Microextração líquido-líquido

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Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204
Instituto Internacional de Cromatografia
http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.005
ISSN 1984-4433
PREPARO DE AMOSTRAS
186 Scientia Chromatographica 2014; 6(3)
Bruna Juliana Moreira1 
Jennifer Michiko Chauca Yokoya2 
Cristiane Masetto de Gaitani1
1Departamento de Ciências Farmacêuticas, 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de 
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 
14040-903, Ribeirão Preto, SP, Brasil
2Departamento de Análises Clínicas, 
Toxicológicas e Bromatológicas, Faculdade 
de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, 
Universidade de São Paulo, 14040-903, 
Ribeirão Preto, SP, Brasil
*crisgai@fcfrp.usp.br
Recebido: 19/12/2014 
Aceito: 30/12/2014
Resumo
Para bioanálises, o processo de preparo da amostra deve ser realizado antes da 
determinação analítica. Esse procedimento visa eliminar componentes endógenos 
e/ou outros fármacos ou compostos interferentes e melhorar a detectabilidade e 
a seletividade. Para tanto, técnicas como a LLE e SPE são frequentemente usadas. 
A miniaturização da LLE tem sido realizada visando o desenvolvimento de técnicas 
de preparo de amostra eficientes, rápidas e econômicas e com menor uso de 
solventes orgânicos. A microextração líquido-líquido dispersiva é uma técnica de 
microextração, desenvolvida por Rezaee et al. em 2006 que representa a maior 
porcentagem (59,4%) das publicações na área de microextração em fase líquida 
e já foi aplicada para a análise de alimentos, frutas, vegetais, amostras biológicas 
e ambientais. Apresenta como vantagens baixo tempo de extração, simplicidade 
de operação, rapidez, baixo custo, alta recuperação do analito e alto fator de 
enriquecimento. No entanto, devido a algumas desvantagens como uso de solvente 
tóxico e a etapa de centrifugação, que dificulta a automação da técnica, algumas 
modificações experimentais têm sido propostas. Neste artigo, os autores discutem 
os fundamentos da técnica, suas inovações e sua aplicação em amostras biológicas.
Palavras-chave: amostra biológica, DLLME, inovações.
Abstract
A sample preparation process must be performed before the analytical determination 
in bioanalysis. This procedure aims to eliminate endogenous compounds and/or 
other interferent drugs or compounds and to improve detectability and selectivity. 
For that, techniques such as LLE and SPE are frequently used. Efficient, fast, 
economical and less solvent consumptive sample preparation techniques have been 
carried out with the miniaturization of LLE. Dispersive liquid-liquid microextraction 
(DLLME) is a microextraction technique, developed by Rezaee et al. in 2006. It 
represents the highest percentage (59.4%) of the publications in the area of liquid 
phase microextraction and has already been applied to the analysis of food, fruits, 
vegetables, biological and environmental samples. Its advantages are low extraction 
time, simplicity of operation, rapidity, low cost, high recovery factor and high analyte 
enrichment. However, due to some disadvantages such as the use of toxic solvents 
and centrifugation, which hinders the automation, some experimental modifications 
have been proposed. In this article, the authors discuss the principles of the 
technique, innovations and applications for biological samples.
Keywords: biological sample, DLLME, innovations.
Microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME): 
fundamentos, inovações e aplicações biológicas
Dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME): principles, innovations 
and biological applications
DLLME: inovações e aplicações biológicas Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM
Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 187
1. Histórico
Bioanálises rotineiramente são utilizadas na 
medicina forense e em estudos toxicológicos. Contudo, 
antes da determinação analítica, os analitos devem ser 
submetidos a um processo de preparo da amostra[1], que 
é uma etapa de extrema importância para a obtenção de 
resultados confiáveis[2] e cujo principal objetivo consiste 
em extrair e concentrar o analito de interesse para torná-
lo compatível com o sistema analítico a ser utilizado[3,4], 
minimizar ou eliminar efeitos da matriz e melhorar os 
limites de detecção[5].
A extração líquido-líquido (LLE – liquid-liquid 
extraction) é amplamente aceita e utilizada como técnica 
de preparo de amostras para a análise de fármacos em 
fluidos biológicos como a urina e o plasma. Apesar de 
esta técnica oferecer alta reprodutibilidade, ela demanda 
tempo e trabalho laboratorial intenso, apresenta 
tendência à formação de emulsão, tem baixo potencial 
de automação e requer o uso de grande volume de 
solventes de alta pureza, o que a torna cara e tóxica, com 
a produção de perigosos resíduos laboratoriais[6]. Embora 
a extração em fase sólida (SPE – solid phase extraction) 
consuma menos tempo do que a LLE, esta ainda utiliza 
altas quantidades de solventes[7] e os cartuchos são caros 
e pouco reprodutíveis devido às diferenças entre os lotes 
de adsorventes. Portanto, sua otimização nem sempre é 
um procedimento simples[8].
