridades de 
microrganismos impedindo sua identificação. Outras vezes, precisamos observar 
microrganismos vivos, mas o procedimento de coloração pode matar as células. 
Quando as amostras não podem ser coradas, elas devem ser observadas por outros 
tipos de microscópio óptico, que não os de campo claro. 
Microscópio óptico de campo escuro
O microscópio de campo escuro é indicado para amostras que possuem pouco 
contraste com o meio, como, por exemplo, cristais de ácido úrico e oxalato em 
exames de urina. A bactéria Treponema pallidum (causadora da sífilis) possui um 
formato de uma espiroqueta extremamente fina e a detecção desse microrganismo 
em amostras deve ser realizada em microscópio de campo escuro, pois o de campo 
claro não permite a visualização dessa característica específica. 
O microscópio de campo escuro possui um condensador especial com um dis-
co opaco que bloqueia os raios de luz direta, permitindo que apenas a luz indireta 
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entre na objetiva e ilumine o objeto por angulo oblíquo. O resultado é uma amostra 
iluminada contra um campo escuro, pois não há luz direta iluminando esse campo.
Figura 3 – Treponema pallidum (agente causador da sífi lis) 
visualizado em microscopia de campo escuro
Fonte: Wikimedia Commons
Microscópio óptico de contraste de fase
O microscópio óptico de contraste de fase pode ser utilizado quando precisamos 
visualizar tecidos e células não coradas. Também utilizamos para ver detalhes celu-
lares internos bem definidos de organismos vivos.
Esse microscópio possui um condensador com um diafragma anular que faz com 
que parte da luz seja refratada e parte não refratada ao passar pela amostra. A luz 
não refratada é aquela que não sofre alteração pela amostra, ou seja, seus raios 
de luz estão em fase gerando uma imagem de coloração clara. Já a luz refratada 
é aquela que sofre alteração pela amostra e seus raios de luz não estão em fase, 
gerando imagens escuras que variam em tons de cinza a preto. O resultado final 
visualizado pela ocular é a combinação desses raios refratados e não refratados, 
gerando imagens com contraste de coloração. Note na Figura 4 a comparação 
entre uma imagem obtida em um microscópio de campo claro e uma em um de 
contraste de fase onde as estruturas celulares internas são visualizadas em detalhes 
não detectados pelo microscópio de campo claro.
Figura 4 – Microrganismo observado em microscópio 
de campo claro (à esquerda) e de contraste de fase (à direita)
Fonte: microscopy-uk.org.uk
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UNIDADE Microscopia
Uma variação desse tipo de instrumento é o microscópio de contraste com 
interferência diferencial (CID) que utiliza dois feixes de luz que são separados por 
prismas. Isso gera uma imagem com cores mais contrastantes e com maior resolu-
ção que um microscópio de fase tradicional e que aparenta ser quase tridimensional 
(Figura 5).
Figura 5 – Microrganismo aquático Micrasterias furcata observado sob microscópio CID
Fonte: Wikimedia Commons
Importante!
Se um agente da polícia federal precisar checar a autenticidade de um documento em 
um aeroporto, provavelmente utilizará um microscópio para observar detalhes não vi-
sualizados a olho nu. Veja o que esse agente observaria se utilizasse os microscópios de 
campo claro, escuro e de contraste de fase para checar uma folha de papel: 
Figura 6 – Agente da polícia checando a autenticidade de um documento (acima). 
Abaixo encontram-se as imagens obtidas se uma folha de papel for analisada em microscópio 
de campo claro (à esquerda), campo escuro (centro) e de contraste de fase (à direita).
Fontes: Adaptado de Wikimedia Commons
Você Sabia?
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Microscópio óptico de fluorescência 
Diferentemente dos microscópios anteriores queemitem luz branca para visuali-
zar as amostras, os microscópios de fluorescência emitem uma luz ultravioleta (UV). 
Os comprimentos de onda da luz UV são absorvidos pela amostra que, por sua vez, 
emite luz em um comprimento de onda diferente do que foi excitado. 
Outra diferença é que a fonte de luz e a objetiva do microscópio de fluorescência 
estão posicionadas do mesmo lado. Dessa forma, a luz que excita a amostra sai pela 
lente objetiva, fazendo com que a objetiva também funcione como um condensador 
direcionando os raios de luz que passarão pela amostra. Em seguida, a luz emitida 
pela amostra será coletada pela mesma lente objetiva e, por fim, direcionada para 
a lente ocular. Para tornar esse processo possível, existem filtros responsáveis para 
isolar e direcionar corretamente os comprimentos de onda de excitação e de emissão. 
