Laboratorios iiib - Purificação de proteínas

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TRABALHO PRÁTICO Nº3- 
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS 
(FAÇA BOM PROVEITO) 
Princípio Le Chatelier 
 
 
[DATA] 
IPS ESTBARREIRO 
[Endereço da empresa] 
 
i 
 
Abstract 
 
This laboratory activity had as main objective the production and purification of the protein 
of the enzime GFP (Green Fluorescent Protein) 
 In order to carry out a production of the protein were complete cells of Escherichia coli 
which, with a specific recombinant plasmid for the GFP protein, were transformed. The 
recombinant plasmid was introduced into the commercial plasmid appropriate to the type of 
protein using the restriction enzymes Ndel and Xhol to clone the gene. 
This process involved several steps in the purification process of a recombinant protein. 
The date was then divided into 3 parts. 
In the first part it was intended to carry out the purification process of the FrxA protein, 
using the technique of affinity chromatography. In a first step the crude protein extract from the E. 
coli cells, which contained the recombinant plasmid of the GFP protein, was prepared and 
overexpressed the FrxA protein after induction with the compound IPTG, a lactose analogue. 
Affinity chromatography was then performed with a discontinuous amidazole gradient, 
yielding various protein fractions with increasing concentrations of the compound. Next, the 
technique of "Dessalting" or change of buffer was used, by molecular exclusion chromatography 
with a very low cut-off resin, since the excess of imidazole causes the denaturation of the proteins 
in particles of FrxA. At the end of this step the collected fractions and the samples were stored. 
In the second part it was intended to analyze the protein fractions collected during the 
purification chromatographic processes, in order to determine the amount of protein in each 
fraction. A colorimetric method for the determination of the total protein, the BCA (bicinchoninic 
acid) method, was used for quantification. Fractions EB, F1, F2, F3, F4 and F5 were then found to 
have concentrations respectively of, de 2,402mg/ml; 2,252mg/ml; 0,26mg/ml; 0,061mg/ml; 
1,094mg/ml e 1,28mg/ml 
In part C, in order to find the recombinant GFP protein in the fractions and to be able to 
assess the degree of purity, the column eluted fractions were collected by the SDS-PAGE 
electrophoresis technique. Possibly because the protocol is not the most appropriate, the gel did 
not generate good results, nor should human error be excluded, a factor that may have 
fundamentally altered the final result obtained. 
However, a quick analysis of the gel of class 21 was made, where working with the protein 
frxA, the result was ≅24kDa, which is similar to the result obtained in the article cited in the 
protocol, 27kDa. 
 
 
ii 
 
Resumo 
 
Esta atividade laboratorial teve como principal objetivo a produção e purificação da 
proteína da enzima GFP (Green Fluorescent Protein ou Proteína Verde Fluorescente). 
De modo a realizar a produção da proteína foram utilizadas células de Escherichia coli que, 
com um plasmídeo recombinante específico da proteína GFP, foram transformadas. O plasmídeo 
recombinante foi introduzido no plasmídeo comercial adequado ao tipo de proteína trabalhada, 
utilizando as enzimas de restrição Ndel e Xhol de modo a proceder a clonagem do gene. 
Este processo envolveu várias etapas do processo de purificação de uma proteína 
recombinante. A atividade foi então dividida em 3 partes. 
Na primeira etapa, pretendeu-se efetuar o processo de purificação da proteína FrxA, 
recorrendo à técnica de cromatografia de afinidade. Realizou-se então a preparação do extrato 
bruto proteico das células de E. Coli, que continham o plasmídeo correspondente á proteína GFP 
e que sobreexpressaram a proteína FrxA após indução com o composto IPTG, um análogo da 
lactose. 
Seguidamente foi feita a cromatografia de afinidade com um gradiente descontínuo de 
amidazolo, obtendo-se várias frações proteicas com concentrações crescentes do composto. A 
seguir recorreu-se á técnica de “Dessalting” ou mudança de tampão, por cromatografia de exclusão 
molecular com uma resina com muito baixo cut-off, visto que o excesso de imidazolo provoca a 
desnaturação das proteínas, em partículas da FrxA. No final desta etapa armazenou-se as frações 
recolhidas e as amostras. 
Na segunda etapa, ao analisar-se as frações proteicas recolhidas durante os processos 
cromatográficos de purificação, de modo a determinar a quantidade de proteína existente em cada 
fração. Para a quantificação recorreu-se a um método colorimétrico de determinação da proteína 
total, o método BCA (ácido bicinconínico). Verificou-se então que as frações EB, F1, F2, F3, F4 
E F5 apresentavam de concentração os valores, respetivamente, de , de 2,402mg/ml; 2,252mg/ml; 
0,26mg/ml; 0,061mg/ml; 1,094mg/ml e 1,28mg/ml. 
Na parte C, de modo a encontrar a proteína recombinante GFP nas frações e conseguir 
avaliar o grau de pureza, as frações eluídas da coluna foram recolhidas pela técnica de eletroforese 
SDS-PAGE. Possivelmente devido o protocolo não ser o mais adequado, o gel não gerou bons 
resultados, também não se deve excluir o erro humano, fator que pode ter alterado de forma 
essencial o resultado final obtido. 
Porem para concluir, foi feita uma rápida analise do gel da turma 21, onde trabalhando com 
a proteína frxA, chegou-se ao resultado de ≅24kDa, que se assemelha com o resultado obtido no 
artigo citado no protocolo, 27kDa. 
 
