Roteiro prática Gram 2

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ROTEIRO DE AULA PRÁTICA 2 – Manobras Assépticas e Técnicas de coloração bacteriana
Unidade Curricular: Mecanismos de Agressão e Defesa II
Manobras Assépticas 
Objetivos: Capacitar o aluno a realizar manobras assépticas a fim de desenvolver as práticas e habilidades referentes ao manuseio de microrganismos e meios de cultura. Para tanto o estudante deve: 
1. Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais frequente em microbiologia. 
2. Descrever as principais técnicas de manobras assépticas. 
3. Desenvolver habilidade de manipular tubos contendo meios estéreis, assim como transferir microrganismos de meio sólido para meios sólido e líquido. 
Avaliação: Postura e respeito ao grupo e professor. Execução de todas as etapas do roteiro. Realização de aula prática. 
Introdução 
As manobras assépticas são técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde estes não são desejados, ou seja, garantem a boa assepsia. Estas impedirão que microrganismos presentes no ar ou depositados sobre as diversas superfícies com a poeira, venham a contaminar materiais estéreis do laboratório como meios de cultura, soluções e equipamentos ou, ainda, culturas puras de microrganismos. Também impedem que os microrganismos com que estamos trabalhando nos contaminem ou ao ambiente. 
As técnicas referentes à manipulação de culturas envolvem basicamente: 
Trabalhar em áreas submetidas previamente a limpeza e desinfecção, para reduzir o número de potenciais micro-organismos contaminantes. 
Trabalhar dentro da “zona de segurança” do bico de Bunsen, ou seja, os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, pipetas, etc) com meio de cultura devem ser abertos o mais próximo possível da chama do bico (uma área de 10 cm ao redor da chama do Bico de Bunsen) sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras. 
Flambar ao rubro alça ou agulha antes e após cada inoculação. 
Deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo, dentro da zona de segurança, preferencialmente na parte interna do recipiente que contém o meio de cultura. 
Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo microrganismos ou meio estéril, imediatamente após abri-los, ou antes de fechá-los. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação. 
Desembrulhar a pipeta estéril dentro da zona de segurança, flambá-la rapidamente e mantê-la nesta região durante todo o trabalho. 
Área de segurança para trabalhar com o Bico de Bulsen
1. A partir de cultura em caldo: 
A partir de um crescimento obtido em caldo, realizar a seguinte inoculação: 
Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inoculo para o tubo com caldo, através da técnica de difusão. 
Técnica de Difusão
Transferir caldo estéril para tubos previamente esterilizados 
Distribuir meio de caldo simples estéril, contido em um tubo identificado (3ml), para outro tubo vazio estéril (3ml), usando pipeta estéril de 5mL. (Atenção! Este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen) e usar o pipetador (nunca pipete com a boca). Repetir quando a técnica não se mostrar adequada. Incubar os tubos inoculados à temperatura de 37C, por no mínimo, 48 horas. (Fazer com 2 tubos) 
Transferir uma porção do crescimento de uma determinada cepa bacteriana padrão ATCC (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, etc) crescida em tubo de ágar triptona e soja inclinado para outro meio idêntico – Procedimento definido como Repique 
a. Retirar, com uma alça previamente flambada, um inóculo da amostra; 
b. Introduzir a alça sobre a superfície do ágar inclinado novo, até a base do mesmo. Fazer estrias em direção à boca do tubo, sobre a superfície inclinada até aproximadamente ¾ de sua extensão. A superfície inclinada do ágar, no momento da inoculação, deve ficar voltada para cima, com a mão do operador por baixo do tubo, de modo que a superfície possa ser vista sem dificuldade. 
c. Incubar o tubo à temperatura de 37°C por, no mínimo, 48 horas. 
Transferir uma porção do crescimento de uma determinada cepa bacteriana (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, etc) crescida em tubo de ágar triptona e soja inclinado para uma placa de cultura.
a. Retirar, com uma alça previamente flambada, um inoculo da amostra; 
b. Com auxílio de alça bacteriológica, fazendo estrias de esgotamento na placa.
c. Incubar a placa à temperatura de 37 °C por, no mínimo, 48 horas. 
Diferentes técnicas de inoculação em meios de cultura
Técnicas de Coloração Bacteriana 
Objetivos: Capacitar o aluno a realizar e interpretar diferentes colorações para avaliação das propriedades tintoriais bacterianas 
Avaliação: Postura e respeito ao grupo e professor. Execução de todas as etapas do roteiro. Realização de aula prática. 
Introdução 
O microscópio óptico é o mais utilizado para observação de micro-organismos. No entanto, a observação de material biológico neste tipo de equipamento exige a utilização de métodos de coloração. A preparação de lâminas contendo os microrganismos a serem analisados precede a coloração. Estes são, na maioria das vezes, colocados sobre as lâminas de maneira concentrada, formando um esfregaço. 
A - Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio Sólido: 
1. Com a alça de platina estéril, transferir de forma asséptica uma gota de solução salina estéril para a lâmina; 
2. Flambar a alça corretamente; 
3. Esfriá-la na solução salina estéril ou no meio sólido (região sem colônias). 
4. Coletar 1 colônia e transferir para a pequena gota de solução salina estéril na lâmina. Espalhar bem com movimentos suaves evitando a quebra dos agrupamentos bacterianos; 
5. Secar a temperatura ambiente; 
6. Após o esfregaço ficar completamente seco, com auxílio da pinça de madeira, fixá-lo na chama do bico de Bunsen, passando a lâmina 2 a 3 vezes pela chama; evitando que os micro-organismos sejam perdidos durante as colorações e sucessivas lavagens. 
7. Realizar a coloração. 
B - Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio Líquido: 
1. Flambar a alça corretamente; 
2. Esfriá-la nas paredes do tubo ou na solução salina estéril; 
3. Introduzir a alça no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça; 
4. Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca; 
5. Espalhar o material sobre a lâmina, procurando obter um esfregaço fino; 
6. Secar a temperatura ambiente; 
7. Após o esfregaço ficar completamente seco, com auxílio da pinça de madeira, fixá-lo na chama do bico de Bunsen, passando a lâmina 2 a 3 vezes pela chama; aguardar até o resfriamento da lâmina. 
8. Realizar a coloração. 
Coloração diferencial 
Neste tipo de coloração, são empregados dois corantes contrastantes, que vão gerar colorações diferentes em grupos distintos de bactérias. As colorações diferenciais são utilizadas para: 
separar diferentes grupos de bactérias: coloração de Gram e de resistência ao álcool-ácido (Ziehl-Neelsen); 
1. Coloração de Gram 
1 – Acender o bico de Bunsen. 
2 – Preparar o esfregaço com o auxílio de um swab estéril descartável, pegar a amostra biológica e espalhar sobre a lâmina de vidro limpa. O esfregaço não pode ser espesso 
3 – Aguardar a secagem da lâmina em temperatura ambiente. 
4 – Fixar o esfregaço passando a lâmina 3 a 5 vezes sobre a chama (passar rapidamente sobre a chama). 
5 – Colocar a lâmina no suporte de coloração. 
6 – Cobrir o esfregaço com cristal violeta e aguardar 1 minuto. 
7 – Após, lavar a lâmina em água corrente e cobrir o esfregaço com solução de lugol durante 1 minuto. 
8 – Lavar o esfregaço em água corrente. 
9 – Descorar com álcool-acetona durante 3 a 5 segundos. Imediatamente, após 3 a 5 segundos, lavar o esfregaço em água corrente. 
10 – Cobrir o esfregaço com o corante fucsina ou safranina durante 30 segundos. 
11 – Lavar o esfregaço em água corrente. 
12 – Secar o esfregaço. 
13 – Observar o material em microscópio no aumento de 1.000 vezes (objetiva de 100 vezes com óleo de imersão).Gram positivas Gram negativas
2 - Coloração para Álcool-Ácido-Resistentes 
Este método de coloração é usado para identificação de bactérias como Mycobacterium, Nocardia e Rhococcus. Esta coloração é utilizada como técnica diagnóstica para tuberculose, causada pelo Mycobacterium tuberculosis e outras espécies, e também para identificar Mycobacterium leprae, agente causador de hanseníase. O diagnóstico de tuberculose, em qualquer dos casos de origem pulmonar, se faz pelo exame do escarro, corando-se pela técnica de Ziehl Neelsen, seguido de cultivo em meios específicos como Löwenstein-Jensen, ou Middlebrook 7H10 e identificação por métodos bioquímicos especiais. Recentemente, também está sendo empregado o PCR. 
As micobactérias são revestidas por um material lipídico e espesso (ácido micólico), que resiste à coloração; entretanto, uma vez corado este material resiste à descoloração com solventes orgânicos fortes, tais como o álcool-ácido. 
Técnica de Ziehl-Neelsen 
1 - Cobrir um esfregaço, seco e fixado pelo calor, com o corante carbolfucsina. 
2 - Aquecer a lâmina até que se desprendam vapores (o corante não deve entrar em ebulição). Deixar por 5 minutos. 
3 - Lavar o excesso de corante com água destilada e descorar com álcool-ácido (97% álcool absoluto e 3% HCl) até que não aparece mais corante na lâmina. 
4- Fazer a coloração de contraste com azul de metileno (1-2 minutos). 
5 - Lavar o excesso de corante, escorrer e secar ao ar. 
6 – Examinar com objetiva de 100 x, com imersão em óleo. As micobactérias ficam coradas em vermelho e o fundo em azul.