Algumas substâncias emitem luz naturalmente quando são excitadas com luz 
ultravioleta, como é o caso do leite em pó, que emite uma luz azul. Entretanto, a 
maioria das amostras não são autofluorescentes. Para que as mesmas possam ser 
observadas no microscópio, é preciso torná-las fluorescentes com o uso de coran-
tes chamados fluorocromos ou fluoróforos. Alguns fluorocromos são absorvidos 
naturalmente por algumas amostras, como é o caso da bactéria Mycobacterium 
tuberculosis (causadora da tuberculose), que absorve o fluorocromo auramina-O, 
o qual possui uma coloração amarelada quando excitado com a luz ultravioleta. 
Outro exemplo é a substância DAPI, que se liga naturalmente à molécula de DNA, 
permitindo a visualização do ácido nucleico de coloração azul. Todavia, a maio-
ria dos organismos não absorve fluorocromos nem são autofluorescentes, como 
visualizá-los no microscópio de fluorescência, então? 
Por uma técnica chamada imunofluorescência, que é muito utilizada na medicina diag-
nóstica. Essa técnica consiste na produção de anticorpos contra antígenos presentes nas 
amostras. Esses anticorpos estão ligados ou conjugados a fluorocromos e, quando en-
tram em contato com o antígeno, ligam-se especificamente ao mesmo. Ao serem exci-
tados por uma luz ultravioleta, emitem fluorescência. A coloração da amostra dependerá 
do tipo de fluorocromo conjugado ao anticorpo, por exemplo, o fluorocromo FITC emite 
coloração esverdeada enquanto o fluorocromo PE-Cy5 emitir coloração avermelhada.
Essa emissão de luz colorida é capturada pela lente objetiva e pode ser observada 
quando olhamos através da lente ocular do microscópio de fluorescência. O resultado 
é um campo de fundo escuro com as amostras fluorescentes com colorações especí-
ficas. É possível marcar cada alvo de estudo com um tipo de fluorocromo diferente. 
Veja na Figura 8 o exemplo de uma imagem obtida durante a divisão celular: o DAPI 
está corando as moléculas de DNA (quadrante superior esquerdo), uma proteína en-
volvida na divisão celular está marcada com um fluorocromo verde (quadrante supe-
rior direito) e os microtúbulos responsáveis pela segregação cromossômica marcados 
com fluorocromos vermelhos (quadrante inferior esquerdo). Cada imagem individual 
é sobreposta por um software, resultando na imagem final mostrando a co-localiza-
ção ou sobreposição dos componentes (quadrante inferior direito). A co-localização 
permite que você possa saber como os diferentes elementos interagem entre si.
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UNIDADE Microscopia
Figura 7 – Imagens individuais de um evento de divisão celular obtidas de um microscópio óptico 
de fluorescência (quadrantes superior e inferior esquerdo). Imagem de sobreposição das imagens 
individuais mostrando a co-localização dos componentes (quadrante inferior direito)
Fonte: Wikimedia Commons
Sondas fluorescentes: as sondas utilizadas em microscopia de fluorescência podem ser 
moléculas de DNA ou anticorpos, de acordo com o que se quer estudar. Quando seu interesse 
de estudo é uma molécula de DNA específica, utiliza-se uma sonda que é uma pequena 
molécula de DNA complementar à molécula de DNA que se deseja rastrear. Essa pequena 
molécula está marcada com um fluorocromo e, quando se liga por complementariedade 
ao DNA específico, pode ser detectada por um microscópio de fluorescência. Essa técnica é 
conhecida como FISH (Hibridização fluorescente in situ). FISH é uma técnica de citogenética 
amplamente utilizada no estudo de doenças genéticas, deleções e inserções de regiões cro-
mossômicas, anomalias cromossômicas, entre outras.
No caso de querer estudar alguma proteína específica, utiliza-se anticorpos marcados com 
fluorocromos que reconhecem a proteína de interesse. Um exemplo, é a análise de amostras 
de solo e água potencialmente contaminadas com certos parasitas ou bactérias.
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Microscópio confocal
A microscopia confocal é um tipo especializado de microscopia óptica que também 
utiliza sondas fluorescentes para rastrear a localização de certos antígenos celulares.