 
 
iii 
 
1. Índice 
1. Índice...................................................................................................................................... iii 
2. Introdução ............................................................................................................................... 1 
3. Descrição experimental ........................................................................................................... 8 
Parte A ........................................................................................................................................ 8 
Material Biológico .................................................................................................................. 8 
Material ................................................................................................................................... 8 
Reagentes e soluções............................................................................................................... 8 
Equipamento ........................................................................................................................... 8 
Segurança ................................................................................................................................ 9 
Procedimento experimental .................................................................................................... 9 
Preparação do extrato bruto proteico das células de E. coli ............................................... 9 
Cromatografia de Afinidade – Purificação da Proteína ...................................................... 9 
Parte B ....................................................................................................................................... 10 
Material Biológico ................................................................................................................ 10 
Materiais ............................................................................................................................... 10 
Reagentes .............................................................................................................................. 10 
Equipamento ......................................................................................................................... 10 
Segurança ..............................................................................................................................11 
Procedimento experimental .................................................................................................. 11 
Preparação da curva padrão .............................................................................................. 11 
Preparação das amostras: .................................................................................................. 12 
Parte C ....................................................................................................................................... 12 
Material Biológico ................................................................................................................ 12 
Material ................................................................................................................................. 12 
Reagentes .............................................................................................................................. 12 
Equipamento ......................................................................................................................... 13 
Segurança .............................................................................................................................. 13 
Procedimento experimental .................................................................................................. 15 
Preparação do gel SDS-PAGE .......................................................................................... 15 
Preparação das amostras para SDS-PAGE ....................................................................... 16 
Eletroforese ....................................................................................................................... 16 
Corar as proteínas no gel................................................................................................... 16 
 
iv 
 
4. Tratamento de dados ............................................................................................................. 17 
1. Dados de espectrofotometria da GFP ............................................................................... 17 
2. Purificação da proteína por Cromatografia ....................................................................... 17 
Diagrama genérico para o processo de purificação via Cromatografia de afinidade. .......... 18 
Parte B – Quantificação proteica das frações recolhidas .......................................................... 19 
Parte C – Análise das frações recolhidas por eletroforese SDS-PAGE .................................... 21 
5. Resultados ............................................................................................................................. 23 
Parte -A e B ............................................................................................................................... 23 
Parte - C .................................................................................................................................... 23 
6. Conclusão .............................................................................................................................. 24 
7. Bibliografia ........................................................................................................................... 25 
8. Apêndice ............................................................................................................................... 29 
9. Anexos .................................................................................................................................. 30 
 
 
 
