APS HPLC 3 SEMESTRE

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1. INTRODUÇÃO 
 
A cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE ou também conhecida com a 
sigla HPLC (High Performance Liquid Cromatography) faz parte do grupo de 
classificação da cromatografia colunar. Essa técnica cromatográfica normalmente é 
empregada em amostras de alimentos, água, solo, sangue, urina, entre outros. 
Técnica utilizada na separação de vários componentes de uma mistura de 
substâncias que possuem duas fases (uma estacionária e outr1a móvel), seu objetivo 
é identificar esses componentes, quantifica-los ou purifica-los. É utilizada em análises 
de compostos não voláteis ou instáveis termicamente, onde a cromatografia a gás não 
pode ser utilizada. 
A fase estacionária é constituída de partículas sólidas, ou um líquido retido 
sobre um sólido ou um gel, empacotadas em uma coluna, que é atravessada pela fase 
móvel líquida. São as forças físicas e químicas que atuam entre os solutos e as duas 
fases que são responsáveis pela retenção dos solutos sobre a coluna cromatográfica. 
 
2. EQUIPAMENTOS 
 
A figura abaixo, representa um esquema dos componentes de um HPLC: 
 
 
 Figura 1 – Componentes do equipamento. (Adaptado de:https://www.forumsci.il/HPLC/system.gig) 
 
 
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• Reservatório de fase – Recipiente contendo a fase móvel que será bombeada 
para dentro do equipamento; 
• Sistema de bombeamento de fase móvel – transferência da fase móvel de 
reservatório para a coluna. 
• Sistema de injeção - Realiza a injeção da amostra no sistema com precisão e 
exatidão adequada; 
• Sistema analítico: coluna cromatográfica – Onde está presente a fase 
estacionária, no qual acontece a separação; 
• Sistema de detecção – Dispositivo conectado na saída da coluna onde emite 
um sinal elétrico, o qual é registrado de maneira continua a composição do eluente, 
gerando um cromatograma; 
• Sistema de controle, aquisição e registro de dados. 
 
2.1 Princípio de Funcionamento 
 
Na fase estacionária podem ser utilizados compostos sólidos ou líquidos. Os 
sólidos normalmente são substâncias absorventes, tais como, sílica, carvão ativo, etc., 
que se encontram “empacotadas” em uma coluna, a qual é atravessada pela fase 
móvel. Nesse caso a base para a separação de misturas é chamada de absorção. 
Já o composto líquido da fase estacionárias é denominado de película delgada, 
sendo que nesse caso a base de separação de misturas é denominado de partição 
(As moléculas dos componentes a serem separados se distribuem em fase 
estacionária ligada a fase móvel liquida a partir da sua afinidade relativa. Compostos 
com diferentes constantes de partição são separados). 
Na fase móvel emprega-se uma mistura de alguns solventes, por exemplo, 
metanol, acetonitrila e água, sendo que essa mistura é denominada de eluente. 
Normalmente para a fase móvel existem alguns critérios quanto aos solventes, tais 
como: 
• O grau de pureza dos solventes, 
• Baixa viscosidade; 
• Dissolução da amostra sem perca dos compostos; 
• Polaridade adequada para a realização da separação dos componentes da 
amostra. 
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• Quanto a eluição de compostos é importante ressaltar que existem dois tipos 
de eluições: 
• Isocrática: a composição da fase móvel) se apresenta constante durante todo 
o processo de análise. Normalmente se utiliza um tipo de solvente. 
• Gradiente: a composição da fase móvel pode ser alternada durante a 
realização da análise. 
 
2.2 Tipos de Bombeamento 
 
Características: 
• Alta resistência à corrosão e alta exatidão; 
• A vazão deve ser constante independentemente da pressão, sem pulso e 
contínua. A vazão constante é essencial para qualquer separação HPLC. A alta 
pressão é necessária para impulsionar o solvente através da coluna cromatográfica, 
vencendo a resistência da fase estacionária. 
Tipos: 
• Isocrático: A composição da fase móvel é constante durante toda a análise 
cromatográfica. 
• Gradiente: Algumas análises necessitam alteração da composição da fase 
móvel, sem que ocorra alteração da vazão total, tem por finalidade melhorar a 
separação dos compostos da amostra. 
 
 
Figura 2. Bombeamento por alta pressão: cada solvente tem uma bomba específica. 
 
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Figura 3. Bombeamento por baixa pressão: Utiliza uma bomba e a seleção do solvente é controlada pelo software do 
sistema. 
 