O microscópio confocal permite a obtenção de imagens de diferentes planos se-
riados com uma profundidade de até 0.5 μm, que são chamadas de séries Z. Essas 
imagens isoladas são montadas por um software, gerando uma figura final que é 
tridimensional. Como cada série Z contém um tipo de informação de acordo com 
a profundidade na célula, é possível reconstituir células inteiras visualizando tridi-
mensionalmente o que está marcado com o anticorpo fluorescente. Por exemplo, 
se você utilizou um anticorpo fluorescente que marca proteínas presentes na mem-
brana plasmática da mitocôndria, cada série Z vai ter informação de uma região no 
eixo Y. Ao obter a imagem final, você conseguirá visualizar detalhes da mitocôndria 
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e saber exatamente em que posição da membrana essa proteína se encontra. Além 
disso, é possível determinar volumes, áreas e comprimentos de regiões seleciona-
das. Para que seja possível reconstruir as imagens tridimensionais, o microscópio 
confocal deve estar acoplado a um computador.
Existe a opção de utilizar duas ou mais sondas para checar informações mais com-
pletas de uma determinada célula ou fenômeno celular. Um exemplo seria o estudo 
de doenças multifatoriais – como a doença de Alzheimer de início tardio –, que po-
dem ter diversos genes envolvidos no desenvolvimento da doença (BARROS, 2008), 
ou então, o estudo concomitante de diferentes proteínas envolvidas na divisão celular.
Veja a Figura 8, à esquerda, para entender o que são as séries Z utilizadas para 
reconstruir a imagem de uma esfera. Note que cada plano tem informação sobre 
uma região da esfera. O mesmo acontece para a microscopia confocal: as ima-
gens geradas são cortes de diferentes partes da amostra. Na imagem à direita da 
Figura 9, vemos a reconstrução tridimensional de várias séries Z obtidas após a 
marcação da proteína beta-tubulina de Tetrahymena. 
 
Figura 8 – Representação esquemática de reconstrução tridimensional de séries-z de uma esfera (à esquerda). 
Reconstrução 3-D mostrando a localização da proteína beta-tubulina no protozoário Tetrahymena. 
A proteína foi marcada com fl uorocromo verde e as séries-z foram obtidas por microscópio 
confocal e montadas por um software (à direita)
Fonte: Adaptado de Wikimedia Commons
Veja as imagens de cortes de um grão de pólen mostrando as séries-Z do topo à base obtidas 
por microscopia confocal no link a seguir: https://goo.gl/pNjB8v 
FISH complementa cariótipo no diagnóstico da síndrome mielodisplásica, disponível em: 
https://goo.gl/jJVfVH
Técnicas imunológicas aplicadas à detecção de bactérias no ambiente. II. Uso de anticorpos 
como sondas em estudos de localização destes microrganismos presentes em amostras de 
solo e planta, disponível em: https://goo.gl/JLBX3f 
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Microscópio de dois Fótons
Enquanto a microscopia confocal permite a visualização de células com espes-
sura de até 100 μm, a microscopia de dois fótons permite a obtenção de imagens 
de células e tecidos de até 1 mm de espessura. Esse tipo de microscópio utiliza dois 
fótons para excitar o fluorocromo, ao invés de um e um comprimento de ondaque 
não danifica as células, podendo ser utilizado para estudar células vivas. 
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UNIDADE Microscopia
Microscópio eletrônico
Vírus, detalhes celulares menores que 0,2 μm, organelas e estruturas internas não po-
dem ser visualizados pela microscopia óptica. Os comprimentos de onda de luz utilizada 
nesse tipo de microscopia impõem um limite de resolução para esse tipo de microscópio. 
Diferentemente dos microscópios ópticos que utilizam a luz para excitar as amos-
tras, os microscópios eletrônicos utilizam feixes de elétrons. Os comprimentos de 
onda dos elétrons são mais curtos que os da luz, fazendo com que a resolução seja 
muito superior aos microscópios ópticos. Diversos avanços científicos foram obtidos 
a partir do uso dessa técnica, uma vez que permitiram a visualização de estruturas 
mais detalhadas. Podemos citar como exemplos o conhecimento da complexidade 
da estrutura de cápsulas virais e o papel do complexo de Golgi na formação de 
grânulos contendo enzimas destinadas à secreção.