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1 
 
2. Introdução 
A purificação de proteínas é o processo pelo qual se obtêm uma proteína de interesse através 
de uma amostra biológica, por exemplo um tecido. Esta técnica é muito utilizada na ciência no 
estudo das propriedades de uma determinada proteína, bem como as suas possíveis interações e 
sua importância para os sistemas biológicos.[1][2] 
Primeiramente, é necessário que as proteínas estejam em solução, de modo a serem isoladas. 
Relativamente ao sangue, as proteínas do soro já se encontram suspensas em solução, não sendo 
requerida esta etapa inicial. Por outro lado, para isolar proteínas de um tecido específico, é 
necessário primeiramente fazer a digestão do tecido, deste modo, liberando as células que o 
constituem. Seguidamente, ocorre o rompimento dessas células permitindo a libertação da proteína 
de interesse para a solução. Nesta fase existe uma outra atenção a ser feita: se a proteína de interesse 
é citosólica, se se encontra presente no interior de alguma organela ou inserida em alguma 
membrana. No primeiro caso, a lise das células basta para que a proteína seja solubilizada. Pode-
se usar a lise osmótica, colocando deste modo as células em contato com uma solução hipotónica, 
que tende a entrar no meio intracelular por osmose e romper a membrana plasmática, liberando o 
conteúdo citoplasmático na solução. Caso a proteína se encontre em compartimentos celulares ou 
membranas, por norma adiciona-se uma fase extra no processo: a separação dos componentes 
subcelulares em frações de densidade, através de centrifugação por gradiente (por exemplo, 
gradiente de sacarose). Através da recolha da fração de interesse, é necessário solubilizar as 
membranas com soluções contendo detergentes ou solventes orgânicos (com certo cuidado para 
não desnaturar as proteínas em questão, se a estrutura intacta for importante para a análise).[1][2] 
Após o processo de purificação, é essencial a avaliação da quantidade da proteína isolada. 
Sendo que em enzimas é comum relacionar a quantidade por meio de ensaios colorimétricos que 
detectam a formação de seus produtos. Para uma proteína com função de receptor, também é 
possível a conjugação do seu ligante a um radioisótopo. O complexo ligante radioativo-receptor 
pode ser então concentrado por filtragem da solução aquosa que o contém. As hormonas podem 
ser detectadas através da sua ação biológica em células ou tecidos, sendo este tipo de ensaio mais 
demorado, uma vez que depende de respostas de sistemas vivos. 
Ensaios imunoquímicos são, em geral, um método de rápida deteção de quantidades pequenas 
de proteína. Recorre-se nestes casos ao uso de anticorpos que reconhecem especificamente partes 
(epítopos) da proteína em questão. Na técnica chamada de imunoprecipitação, a detecção ou 
isolamento de proteínas pode ser realizada, rapidamente, pela precipitação dos anticorpos que as 
reconhecem. Além disso, nos radioimunoensaios, as proteínas são detetadas através da sua 
capacidade de competição pelo anticorpo com moléculas marcadas radioativamente (quanto maior 
a detecção de radioatividade, menor a quantidade da proteína que se ligou ao anticorpo). Em 
imunoensaios enzimáticos (como por exemplo ELISA e EIA) a radioatividade não é utilizada e 
estas são técnicas muito difundidas e bastante sensíveis; sendo também baseadas no princípio de 
ligação da proteína ao seu anticorpo específico, correlacionando a absorbância com a concentração 
da proteína presente na amostra.[1][2] 
 