2.3 Tipos de detectores 
 
Os principais detectores utilizados em HPLC são: 
 
 Índice de refração: No momento da passagem do analito pelo detector, pode 
ocorrer uma mudança do índice de refração. A detecção só é possível quando o índice 
de refração do analito é diferente do IR da fase móvel. Esse detector é normalmente 
utilizado quando os analitos não absorvem na região de comprimento de onda do UV-
Visível. Apresenta as seguintes desvantagens: 
• Baixa sensibilidade 
• Não permite a utilização em análises por gradiente (pois o IR varia com a 
composição da fase móvel) 
 • Temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a temperatura) 
Aplicações: Análises de carboidratos e açucares no geral. 
 
Espectrofotometria UV-Visível: Baseia-se na absorbância da luz pelo analito 
ao passar pelo detector. É um detector que só detecta os compostos que absorvem 
no comprimento de onda em que o detector for minunciosamente ajustado. É o 
detector mais utilizado em HPLC pois grande maioria das substâncias absorvem 
radiação UV. 
Exemplos de substâncias são: olefinas, aromáticos, compostos contendo 
ligações C=O, C=S, N=O. 
 
 
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Fluorescência: Empregam uma fonte de excitação de mercúrio e um ou mais 
filtros para isolar a banda de emissão de radiação. É um método sensível, e tem seu 
uso principalmente em produtos que fluorescem como os materiais farmacêuticos, 
amostras clínicas, produtos de petróleo, entre outros. 
 
Eletroquímico: Baseia-se na possibilidade de os compostos serem oxidados 
ou reduzidos quando se aplica um potencial elétrico. Em um processo eletroquímico, 
um par de eletrodos é colocado na cela e um potencial suficientemente elevado é 
aplicado provocando uma reação de oxidação ou redução gerando uma corrente que 
é medida em um detector eletroquímico. A corrente gerada é proporcional a 
concentração do composto. 
 
Espectrometria de massa LC/MS: combina o poder de separação da HPLC 
de materiais de grande peso molecular, com a capacidade da MS para detectar 
seletivamente e confirmar a identidade molecular. As principais aplicações são na 
pesquisa farmacêutica, análise ambiental, análise de alimentos e medicina forense. 
 
 
3. CROMATOGRAMA 
 
Um cromatograma é um gráfico de que representa a resposta do detector como 
função do tempo de eluição. Sendo útil para as análises qualitativas e quantitativas. 
(SKOOG, WEST, HOLLER, & CROUCH, 2006) 
A linha de base de um cromatograma, representa a passagem da fase móvel 
através do detector, os picos são obtidos quando os componentes se eluem, o 
detector responde à concentração do soluto posicionado no final da coluna durante a 
eluição e seu sinal é registrado em função do tempo (ou do volume da fase móvel).² 
As posições dos picos no eixo do tempo podem ser empregadas para identificar 
os componentes da amostra e as áreas sob os picos provem uma medida quantitativa 
da quantidade de cada uma das espécies. Quanto mais largo o pico for, maior o tempo 
que uma amostra gasta na coluna. Quando tem mais de um componente é importante 
que os picos estejam simétricos e separados, conforme a figura 4 abaixo. (SKOOG, 
WEST, HOLLER, & CROUCH, 2006) 
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Figura 4 – Disposição dos picos 
 
De acordo com a figura 5, está ilustrando um cromatograma, a distância 
percorrida desde o instante da injeção da amostra no sistema cromatográfico até o 
máximo do pico traçado, representado pela sigla dR e a distância desde a injeção até 
a eluição de um componente que não interage com a fase estacionária, representado 
pela sigla dM. A largura do pico é representada pela sigla wb.² 
 
Figura5. Detalhamento do cromatograma 
 
Uma boa eficiência de um sistema cromatográfico, é definido como a 
capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito, sendo determinada pelo 
número de pratos teóricos, uma camada imaginária dentro de uma coluna que ajuda 
a interpretar o processo de separação, quanto maior o número de pratos teóricos 
maior a eficiência, resultando em uma separação melhor. De acordo, com a figura 6, 
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está ilustrando a eficiência de uma coluna, separando dois componentes diferentes, 
com o mesmo tempo de retenção. ¹ 
 