Um canhão de elétrons fica localizado na parte superior da amostra dentro de 
um sistema a vácuo onde os elétrons são acelerados em direção à amostra. Antes 
de chegar à amostra, esse feixe passa por uma série de lentes eletromagnéticas, 
sendo que cada uma é responsável por uma função. As bobinas de alinhamento 
controlam a posição e a inclinação do feixe, enquanto as lentes condensadoras 
diminuem o tamanho do feixe para que se obtenha uma boa resolução. As lentes 
objetivas focalizam a amostra (Figura 9).
Figura 9 – Representação esquemática mostrando as partes de um microscópio eletrônico
Fonte: fap.if.usp.br
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Para que sejam visualizadas, o objeto de estudo precisa estar recoberto por partí-
culas de ouro ou carbono. As imagens obtidas, chamadas de micrografias de trans-
missão, são de coloração preto e branco, mas podem ser alteradas artificialmente 
com o uso de softwares, introduzindo cores para realçar detalhes importantes.
Existem dois tipos de microscopia eletrônica: de transmissão e de varredura. 
Na microscopia de transmissão, os cortes devem ser muito finos, pois os elétrons 
não conseguem penetrar profundamente na amostra. As estruturas celulares in-
ternas podem ser observadas em regiões mais claras ou escuras, de acordo com 
o total de elétrons absorvidos por cada região. A imagem obtida é bidimensional.
Figura 10 – Mitocôndria (à esquerda) e duas partículas de adenovírus (à direita) 
visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão
Fontes: Adaptado de Wikimedia Commons
Na microscopia eletrônica de varredura, são obtidas imagens tridimensionais 
da superfície da amostra em detalhes de até 10 nm. O nome é devido ao fato da 
amostra ser “varrida” ou escaneada por um feixe de elétrons em todas as direções, 
permitindo a obtenção da imagem tridimensional. 
Figura 11 – Microscopia eletrônica de varredura, mostrando 
diversos vírus HIV (em verde) sendo liberados de um linfócito
Fonte: Wikimedia Commons
Um tipo especializado da microscopia eletrônica de varredura é a microscopia 
de tunelamento e a de força atômica, que utilizam sondas para examinar a super-
fície de amostras a uma curta distância. Essas técnicas “tateiam” a amostra a uma 
distância de alguns angstrons, produzindo imagens de altíssima resolução, reve-
lando protuberâncias e depressões dos átomos da superfície. São utilizadas para 
estudar moléculas de DNA, proteínas e outras substâncias moleculares.
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UNIDADE Microscopia
Importante!
O aumento visual dos microscópios ópticos é de até 1.500 vezes em relação ao olho nu. 
Já dos microscópios eletrônicos, o aumento é entre 5.000 a 100.000 vezes, ou até mais.
Você Sabia?
Microscópio acústico de varredura
Esse tipo de microscopia não é um método invasivo e permite a análise de 
amostras vivas que estão abaixo de uma superfície ou aderidas a outras superfícies. 
É possível estudar a formação de trombos, de biofilmes bacterianos em equipamen-
tos hospitalares, células cancerígenas, entre outras aplicações.
Ondas sonoras são emitidas por um aparelho, entram em contato com a amos-
tra e podem ser dispersas, absorvidas e refletidas ou então transmitidas quando em 
contato com determinados tipos de superfície. Em seguida, são capturadas por um 
detector e então interpretadas revelando a presença de limites ou de objetos.
Preparo da Amostra
Muitas amostras são transparentes em seu estado original e não podem ser 
visualizadas nos microscópios ópticos convencionais. Uma das formas de preparar 
as amostras para que elas contrastem com o meio ao redor é com o uso de fluo-
rocromos, como já discutido anteriormente. Entretanto, existem preparações mais 
baratas, simples e rápidas que podem ser utilizadas para visualizar amostras em 
microscópios de campo claro, que são as colorações. 
Obtenção da amostra
Algumas amostras, tais como sangue, amostras da mucosa oral e cultivos bacte-
rianos, podem ser observadas pela técnica do esfregaço. Essa técnica consiste em 
espalhar o material coletado em uma lâmina com auxílio de outra lâmina de vidro 
inclinada em um angulo de 45o (Figura 12). É importante produzir uma camada 
muito fina para que as células não fiquem empilhadas umas sobre as outras, e para 
que a luz consiga atravessar a amostra.