Já a microextração em fase sólida (SPME – solid 
phase microextraction) é uma técnica de extração rápida 
e livre de solventes que tem sido amplamente utilizada 
para a extração de compostos orgânicos, contudo 
apresenta como potenciais problemas o alto custo, o 
efeito memória (carry over) se houver a reutilização 
das fibras e um declínio no desempenho da fibra com o 
tempo[7].
Na última década, esforços foram realizados 
visando o desenvolvimento de técnicas de preparo de 
amostra eficientes, rápidas e econômicas[4] e conside-
rando o atual enfoque na química verde, uma tendência 
no tratamento de amostras envolve a miniaturização da 
LLE, por reduzir significativamente a proporção entre o 
volume do solvente e o volume da fase aquosa, levando 
ao desenvolvimento de técnicas de microextração em fase 
líquida, como a LPME – liquid phase microextraction). 
Neste contexto, diferentes técnicas de LPME têm 
sido exploradas como alternativas aos métodos 
convencionais, como a microextração em gota suspensa 
(SDME – single drop microextraction), a microextração 
em fase líquida com fibra oca (HF-LPME - hollow fiber 
- liquid phase microextraction), a extração sortiva em 
barra de agitação (SBSE – stir bar sorptive extraction) 
e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME – 
dispersive liquid–liquid microextraction[7], sendo que a 
última tem representado a maior porcentagem (59,4%) 
das publicações na área de LPME[9].
2. DLLME
A DLLME é uma técnica de microextração, 
desenvolvida por Rezaee et al. em 2006[3] para 
a determinação de hidrocarbonetos policíclicos 
aromáticos em amostras de água. Consiste no equilíbrio 
de distribuição do analito entre as fases doadora 
(amostra) e aceptora (solvente orgânico) e é ideal para 
a extração de compostos com propriedades lipofílicas 
moderadas a altas ou que possam ter seu coeficiente 
de distribuição (log D) alterado pelo controle do pH 
(analitos ionizáveis)[2].
A maioria das técnicas de LPME necessita de 
um tempo longo para alcançar o estado de equilíbrio, 
devido à pequena área de contato entre a amostra e o 
solvente extrator, o que afeta de forma negativa os 
fatores de enriquecimento. A DLLME supera essas 
limitações[10], já que o estado de equilíbrio é alcançado 
rapidamente, devido à utilização de um sistema ternário 
de solventes (amostra aquosa, solvente dispersor e 
solvente extrator), o que torna a extração independente 
do tempo. A razão entre o volume de fase aceptora e 
de fase doadora é da ordem de microlitros e mililitros, 
respectivamente, o que permite a obtenção de altos 
valores de enriquecimento[2,11-13].
Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM DLLME: inovações e aplicações biológicas
188 Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204
O fator de enriquecimento e a recuperação são 
parâmetros utilizados para demonstrar a eficiência 
da extração e podem ser calculados utilizando-se as 
equações 1 e 2, respectivamente[11].
O fator de enriquecimentopode ser definido 
como a razão entre a concentração do analito na fase 
sedimentada (C
sed
) e a concentração inicial do analito na 
amostra (C
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).
EF C
C
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Já a recuperação (R) é definida como a quantidade 
do analito, em porcentagem, que é transferida para a fase 
aceptora ao final da extração e pode ser calculada pela 
equação 2, na qual V
sed
 e V
aq
 são os volumes da fase 
sedimentada e da amostra, respectivamente.
R
C V
C V
sed sed
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×
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A Figura 1 mostra o procedimento para a realização 
da técnica. O solvente extrator e o solvente dispersor 
são injetados rapidamente na amostra aquosa com o 
auxílio de uma microseringa (A). A injeção da mistura 
forma uma solução turva (B). Após a centrifugação, as 
gotículas do solvente extrator se depositam no fundo do 
tubo (C) e são retiradas com uma microsseringa (D) para 
posterior análise (E)[2,3,14,15].