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2 
 
Proteína GFP 
GFP é uma proteína globular que originalmente é isolada a partir da água-viva Aequorea 
victoria, espécie que apresenta uma intensa fluorescência natural, também apresenta boa 
estabilidade em diferentes pHs e temperaturas, também, a partir de alterações em sua estrutura, 
pode ser utilizada para diferentes aplicações, incluindo sistemas de biomarcadores e biossensores. 
A partir do isolamento e clonagem do gene responsável por sua produção, foi produzida com 
sucesso uma variante da proteína em organismos recombinantes, como Escherichia coli (E. coli) e 
Caenorhabditis elegans[3;4;5;6]. Porem, o processo de produção da GFP apresenta grande custo de 
produção, visto que o método de extração e purificação da proteína torna os custos demasiados 
elevados para a indústria, podendo ser reproduzido apenas em escalalaboratorial. 
Para sua aplicação como biomarcador e biossensor, a GFP comercial precisa de alta níveis 
de pureza, exigindo uma série de etapas de cromatografia trabalhosas e caras, 7-14 sem 
metodologia de purificação eficiente que combina recuperação seletiva de GFP e custos acessíveis. 
Até técnicas promissoras de purificação para GFP, como a elastina etiqueta de polipeptídeo ainda 
não são utilizados comercialmente, e aplicação da GFP, são necessários testes adicionais para 
garantir que a etiqueta ou seu resíduos não são imunogénicos ou prejudiciais para uso 
médico[7;14;15;16;17;18;]. 
O alto número de estágios de purificação dispendiosos necessários para a aquisição de GFP 
puro afeta o preço do produto final, e. GFP comercial da BioVision® que custa aproximadamente 
US $ 2.000,00 por mg. Em relação à preocupação econômica, está em estudo a busca de técnicas 
alternativas de purificação (como extração líquido-líquido) para reduzir os custos de produção. A 
recuperação de GFP do lisado celular usando extração com solvente orgânico já foi realizada e 
uma purificação completa de GFP foi alcançada combinando os estágios de extração líquido-
líquido com uma etapa posterior da cromatografia. No entanto, o processo envolveu várias etapas 
de extração e o uso de solventes orgânicos, que podem ser tóxicos, voláteis e / ou inflamáveis, e a 
tendência industrial atual é substituir esses compostos por alternativas mais seguras e ecológicas, 
como polímeros e líquidos iônicos (ILs)[15;19;20;21;22;23;24;25]. 
Polímeros como o polipropileno glicol (PEG) e o polietileno glicol (PPG) e sais como o 
cloreto de cloreto de colina [(2-hidroxietil) trimetilamônio], [Ch] Cl, exibem excelentes 
propriedades para uso industrial, com baixa toxicidade e permitindo condições de trabalho mais 
amenas que os solventes orgânicos. Recentemente, combinações desses polímeros biocompatíveis 
e sais ou ILs à base de colina têm sido utilizadas na formação de sistemas bifásicos aquosos (ABS), 
que foram propostas como plataformas biocompatíveis, eficientes, baratas e fáceis de expandir 
para a purificação de várias biomoléculas. O ABS consiste em duas fases imiscíveis ricas em água 
que são formadas pela mistura (em certas concentrações) de, pelo menos, dois compostos 
estruturalmente diferentes, como polímeros, sais e/ou ILs em um meio aquoso. Já existem alguns 
estudos bem-sucedidos que mostram o uso de ABS para a extração de GFP, mas níveis mais altos 
de purificação ainda não foram demonstrados e são essenciais para o sucesso comercial e a 
viabilidade econômica do processo[26;28;29;31;32;38;44;45;46;47]. 
 
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3 
 
Parte A: 
As proteínas recombinantes são proteínas produzidas artificialmente através de genes 
clonados. Ou seja, provêm da técnica de DNA recombinante. Esse DNA é introduzido em células 
de um hospedeiro (normalmente a bactéria E.coli). 
A técnica utilizada para produção de proteínas recombinantes é: 
• Isolação e preparação do DNA; 
• Escolha do vetor apropriado; 
• O fragmento de DNA a clonar foi introduzido em vetores de clonagem, formando-se o 
DNA recombinante; 
• O DNA recombinante foi inserido na célula hospedeira – transformação, que possui 
mecanismos enzimáticos para a replicação do DNA e para a síntese proteica; 
• Seleção e identificação de células que incorporam o DNA recombinante; 
• Verificação se a proteína foi expressa; 
• Remoçao e purificação das proteínas 
Esta técnica apresenta algumas vantagens, tais como: 
• Amplificação / crescimento das células de hospedeiro mais simples; 
• Aumento da quantidade de extrato proteico bruto, de onde a proteína alvo será isolada; 
• Redução dos custos; 
• Como as diferentes técnicas de clonagem em vetores especializados de expressão permitem 
modificar as proteínas introduzindo-lhes tags que facilitam a purificação – permitem o uso 
de cromatografias de afinidade e reduzem o número de passos cromatográficos; 
• Enriquecimento do extrato bruto proteico na proteína de interesse; 
• Aumento do rendimento da purificação e do grau de pureza atingido; 
 