Figura 12 – Esfregaço de uma gota de sangue com auxílio de uma outra lâmina inclinada
Fonte: Wikimedia Commons
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Outras amostras, tais como material de biópsia ou pedaços de órgãos, precisam 
ser submetidas a cortes histológicos para que possam ser visualizadas. Nesse caso, 
são produzidos vários cortes seriados e a análise do material deve ser feita por com-
pleto, pois uma informação importante pode estar presente em um plano, mas não 
no outro. O micrótomo é um aparelho que faz esses cortes seriados muito finos das 
amostras. Veja na Figura 13 um micrótomo fatiando um pedaço de órgão embe-
bido em bloco de parafina. Cada uma dessas fatias são adicionadas em lâminas de 
vidro e processadas para serem visualizadas em microscópio.
Figura 13 – Micrótomo fatiando um pedaço de órgão preparado em bloco de parafi na
Fonte: Getty Images
Fixação
Antes da coloração, as células precisam ser fixadas às lâminas de microscopia. 
Essa etapa mata as células e faz com que as amostras fiquem aderidas à lâmina em 
seu formato preservado. Álcool, formol e ácido acético são substâncias comumente 
utilizadas no processo de fixação.
Em seguida, as amostras são submetidas a etapas de coloração de acordo com 
o que se quer visualizar. Cada corante possui afinidade e se associa a determinado 
componente celular. 
Coloração 
Existem corantes ácidos e corantes básicos que se ligam a determinadas estrutu-
ras celulares por afinidade. Corantes ácidos possuem carga negativa e são atraídos 
por estruturas positivas. Exemplos de corantes ácidos são a eosina, a fucsina ácida 
e a nigrosina. Corantes básicos possuem carga positiva e possuem afinidade por 
estruturas negativas. Exemplos de corante básicos são a hematoxilina, o cristal vio-
leta, azul de metileno, verde de malaquita, safranina. 
Existem vários tipos de coloração e o protocolo deve ser escolhido de acordo com 
a amostra que você quer investigar. Nesse tópico, falaremos de alguns exemplos.
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UNIDADE Microscopia
As estruturas celulares que possuem afinidade por corantes ácidos são chamadas acidófilos 
ou eosinófilos.
Já as estruturas que possuem afinidade por corantes básicos são chamadas basófilas ou basofílicas.
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Hematoxilina e eosina (HE)
A técnica de coloração Hematoxilina/ Eosina (HE) é a mais comum em citologia. 
A hematoxilina é um corante básico e possui afinidade por estruturas negativas, 
tais como ácidos nucleicos e grupos fosfatos. Isso faz com que esse corante core a 
heterocromatina, o nucléolo e o RNA ribossômico. Também se liga a sulfatos de 
glicosaminoglicanas, sendo responsável, por exemplo, pela coloração de matriz 
extracelular de cartilagens. A hematoxilina possui coloração azul-arroxeada.
A eosina é um corante ácido de coloração rosa-alaranjadae cora o citoplasma, 
as mitocôndrias e o colágeno. 
Figura 14 – Núcleos celulares corados em roxo e os citoplasmas, em rosa
Fonte: Getty Images
Coloração de gram 
Essa coloração é utilizada para diferenciar amostras bacterianas. Os diferentes 
tipos de bactérias reagem de forma distinta a esse procedimento de acordo com a 
estrutura de sua parede celular, podendo ser classificadas como gram-positivas ou 
gram-negativas. 
O protocolo consiste em incubar um esfregaço bacteriano com corante cristal 
violeta que possui a coloração. Após lavagem do excesso de corante, as amostras 
são incubadas com iodo, que forma um complexo cristal violeta-iodo (CV-I). De for-
ma sucinta, as bactérias gram-positivas possuem uma parede celular de peptideogli-
cano bastante espessa que impede a saída do complexo CV-I, que é maior do que 
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os componentes isolados do complexo. Dessa forma, essas bactérias permanecem 
com coloração púrpura após a lavagem com álcool. Já as bactérias gram-negativas 
possuem uma camada fina de peptideoglicano que não impede a saída do comple-
xo CV-I. Após a lavagem com álcool, essas bactérias ficam incolores e precisam 
ser coradas com safranina (coloração rosa) para serem visualizadas no microscópio.