3. Fatores que influenciam a eficiência da 
extração por DLLME
Alguns fatores podem afetar a eficiência desta 
microextração: o tipo de solvente extrator e dispersor 
escolhido, o volume de solvente extrator e dispersor 
utilizado, o pH da amostra e sua força iônica[3,11,16,17] e 
o tempo de extração[2] (Figura 2). Alguns trabalhos 
também analisam a influência do tempo de centrifugação 
e da velocidade de centrifugação[18,19].
Na DLLME convencional, o solvente extrator 
deve satisfazer algumas condições como ser imiscível 
na amostra (fase doadora), ter maior densidade que esta 
e possuir alta capacidade de extração do composto de 
interesse[2,20]. Entre os solventes mais utilizados como 
extratores estão os hidrocarbonetos halogenados como 
clorofórmio, diclorometano, clorobenzeno, tetracloreto 
de carbono e tetracloroetileno[2,11-13]. Estes solventes 
Figura 1. Procedimento para realização da DLLME.
DLLME: inovações e aplicações biológicas Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM
Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 189
podem ser substituídos por líquidos iônicos, que além de 
menos tóxicos, podem ser injetados diluídos no sistema 
analítico (HPLC)[21,22]. A seleção do solvente extrator 
apropriado é o parâmetro mais importante desta técnica 
de extração[2] e, na prática, ele representa cerca de 1-3% 
do volume total da mistura de solventes utilizada[23]. Em 
relação ao volume de solvente extrator, o aumento do 
volume deste solvente promove aumento do volume da 
fase sedimentada[3] e, embora a recuperação permaneça 
quase constante, o fator de enriquecimento poderá 
diminuir, levando a perdas na detectabilidade dos analitos 
de interesse. Geralmente são utilizados de 5-100 µL[2].
O solvente dispersor, por sua vez, tem como 
principal característica ser solúvel tanto na fase doadora 
quanto na fase aceptora. A seleção apropriada deste 
promove o aumento na eficiência de extração, pois 
favorece a dispersão do solvente extrator na forma de 
pequenas gotículas na amostra, de modo que a área 
superficial do solvente extrator em contato com a 
amostra contendo o analito seja infinitamente grande. Os 
solventes dispersores comumente utilizados são: metanol, 
etanol, acetonitrila, acetona e tetraidrofurano[2,11-13,24]. 
O volume de solvente dispersor afeta diretamente a 
formação da solução turva e, consequentemente, a 
eficiência da extração. Também foi constatado que 
variações no seu volume leva a alterações no volume 
de fase sedimentada[16]. Nos trabalhos de Yan et al.[24,25] 
e de Farajzadeh et al.[24,25] foi observado que o aumento 
do volume de solvente dispersor promoveu o aumento 
da solubilidade do solvente extrator na amostra com 
consequente diminuição do volume de fase sedimentada. 
Normalmente são usados de 0,5-1,5 mL de solvente 
dispersor[2]. 
O pH da amostra é um parâmetro essencial 
porque afeta tanto a eficiência da extração como a 
seletividade da DLLME[26]. Usando como exemplo 
analitos básicos, é necessário manter o pH da amostra 
acima do valor de pKa, para que eles fiquem na forma 
não ionizada, aumentando assim, a tendência de serem 
extraídos pelo solvente extrator[27,28]. No trabalho de 
Melwanki et al.[20], por exemplo, foi necessária a adição 
de amônia na amostra de urina para facilitar a partição 
do 7-aminoflunitrazepam para o solvente extrator com o 
objetivo de melhorar a recuperação.
Outro parâmetro de interesse é a força iônica 
da amostra. A adição de sal pode promover melhora 
no rendimento da extração[29] devido à diminuição 
da solubilidade dos compostos de interesse na fase 
aquosa e aumento de sua transferência para a fase 
orgânica[11], fenômeno denominado de salting out, no 
qual moléculas de água formam esferas de hidratação ao 
redor das moléculas do sal dissociadas, com consequente 
diminuição da concentração de água disponível para 
dissolver as moléculas do analito[20]. Contudo, essa 
adição também promove redução na solubilidade do 
solvente extrator na amostra, o que promove aumento 
no volume de fase sedimentada e diminuição do fator de 
enriquecimento[29].
Por fim, na DLLME, o tempo de extração é 
definido como o intervalo entre a injeção da mistura dos 
solventes e a centrifugação[17,30]. Como a transferência 
de massa é um processo tempo-dependente, os perfis de 
extração em relação ao tempo devem ser estabelecidos[13]. 