Um dos tipos de tags mais comum é a His-tag, uma cauda de 6 resíduos de histidinas, inseridas 
quer no N-terminal da proteína quer no C-terminal da proteína recombinante. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1 - Proteína com cauda de Histidinas ou His-
tag no C-terminal de uma proteína 
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4 
 
Cromatografia de afinidade a metais (IMAC) 
A técnica IMAC visa na interação entre espécies doadoras de eletrões encontradas na 
superfície de biomoléculas, em solução e iões metálicos quelatados imobilizados num suporte 
sólido. São diversas as aplicações analíticas, preparativas e industriais desta técnica, como a 
separação e purificação de diferentes biomoléculas (peptídeos, proteínas e ácidos nucleicos), a 
separação de células através de extratos biológicos e estudos de estrutura-função de proteínas. 
No ínicio esta técnica foi utilizada para purificação de biomoléculas apresentando 
naturalmente grupos dadores de eletrões em resíduos de aminoácidos expostos na superfície (tais 
como o anel imidazole de histidina), sendo que estes são primariamente responsáveis pela 
interação biomolécula-ião metálico. Através da evolução da tecnologia do DNA recombinante, foi 
possível a incorporação de caudas (tag) em proteínas que não apresentam naturalmente espécies 
dadoras de eletrões, assim como a fusão de sequência de seis histidinas na porção C ou N-terminal 
da proteína alvo, garantido a esta a possibilidade de purificação por IMAC. 
 
Figura 2 - Colunas de cromatografia manuais (ou de fluxo gravitacional) (A, B) com resinas que quelatam Ni2+ (C). Formação 
do complexo entre o Ni2+ e as o grupo imidazole das cadeias laterais das histidinas, que permitem a fixação específica de 
proteínas com His-ta 
 
Cromatografia de exclusão molecular 
Este tipo de cromatografia tem por objetivo a separação de componentes de uma amostra 
consoante o seu tamanho molecular. A exclusão ou a inclusão diferencial das moléculas são 
obtidas pela filtragem através de um gel que apresente grânulos esféricos. Estes grânulos têm os 
poros de uma distribuição de tamanho específica para incluir ou excluir moléculas de diversos 
tamanhos quando estas passam através do gel. 
Parte B: 
Existem diversos métodos colorimétricos para a quantificação de proteínas totais numa 
solução, sendo que se baseiam em reações químicas com as cadeias polipeptídicas em que o 
reagente altera a sua cor. 
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5 
 
Estes métodos são sempre realizados por comparação com uma amostra de concentração 
proteica bem definida, por norma uma solução da proteína BSA (Bovine serum albumine ou 
Albumina do Soro Bovino). É realizada uma curva de calibração com as amostras de concentrações 
sequencialmete menores de BSA, garantindo a obtenção de uma expressão matemática que 
corresponde a uma resposta linear entre a concentração de proteína e a leitura de absorvância (que 
mede a intensidade de cor desenvolvida no ensaio). Esta relação linear baseia-se na Lei de Beer-
Lambert, 
Abs = ε . C . l 
 