Figura 15 – À esquerda, você observa bactérias gram-positivas (roxas coradas por cristal-violeta) 
em formato de cocos e, à direita, bactérias gram-negativas 
(rosadas coradas por safranina) em formato de bacilos
Fonte: Getty Images
Na disciplina de microbiologia você verá que a definição se as bactérias presentes 
em uma amostra são gram-positivas ou negativas é de extrema importância, pois 
é a primeira etapa no diagnóstico de bactérias patogênicas de amostras clínicas. 
De acordo com o resultado da coloração de gram, o profissional de análises clínicas 
definirá quais etapas de provas bioquímicas devem ser seguidas para identificação 
da bactéria antes da emissão do laudo.
Coloração alcool-ácido resistente
As bactérias do gênero Mycobacterium não são coradas pela coloração de 
Gram, pois sua parede celular externa contêm alta concentração de um lipídeo 
céreo hidrofóbico (ácido micólico) que impede a entrada de corantes. Essa camada 
é externa à camada de peptideoglicano. Exemplos de importância clínica desse 
grupo são os patógenos causadores da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) e 
da lepra (Mycobacterium leprae).
Nessa coloração, o esfregaço bacteriano é incubado com um corante vermelho 
chamado carbolfucsina. Após aquecimento da lâmina para aumentar a penetração 
e retenção do corante, o excesso é lavado com água e em seguida com álcool-
-ácido. As bactérias que são álcool-ácido resistentes retêm o corante vermelho, pois 
a cabolfucsina é mais solúvel nos lipídeos da parede-celular dessas bactérias do que 
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UNIDADE Microscopia
na solução de lavagem álcool-ácido. Dessa forma, essas bactérias permanecem 
com coloração vermelha após a lavagem com álcool. Já nas bactérias que não são 
álcool-ácido resistentes, o corante é removido após a lavagem com álcool e essas 
bactérias ficam incolores. Para serem visualizadas no microscópio, precisam ser 
coradas com azul de metileno (coloração azul).
Figura 16 – Microbactérias coradas em vermelho (carbolfucsina) e células diversas 
em azul (azul de metileno). As microbactérias são álcool-ácido resistentes e permanecem 
com a coloração avermelhada após o procedimento de descoloração por álcool-ácido
Fonte: Getty Images
Artefatos são estruturas ou marcações que aparecem nas imagens obtidas em microscópios 
(ópticos e eletrônicos), que não são reais. Alguns protocolos de preparação da amostra cau-
sam distorção ou encolhimento de estruturas ou regiões celulares gerando imagens falsas.
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Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:
 Vídeos
How to use a microscope and oil immersion
Veja como usar um microscópio óptico para visualização no maior aumento com óleo 
de imersão;
https://youtu.be/f7KlFSgdUGU
 Leitura
Microscopia
Site interessante da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP – sobre microscopia.
https://goo.gl/HljGFs
Métodos em microscopia para o estudo de células
PowerPoint criado pela pós-graduação da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – 
USP – Métodos em microscopia para o estudo de células.
https://goo.gl/JkL1HF
BD Biosciences Fluorochrome Reference Chart
Tabela com diversos fluorocromos que podem ser utilizados na microscopia de 
fluorescência.
https://goo.gl/JfPRPY
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UNIDADE Microscopia
Referências
ALMEIDA, L. M.; PIRES, C.; COELHO, A. B. Microscopia – Contexto histórico, 
técnica e procedimentos para observação de amostras biológicas. 1. ed. São Paulo: 
Érica/Saraiva, 2014. 
BARROS, A. C. et al. Influência genética sobre doença de Alzheimer de início tar-
dio. Rev Psiq Clín., v. 36, n. 1, p. 16-24. 2009. Disponível em: http://www.scielo.
br/pdf/rpc/v36n1/a03v36n1.pdf. Acesso em: 3 mar. 2019.
PETERSON, D. A. Confocal Microscopy. In: Encyclopedia of Movement Disorders. 
2010. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/confocal-
-microscopy. Acesso em: 3 mar. 2019.
SAM Applications. Scanning Acoustic Microscopy. Disponível em: http://www.
pvatepla-sam.com/applications/overview/?L=1#c3587. Acesso em: 3 mar. 2019.
TEIXEIRA, F. S. Microscopia óptica. Conceitos básicos (01/03/2013). Página do 
Instituto de Física da USP. Disponível em: http://fap.if.usp.br/~nandast/mo.html . 
Acesso em: 3 mar. 2019.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre: 
Artmed, 2017. 
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