Contudo, como o equilíbrio da extração é alcançado 
Figura 2. Principais parâmetros que afetam a eficiência da DLLME.
Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM DLLME: inovações e aplicações biológicas
190 Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204
rapidamente, vários autores consideram que o tempo não 
é um fator significante para a extração[13,30,31]. 
4. Vantagens e desvantagens
As vantagens desta técnica incluem baixo 
tempo de extração, simplicidade de operação, rapidez, 
baixo custo, alta recuperação do analito e alto fator de 
enriquecimento[2,4,23,30].
As desvantagens são: uso de solventes 
tóxicos[32,33], todo o processo de extração é manual e a 
centrifugação limita o volume de amostra a ser utilizado, 
é a etapa que demanda maior tempo no processo[12,13,15,16,34] 
e dificulta a automação da técnica[10]. No entanto, 
modificações experimentais têm superado muitas destas 
desvantagens[9].
5. Inovações e exemplos de aplicações em 
amostras biológicas
A DLLME representa uma ferramenta importante 
para a análise de matrizes relativamente simples como 
amostras aquosas. Porém, várias publicações já relataram 
seu uso para análise de alimentos, frutas, vegetais assim 
como amostras biológicas e ambientais[35].
Para ilustrar o uso da DLLME em matrizes 
biológicas foi feita uma pesquisa e seleção de trabalhos 
na base de dados Web of Science, considerando o período 
de 2010 a 2014 e utilizando como palavras-chave na 
busca em títulos de trabalhos: “dispersive liquid-liquid 
microextraction” and “urine”, “plasma”, “blood”, 
“serum”, “saliva” e “hair”. Com estas palavras foram 
encontrados um total de 103 artigos (Figura 3). 
As recentes modificações na DLLME encontradas 
na literatura buscaram contornar certas dificuldades e/
ou problemas encontrados inerentes à técnica, como o 
uso de solventes extratores mais densos do que a água, 
que geralmente são solventes halogenados e, portanto, 
tóxicos; aumentar a taxa de transferência do soluto para 
o solvente extrator, entre outros. A Tabela 1 mostra 
algumas aplicações dessas variações da DLLME em 
matrizes biológicas.
A DLLME pode ser classificada em duas 
categorias: DLLME com solventes extratores de alta 
densidade e DLLME com solventes extratores de baixa 
densidade[67].
Figura 3. Pesquisa realizada na base de dados Web of Science relacionando matrizes biológicas e extração por DLLME, no período de 2010 a 2014.
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Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM DLLME: inovações e aplicações biológicas
192 Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204
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Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM DLLME: inovações e aplicações biológicas
194 Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204
Na primeira categoria estão enquadrados:
•	 DLLME utilizando líquidos iônicos (IL-
DLLME – Ionic liquid dispersive liquid–
liquid microextraction). Os líquidos iônicos 
são sais líquidos com pontos de fusão 
perto ou abaixo da temperatura ambiente. 
Eles consistem geralmente de um cátion 
orgânico de nitrogênio ou fósforo que é 
contrabalanceado por um ânion orgânico ou 
inorgânico e possuem propriedades únicas 
tais como pressão de vapor negligenciável, 
estabilidade térmica (mesmo em temperaturas 
elevadas)[5], baixa solubilidade em água, 
baixa volatilidade e toxicidade[68]. Devido 
à química verde, seu uso tem aumentado 
em química analítica, principalmente na 
análise de amostras biológicas[5], podendo 
ser utilizados como solventes extratores[69] 
o que permite a substituição dos solventes 
clorados[35], perigosos e tóxicos. Devido à 
alta viscosidade do IL é necessária criteriosa 
otimização da proporção entre os volumes de 
solvente extrator e dispersor[10]. Para melhorar 
a dispersão do IL na amostra foi proposto, por 
Zho et al.[70] o uso do controle da temperatura 
na DLLME. A aplicação em amostras 
biológicas pode ser exemplificada por Sun 
et al.[64] que desenvolveram um método para 
a quantificação de um plastificante e seu 
metabólito em amostras de urina por HPLC-
UV. A mistura de solventes (metanol e 
[C
6
MIM][PF
6
], 350 e 50 µL, respectivamente) 
foi injetada na amostra para a formação da 
dispersão. A seguir, a amostra foi colocada 
em banho maria à 30°C, a dispersão foi se 
desfazendo e a mistura gradualmente tornou-
se límpida, indicando a solubilidade do IL na 
amostra. Após isto, a amostra foi colocada 
em um banho de gelo por 10 minutos e a 
dispersão novamente formada, centrifugada 
e o sedimento recolhido com auxílio de uma 
micro seringa, diluído em metanol e submetido 
à análise por HPLC. O limite de quantificação 
foi de 3,1 µg L-1 e de 10,6 µg L−1, recuperação 
de 97,4 a 112,5%, e fatores de enriquecimento 
de 164 e 115, para o plastificante e metabólito, 
respectivamente.