Figura 6 – Relação entre resolução, seletividade e eficiência 
 
O tempo necessário, para cada componente, após a injeção da mistura na 
coluna até aquele componente alcançar o detector (ápice do pico cromatográfico) é 
definido como tempo de retenção (tR). Já o tempo mínimo para a fase móvel não retida 
percorrer a coluna, compostos que não interagem com a fase estacionária atravessam 
a coluna (tempo morto) é definido como tempo de retenção do composto não-retido 
(tM). E o tempo de retenção ajustado (tR’) é tempo médio que as moléculas do analito 
passam sorvidos na fase estacionária. Na figura 7 está ilustrando os parâmetros de 
retenção de um analito. ³ 
 
 
Figura 7. Parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito 
 
 
 
 
 
 
 
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4. APLICAÇÕES 
 
A cromatografia liquida de alta eficiência, é uma técnica de separação, sendo 
aplicada em métodos analíticos para fins qualitativos e quantitativos, garantindo a 
qualidade dos produtos nos setores alimentares, cosméticos, farmacêuticos, 
ambientais e no âmbito da química industrial, fornecendo informações importantes 
quanto ao tipo de constituintes presentes. 11 
A cromatografia liquida de alta eficiência, possui quatro tipos básicos que 
podem determinar a área da aplicação, com base nos mecanismos de interação, da 
substancia dissolvida com a fase estacionária, são eles: cromatografia de partição, 
onde a fase estacionária é um líquido imiscível com a fase móvel; cromatografia de 
troca iônica, com separação de íons por troca iônica; cromatografia de exclusão por 
tamanho, no qual, separa as moléculas pelo tamanho, com os maiores solutos e 
passando por ela com maior velocidade; e cromatografia de adsorção, que utiliza uma 
fase estacionária sólida e uma fase móvel liquida ou gasosa. 4 
Na indústria farmacêutica, os sistemas de cromatografia são essenciais no 
controle de qualidade dos fármacos, por fazer parte desde o início das pesquisas de 
desenvolvimento ao lançamento do medicamento, para estar em conformidade com 
as normas, legislações e diretrizes pelos órgãos reguladores.10 
Na área farmacêutica, o HPLC, é aplicado em análises de produtos 
farmacêuticos, para a determinação da composição ou formulação, de impurezas, 
purificação de princípio ativo, fingerprint, impressão digital, da farmacocinética, nos 
fármacos, como antibióticos, ácidos nucleicos, vitaminas, sedativos, esteroides e 
analgésicos, conforme a tabela 1 abaixo, demostra as aplicações típicas da 
cromatografia por partição de acordo com o campo.11 
 
 
Tabela 1 – aplicações da cromatografia por partição 4 
 
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As etapas para aplicações do equipamento utilizados nas análises de 
medicamentos, são as seguintes: determinação e purificação dos princípios ativos; 
avaliação de desempenhos (performance) dos fármacos, com testes de 
bioequivalência; e estudos de estabilidade, para definir a validade do produto. Além 
das validações e qualificações de metodologias analíticas.10 
 
5. PRINCIPAIS REPRESENTANTES 
 
Encontram-se no mercado, vários fabricantes e modelos de equipamento de 
cromatografia liquida de alta eficiência, porém cada marca possui uma característica 
diferente, com diferentes detectores, que possam interferir na seletividade e 
sensibilidade das analises, podendo ter, concentrações reduzidas das substancias.10 
Os principais representantes de HPLC, são a Agilent, Waters, Thermo, Merck 
e a Shimadzu, de acordo com a tabela 2, representa as principais características 
oferecidas pelos fabricantes 
 
MARCA CARACTERÍSTICAS 
Agilent  Maior flexibilidade; 
 Simplicidade na operação e manutenção; 
 Análise com maior rapidez 
 Controle de temperaturas, tanto para refrigerar 
amostras, evitando a degradação, quanto para 
preaquecimento, garantindo maior estabilidade do 
tempo de retenção 
 
Waters  O volume de dispersão reduzido, com um volume 
menor, terá maior eficiência do equipamento; 
 Equipamentos robustos e mais tecnológicos; 
 Confiável e reprodutível; 
Merck  Maior pressão de trabalho; 
 O uso de colunas com menor tamanho de partícula; 
 Métodos mais rápidos; 
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 Sistemas de baixa dispersão, possibilitando uma 
melhor separação entre os analitos e maior 
precisão dos resultados; 
 Descontaminação do sistema de amostragem 
otimizado, evitando o aparecimento de picos 
fantasmas, reduzindo a necessidade de reanalisar 
amostras. 
Shimadzu  Aumento da estabilidade e controle da temperatura 
da coluna e detectores; 
 Garantia da alta precisão de validação e testes de 
quantificação; 
 Ampla gama de aplicações; 
 Permite adicionar detectores de fluorescência, 
índice de refração diferencial ou espalhamento de 
luz evaporativo (ELSD). 
Thermo Scientific  Melhores Separações, picos separados; 
 Suporta contrapressões elevadas; 
 Controle de temperatura, volumes otimizados, 
melhor linearidade e sensibilidade para as 
separações críticas; 
 Velocidade na análise, aumentando a 
produtividade e robustez; 
 Simplicidade operacional, recursos automatizados. 
Tabela 2 – representantes e características 10 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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5.1 Especificações 
 