em que Abs representa o valor de absorvância a um determinado comprimento de onda, C é a 
concentração da amostra, ε é o coeficiente de absortividade molar (𝑀−1𝑐𝑚−1 ) (neste caso é 
desconhecido e determindado empiricamente do declive da reta de calibração e não terá estas 
unidades) e l corresponde ao percurso ótico da cuvette (em quase todos os casos 1 cm). 
É necessário considerar que a Lei de Beer-Lambert não é sempre seguida, havendo apenas 
intervalos de concentração do analito em que esta é obedecida. Em particular, quando as os valores 
de concentrações são muito altos, ou seja, os valores de absorvância medidos são superiores a 1 
ou 1,5, esta lei não se verifica e não deve ser utilizada. 
Em termos simples, efetuam-se curvas de calibração com diferentes concentrações de uma 
solução padrão de analito para verificar qual o intervalo deconcentrações em que a resposta é 
linear. 
Se a amostra apresentar um valor de Abs fora do intervalo da curva de calibração, deve ser 
efetuada uma diluição da amostra e quantificação da amostra diluída. 
Entre os vários métodos de quantificação proteica, o método do BCA ou ácido 
bicinconínico é um método bastante utilizado, que é simples, oferece uma boa sensibilidade e 
extensão de linearidade de resposta. 
Parte C: 
SDS-PAGE é a abreviatura de dodecil-sulfato de sódio (SDS) de poliacrilamida (PAGE). 
As amostras são desnaturadas pelo calor na presença de reagentes desnaturantes como o 
beta-mercaptoetanol, que destrói as ligações dissulfeto das proteínas, e o detergente SDS. 
O SDS, fortemente negativo, rodeia as cadeias proteicas, desnaturando-as e cobrindo a 
proteína com cargas negativas. Deste modo, a carga intrínseca à proteína, que é variável em função 
dos aminoácidos que a constituem e do pH da solução que a contém, é “mascarada” pelo 
detergente, tornando-se a razão carga/massa constante. Assim, é possível que as proteínas, agora 
carregadas negativamente, sejam separadas em função do seu tamanho, tal como no caso das 
moléculas de ADN, na eletroforese de ácidos nucleicos, em que as amostras aplicadas no gel, como 
possuem carga global negativa (conferida pelo grupo fosfato PO4
3-), migram em direção ao 
elétrodo positivo. 
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6 
 
O gel de poliacrilamida, entre outros reagentes, é constituído por uma mistura de dois 
polímeros: acrilamida e bis-acrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto a bis-
acrilamida apresenta-se em forma de "T". Misturando-se estes dois polímeros, obtemos uma 
matriz, gel poroso, como se tivéssemos uma rede com uma malha mais ou menos apertada. O 
diâmetro dos poros é controlado e definido através da concentração destes polímeros. Assim, 
quanto maior a concentração de acrilamida, menores serão os poros da matriz. 
Dependendo do seu tamanho, cada proteína migra de forma diferenciada ao longo do gel: proteínas 
de menor tamanho molecular migrarão mais rapidamente, enquanto que as de maior tamanho terão 
mais dificuldade em atravessar a “rede” do gel e, assim, movem-se mais lentamente. 
A amostra de proteínas que será aplicada no gel é tratada para estar solubilizada e também 
é desnaturada com a quebra das pontes dissulfeto, forças eletrostáticas e pontes de hidrogénio. Na 
solução de tratamento da amostra podem ser utilizados agentes dissociantes (Uréia, EDTA), 
redutores (2-mercaptoetanol, ditiotreirol) e detergentes aniónicos (SDS, desoxicolato de sódio) e, 
em algumas situações, detergentes não aniónicos são utilizados (Tween 20, Triton X-100). A 
amostra também é aquecida em banho até fervura por 5 minutos, geralmente, para garantir a 
melhor discriminação dos componentes da mistura. 
 Na solução de amostra também é adicionado glicerina, que irá facilitar a penetração da 
amostra no gel, e como marcador de corrida é utilizado o corante azul de bromofenol. A coloração 
do gel tem por finalidade a identificação da composição de proteínas e peptídeos. A coloração 
realizada pelo Coomassie blue detecta facilmente concentrações da ordem de 10 ng e a realizada 
por nitrato de prata é mais sensível, detecta até 0,1 ng, sendo irreversíveis as duas colorações 
citadas. Conforme o princípio da eletroforese, as frações antigénicas sofrem ação de carga elétrica, 
migrando para o polo positivo. 
 Como já foi referido anteriormente, as proteínas de menor tamanho migram com maior 
velocidade que as proteínas de tamanho maior, pela barreira física estabelecida pelo sistema do 
gel. Uma vez separadas pelo tamanho, a posição das proteínas é definida por comparação à 
migração de um padrão de moléculas de tamanho molecular conhecido. Dessa forma, é possível 
determinar com precisão o tamanho molecular de proteínas entre 5 e 250 KDa. 
TP3 
 