•	 DLLME utilizando solventes de baixa 
toxicidade (LT-DLLME – low toxicity 
dispersive liquid–liquid microextraction). 
Desenvolvida por Leong et al.[67], esta técnica 
utiliza solventes bromados, iodados e outros 
solventes halogenados como o 1-bromo-3-
metilbutano ao invés dos solventes altamente 
tóxicos normalmente utilizados na DLLME 
convencional. Alguns solventes bromados, 
em particular, são menos tóxicos até mesmo 
quando comparados aos solventes de baixa 
densidade utilizados na DLLME da segunda 
categoria.
Em relação à segunda categoria, DLLME com 
solventes extratores de baixa densidade, são usados 
dispositivos especiais de extração para facilitar a coleta 
do solvente extrator ou um solvente auxiliar para ajuste 
da densidade da mistura de solventes[35]. Como exemplo, 
são citados na literatura:
•	 DLLME com solidificação da gota orgânica 
flutuante (DLLME-SFO – Dispersive liquid–
liquid microextraction based on solidification 
of a floating organic drop). Desenvolvida por 
Leong e Huang[71], é considerada simples, rápida 
e de baixo custo[32] e não necessita utilizar tubos 
especiais para a extração[72]. O solvente extrator 
deve ter ponto de fusão próximo à temperatura 
ambiente, na faixa de 10–30°C, como o 
1-undecanol, o n-hexadecano, o 2-dodecanol, 
o 1-decanol e o difenil éter. Estes solventes são 
de menor toxicidade e menos densos do que a 
água[32,35]. Após a DLLME, o solvente extrator 
fica localizado na região superior do tubo e é 
resfriado pela colocação deste em um banho 
DLLME: inovações e aplicações biológicas Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM
Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 195
de gelo. O solvente solidificado é transferido 
para um frasco adequado e é imediatamente 
retornado ao estado líquido à temperatura 
ambiente, podendo ser diluído ou diretamente 
injetado em um sistema analítico adequado. 
A DLLME-SFO é amplamente aplicada em 
preparo de amostras ambientais e raramente 
aplicada à análise de fármacos em fluidos 
biológicos complexos[44,72]. 
•	 DLLME com solventes de baixa densidade e 
quebra da emulsão com solvente (LDS-SD-
DLLME – low-density-solvent based solvent 
demulsification). Nesta microextração, os 
solventes extrator e dispersor são injetados 
na amostra e a quebra da emulsão é realizada 
pela adição de mais solvente dispersor, que 
agora atua como agente desmulsificante[73]. O 
solvente extrator é coletado da fase superior 
e analisado. A extração requer dois a três 
minutos e não necessita de centrifugação, 
portanto, é mais rápida que a DLLME 
convencional[67]. Como solventes extratores 
podem ser avaliados: 1-octanol, n-hexano, 
tolueno, cicloexano e orto-xileno[73].Além disso, várias técnicas de dispersão podem 
ser utilizadas, modificando a DLLME convencional[67]
(Figura 4):
A) Microextração liquido-líquido assistida por 
ar (AALLME – air-assisted liquid–liquid 
microextraction). É uma nova versão da 
DLLME na qual alguns microlitros de solvente 
extrator são transferidos para a amostra 
aquosa presente em um tubo de fundo cônico 
e a mistura (solvente extrator e amostra) é 
repetidamente sugada e injetada para dentro 
do tubo com o auxílio de uma seringa de vidro. 
Após a realização de ciclos pré-determinados, 
a mistura é centrifugada e a fase orgânica é 
coletada para análise[67,74]. Nesta extração o 
solvente dispersor não é utilizado e a dimensão 
da agulha da seringa é um parâmetro a ser 
avaliado[74]. No trabalho de Farajzadeh et al.[74], 
esta variação foi aplicada para a quantificação 
de ftalato de ésteres em amostras de leite de 
vaca. 