• Volume de injeção 50uL 
• Razão de fluxo 1,0 ml/min 
• Temperatura da coluna 20°C 
• Padrão de calibração em plasma 5x2,5 ml 
Tabela 3. Especificações numéricas 
 
 
 
 
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 
 
O objetivo da cromatografia é separar individualmente os diversos 
componentes de uma mistura, garantindo a qualidade dos produtos. Na indústria 
farmacêutica, os sistemas de cromatografia são essenciais para o controle de 
qualidade dos fármacos, pois, faz parte desde o início das pesquisas de 
desenvolvimento, para que fiquem em conformidade com as normas, legislações e 
diretrizes pelos órgãos reguladores. 
A amostra é dissolvida, introduzida na coluna cromatográfica e preenchida com 
a fase estacionária. Um solvente é bombeado com vazão constante e desloca os 
componentes através da coluna, eles se dividem em duas fases de acordo com sua 
afinidade. Substâncias como mais afinidades pela FE movem-se mais lentamente, 
enquanto as substâncias com menos afinidade movem-se mais rápido. Ao sair da 
coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico que é 
registrado constituindo um cromatograma. Encontramos alguns tipos de detectores no 
HPLC: índice de refração, espectrofotometria UV-Visível, fluorescência, eletroquímica 
e espectro de massas LC/MS. 
Existem no mercados vários fabricantes e modelos de equipamentos de 
cromatografia líquida de alta eficiência, porém cada um possui uma característica 
diferente como maior gama de aplicações, velocidade de análise, simplicidade 
operacional, análises confiáveis, equipamentos mais tecnológicos. Dentre eles temos: 
Agilent, Thermo, Merck entre outros. 
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REFERÊNCIAS 
 
1. COUTRIM, M. X. (14 de 06 de 2016). Fonte: 
<http://professor.ufop.br/sites/default/files/mcoutrim/files/qui346_cromatografia_a_ga
s_10a_a_12a_aula_2016-1.pdf> 
 
2. SENAI. (2006). Cromatografia. São Paulo, Brasil. 
 
3. SILVA, J. C. (2016). Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), 
Instituto de Ciências Exatas - Depto. de Química. Fonte: 
http://www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula-5-Cromatografia_2o-Sem-2016-parte-
1.pdf 
 
4. SKOOG, D. A., WEST, D. M., HOLLER, F. J., & CROUCH, S. R. (2006).Fundamentos de Química Analítica, Tradução da 8ª Edição norte-americana. São 
Paulo: Editora Thomson. 
 
5. BONANHO PERES, TEREZINHA. Noções básicas de cromatografia. 
São Paulo, v64, n.2, p.227-229, jul/dez.,2002 
 
6. C.J. SILVA, JULIO. QUI 070 – Química analítica V Análise instrumental. 
Cromatografia liquida de alta eficiência. Instituto de ciências exatas depto. de química. 
Juiz de fora,2014. 
 
7. M. LANÇAS, FERNANDO. A cromatografia liquida moderna e a 
espectrometria de massas: finalmente compatíveis? Universidade de São Paulo, 
2009. 
 
8. JULIÃO ZOCOLO, GUILHERME. Princípios e aplicações da 
cromatografia líquida de alta eficiência. Araraquara, 15 de setembro de 2012. 
 
9. ARGENTON, AYRTON. Conceitos fundamentais de cromatografia de 
alto desempenho. São José do Rio Preto, 29 de maio de 2010. 
 
10. PORTO, H. S. (2014). HPLC versus UPLC: avaliação de. Coimbra: 
Universidade de Coimbra. 
 
11. VALÉCIO, M. D. Como escolher um HPLC para o controle de qualidade 
na Indústria Farmacêutica. ICQT. Postado em: https://www.ictq.com.br/industria-
farmaceutica. Disponível em: https://www.ictq.com.br/industria-farmaceutica/641-
como-escolher-um-hplc-para-o-controle-de-qualidade-na-industria-farmaceutica. 
Acesso em 20/03/2020.