B) DLLME utilizando tensoativos (SA-DLLME 
– surfactant-assisted dispersive liquid–liquid 
microextraction). Neste caso, o tensoativo 
é utilizado como solvente dispersor, pois 
também apresenta solubilidade em ambas as 
fases (orgânica e aquosa) e também diminui a 
tensão interfacial entre elas. A sua concentração 
é um importante parâmetro para uma extração 
efetiva, pois concentrações superiores à 
concentração micelar crítica promovem a 
diminuição da recuperação do composto de 
interesse por aumentar a solubilidade deste 
na amostra[57]. Uma das maiores desvantagens 
da SA-DLLME é que um pouco do tensoativo 
também pode ser extraído da amostra aquosa, 
junto com o solvente extrator, o que pode 
limitar a escolha do sistema de detecção[67]. 
No trabalho de Behbahani et al.[57], foi feita a 
quantificação da carbamazepina e zonisamida 
em urina e plasma por HPLC-UV, utilizando 
a SA-DLLME. Foram utilizados o CTAB 
Figura 4. Técnicas de dispersão utilizadas na DLLME assistida.
Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM DLLME: inovações e aplicações biológicas
196 Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204
como agente emulsificante e 1-octanol como 
solvente extrator, que após misturados foram 
injetados rapidamente no tubo contendo a 
amostra. O método foi preciso e exato, sendo 
obtidos altos valores de recuperação e de fator 
de enriquecimento. 
C) DLLME assistida por ultrassom (UA-DLLME 
– Ultrasound-assisted dispersive liquid–liquid 
microextraction). Tem sido a mais utilizada 
entre as técnicas de dispersão[29]. O ultrassom 
pode acelerar a formação de uma solução turva 
fina, aumentando a eficiência de extração[60], 
porém, o tempo necessário para a extração 
é superior ao da DLLME convencional e 
a degradação do analito pode ocorrer sob 
certas condições[75]. Em contrapartida, tem-se 
redução no consumo de solventes[67] e melhora 
na eficiência da extração[72]. Um procedimento 
clássico dessa variação pode ser exemplificado 
por Fernandez et al.[50], que usaram 0,5 mL de 
urina contendo 7 benzodiazepínicos e análise 
por UPLC-UV. A extração foi realizada 
usando 1,5 mL de acetona (solvente dispersor) 
e 160 µL de clorofórmio (solvente extrator). A 
mistura (amostra + solventes) foi submetida à 
ultrassonicação por 4,5 minutos e observada a 
formação das gotículas dispersas. Em seguida 
foi feita a centrifugação e a fase sedimentada 
foi recuperada com auxílio de uma seringa. 
A extração foi parcialmente desenvolvida 
com auxílio da metodologia de superfície de 
resposta usando design de Doehlert e atingiu 
limite de quantificação na faixa de 1,8 a 7,4 ng 
mL−1, com recuperação de 96 a 114%.
D) DLLME assistida por vórtex (VALLME – 
vortex-assisted liquid–liquid microextraction). 
Assim como o uso de ultrassom, o uso de 
vórtex reduz o consumo de solventes[67] e 
melhora a eficiência da extração[72]. O trabalho 
realizado por Alshana et al.[32] determinou 
bisfenol A, o principal composto de resinas e 
policarbonato, caracterizado como disrruptor 
endócrino, em amostras de urina por CE-
UV. Os tubos contendo a amostra e solventes 
extrator e dispersor (1-undecanol e acetona, 
respectivamente) foram submetidos à agitação 
em vórtex por um minuto e foi observada a 
formação da suspensão dos componentes. O 
tubo foi centrifugado e levado ao freezer à 
–20°C onde, após 5 minutos, a gota orgânica 
flutuante solidificou-se e posteriormente foi 
separada. Em seguida, a gota solidificada se 
liquefez, à temperatura ambiente, e foi realizada 
a análise por CE. Os autores destacam rapidez 
no tempo de extração (2 minutos), baixo limite 
de quantificação e baixos valores de coeficiente 
de variação (1,9%) quando comparado às 
outras microtécnicas de extração, como SPME 
e SDME.
E) DLLME assistida por micro-ondas (MA-
DLLME – microwave-assisted dispersive 
liquid-liquid microextraction)[67]. Assim como 
a SA-DLLME, a MA-DLLME também tem 
sido pouco utilizada. Neste caso, os efeitos do 
tempo e da potência do micro-ondas devem 
ser analisados, pois a degradação dos analitos 
devido a irradiação pode ocorrer, o que pode 
promover a diminuição da recuperação[76]. 
Em 2011, Xu et al.[66] fizeram o uso desta 
técnica associada ao uso de IL para a extração 
de sulfonamidas em várias matrizes. Foi 
observado que a temperatura, fortemente 
relacionada com o tempo de irradiação e 
potência utilizada, pode afetar a transferência 
de massa dos analitos e a área de contato 
entre o solvente extrator e a solução aquosa. 
Além disso, o aumento do tempo de extração 
contribuiu para a diminuição da viscosidade do 
IL e para a transferência de massa.
F) DLLME assistida por agitação manual. Pode 
ser realizada para dispersão e extração ou como 
um passo de pré-mistura antes da extração[67]. 
DLLME: inovações e aplicações biológicas Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM
Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 197
Chung et al.[77] utilizaram agitação manual 
previamente à DLLME com uso de ultrassom 
e verificaram que a agitação manual contribui 
para garantir que todos os analitos estejam 
dispersos na amostra, aumentando a eficiência 
da extração e sua precisão, já que todos os 
analitos tem a mesma probabilidade de entrar 
em contato com o solvente extrator. Aplicações 
da DLLME por agitação manual são bastante 
empregadas[37-39,41,46,54,78]. Um dos trabalhos que 
usa este tipo de DLLME é o de Vela-Soria 
et al.[78]. Nele, os autores quantificaram 14 
disrruptores endócrinos em amostras de urina 
por CG-MS. A mistura de solvente dispersor 
(acetona) e extrator (triclorometano) foi 
adicionada à amostra e realizada a agitação 
manual por 10 segundos. A seguir, a amostra 
foi centrifugada e a fase orgânica recolhida 
com auxílio de uma seringa. Foram obtidos 
valores de recuperação na faixa de 94 a 105%, 
e limites de quantificação na faixa de 0,2 a 
0,5 ng mL-1. 
Alguns trabalhos utilizam ainda associações 
entre as variações da DLLME, como, por exemplo, 
Rajabi et al.[33] que fizeram uso de ultrassom com IL e 
controle de temperatura para realizar a quantificação de 
anetol, estagol e para-anisaldeído em amostras de urina 
por HPLC-UV. No método desenvolvido, a amostra de 
urina foi colocada em um tubo previamente contendo 
o IL [C
6
MIM][PF
6
] e uma barra magnética. O tubo foi 
aquecido em banho-maria a 70°C por 2 minutos. Nesta 
fase, o calor causa a dispersão do IL na amostra. Em 
seguida, o tubo foi colocado em banho ultrassônico 
contendo água gelada por 4 minutos, o que levou à 
formação do ponto nuvem novamente. Em seguida, o 
tubo foi centrifugado e a fase sedimentada coletada para 
posterior análise.
6. Delineamento experimental
Recentemente, vários trabalhos envolvendo a 
DLLME tem utilizado um delineamento experimental 
com duas etapas - delineamento Plackett–Burman (PBD 
– Plackett–Burman design) seguido de delineamento 
composto central (CCD – central composite design) para 
a determinação das condições experimentais. O PBD é 
utilizado para analisar de forma rápida quais as principais 
variáveis que afetam a recuperação da extração[18], 
enquanto que o CCD é utilizado para determinar as 
condiçõesótimas para os fatores considerados críticos 
nesta extração[79].
7. Pré-tratamento de amostras biológicas 
submetidas à DLLME
Quando se trata da extração de analitos em 
matrizes biológicas, as quais são altamente complexas, 
muitas vezes faz-se necessário um pré-tratamento 
da amostra. Entre esses procedimentos adicionais e 
compatíveis com a DLLME, especialmente quando 
a matriz é o plasma ou soro, está a precipitação de 
proteínas. Este procedimento é necessário para reduzir os 
interferentes da matriz e evitar o entupimento da coluna 
cromatográfica[56]. Um das maneiras mais utilizadas para 
a precipitação de proteínas consiste no uso de acetonitrila 
gelada ou à temperatura ambiente, acetona[45,46], álcoois 
como metanol ou etanol[61], ácidos como o tricloroacético 
10%[40,61] ou 30%[53], clorídrico 6 M[55,56], sulfúrico, 
fórmico ou acético[56], ou mistura de solução de sulfato 
de zinco a 15% (p/v) com acetonitrila[56,61]. Entretanto, 
em todos estes procedimentos o sobrenadante deve 
ser compatível com o procedimento de extração. Por 
exemplo, Tarazona et al.[55] relatam que quando a 
precipitação de proteínas foi feita com acetonitrila, não foi 
observada a formação do ponto nuvem quando a mistura 
de solventes extrator e dispersor foi injetada na solução. 
Xiao et al.[58] descrevem que, após realizar a DLLME 
com IL, foi necessário realizar uma back extraction 
para recuperar os analitos que estavam no IL para a fase 
aquosa e posterior injeção no sistema cromatográfico. 
Huang et al.[80] relatam que quando a DLLME é usada 
com CE, é necessário evaporar o solvente de extração 
e reconstituir o resíduo em meio adequado para evitar 
a queda da corrente elétrica no início da análise. Para a 
Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM DLLME: inovações e aplicações biológicas
198 Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204
remoção de lipídeos, normalmente é realizada uma etapa 
de filtração do sobrenadante, após centrifugação, com 
filtro de 0,45 µm[44,81] e posterior DLLME.
Quando a matriz é urina, grande parte dos trabalhos 
descritos na literatura realiza apenas uma centrifugação, 
usando o sobrenadante para as análises[44,47,48,51,82]. Shi 
et al.[40] adicionaram à urina ácido tricloroacético 10% 
e, em seguida, foi realizada filtração em membrana de 
0,45 µm. Já Shamsipur e Mirmohammadi[38] realizaram 
ultrassonicação das amostras de urina ao observarem um 
depósito lipídico no fundo do tubo. Em contrapartida, 
tecidos sólidos como fígado[49,83], cérebro[52], por exemplo, 
requerem procedimentos mais longos, dispendiosos e 
específicos. 
A Figura 5 mostra uma amostra de 5 mL de urina 
(A) que foi submetida à DLLME, com consequente 
formação de uma solução turva (B) após a adição dos 
solventes extrator e dispersor e a separação do solvente 
extrator no fundo do tubo cônico após a centrifugação 
(C). 
8. DLLME associada a outras técnicas de 
extração
Além das recentes modificações inclusas na 
DLLME, tem-se empregado a mesma em associação com 
outras técnicas de extração, tais como SPE[84,85], MIP[86,87] 
e eletromembrana[43]. Mashayekhi et al.[84] relatam que 
a associação de SPE-DLLME é uma técnica hifenada 
eficiente, que oferece as vantagens de ambos os métodos 
tais como simplicidade, baixo consumo e exposição a 
solventes, baixos custo e tempo de extração com altos 
valores de recuperação e fatores de enriquecimento. 
Neste caso, o eluente da SPE foi usado como solvente 
dispersor para a DLLME, realizada posteriormente, para 
a extração de ecstasy e anfetaminas em urina e análise 
por cromatografia gasosa.
9. Conclusões e perspectivas
Figura 5. Uso da DLLME em amostras biológicas.
DLLME: inovações e aplicações biológicas Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM
Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 199
A DLLME foi inicialmente delineada para a 
extração de compostos em amostras aquosas e, portanto, 
a aplicação da mesma esteve voltada majoritariamente 
para a análise de resíduos de medicamentos, pesticidas, 
entre outros, em água. Desde o primeiro trabalho de 
Rezaee, em 2006[88], até o momento atual, muitas 
inovações foram trazidas para a DLLME. No entanto, 
nem todas foram aplicadas ainda às matrizes biológicas. 
Alguns exemplos são a supramolecular-based-DLLME, 
partitioned dispersive liquid-liquid microextraction 
(PDLLME), entre outras[88].
As matrizes biológicas são extremamente 
complexas e podem conter interferentes como lipídeos, 
fosfolipídeos, proteínas, hormônios e minerais. Uma 
das matrizes mais utilizadas é o plasma, o qual possui 
alta viscosidade e, portanto, esta característica pode 
interferir na dispersão dos solventes extrator e dispersor 
na amostra quando a DLLME é utilizada. Desta forma, 
é necessário realizar algum pré-tratamento para que seja 
possível conduzir qualquer procedimento de preparo de 
amostra e minimizar a presença de interferentes. 
Uma das tendências da DLLME é a melhora na 
seletividade pela associação de diferentes técnicas de 
preparo de amostra, como discutido nesta revisão. Apesar 
das vantagens da DLLME, uma grande desvantagem 
é a dificuldade na automação. Nesse sentido, alguns 
avanços têm sido avaliados, porém, ainda não aplicados 
às amostras biológicas[29,89]. Assim, espera-se que 
futuramente ainda menos solventes e em menor volume 
sejam usados, e que sejam desenvolvidos outros modos 
que simplifiquem a DLLME reduzindo ainda mais o 
tempo e o custo, além de torná-la uma técnica high-
throughput.
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