7 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3 - Esquema da eletroforese (SDS-PAGE) 
TP3 
 
8 
 
3. Descrição experimental 
Parte A 
 
Material Biológico 
• Extrato celular de E coli 
Material 
• Suporte universal com 2 garras para segurar a coluna 
• 2 Reservatórios de tampão das colunas PD-10 
• Micropipetas P1000, P200 e P20 
• Pontas descartáveis azuis e amarelas 
• Pipetas de Pasteur de plástico 
• Proveta de 10mL 
• Proveta de 25 mL 
• Proveta de 50 mL 
• 2 copos de 100 mL 
• Microtubos eppendorfs de 1,5 ou 2 mL 
• Tubos falcon de 15 mL 
• Tubos falcon de 50 mL 
• Suporte de Microtubos 
• Suporte de falcons de 50mL 
• Suporte de falcons de 15 mL 
Reagentes e soluções 
• Tampão de ligação (Binding buffer) * (20 mM de imidazolo) 
• Tampão de lavagem 1 (Wash Buffer L) * (75 mM de imidazolo) 
• Tampão de eluição (Elution Buffer) * (500 mM de imidazolo) 
• Solução PBS* 
• Etanol 20 %(v/v) 
*são as que preparam na segunda aula. 
Equipamento 
• Coluna tipo PD-10 com 2 mL de resina IMAC (já carregada com Ni2+) 
• Coluna PD-10 
 
 
 
 
 
TP3 
 
9 
 
Segurança 
 
Tabela 1 - Riscos e Segurança 
Reagentes Riscos Segurança 
Tampão de ligação 
(Binding buffer) 
Pouco arriscada. 
Possível irritação em 
contacto com pele. 
Utilizar material de 
segurança básico (bata, 
luvas e óculos). 
Tampão de lavagem 1 
(Wash Buffer L) 
Não apresenta efeitos 
significativos ou riscos 
críticos. 
Utilizar material de 
segurança básico (bata, 
luvas e óculos). 
Tampão de eluição 
(Elution Buffer) 
Não apresenta efeitos 
significativos ou riscos 
críticos. 
Utilizar material de 
segurança básico (bata, 
luvas e óculos). 
Solução PBS Provoca irritação ocular. Utilizar óculos. 
 
Procedimento experimental 
 
Preparação do extrato bruto proteico das células de E. coli 
• Determine o peso molhado das células de E. coli (use um tubo falcon vazio para tarar a 
balança). 
• Sabendo que deve adicionar 5 mL do tampão de lise “NZY Bacterial Cell Lysis Buffer” 
por cada 1g de massa de células, determine o volume a adicionar. 
• Adicione o tampão de lise (quantidade exata será determinada pela docente, com base nos 
cálculos anteriores), e ressuspenda as células no tampão vortexando brevemente. (Evite 
criar muita espuma!) 
• Adicione 2 µL de lisozima (50 mg/mL) e 2 µL de DNase I por cada 1 mL de tampão de 
lise “NZY Bacterial Cell Lysis Buffer”. Antes de adicionar faça as contas para saber o 
volume de cada! Confirme com a docente. 
• Incube a 37 ºC durante 20 min. 
• Distribua igual volume por 2 microtubos de 2 mL. 
• Centrifugue 15 min a 13000 x g 
• Transferir o sobrenadante para um novo tubo falcon de 50 mL. 
• Adicione binding buffer até perfazer 20 mL. 
Cromatografia de Afinidade – Purificação da Proteína 
 Destapar a coluna e equilibrar com 4 mL de tampão Binding. 
• colocar um copo por baixo da coluna 
• Retirar a tampa de cima e depois a rolhinha de baixo. 
• Deixar todo o líquido sair da coluna (até parar de pingar) 
• Aplicar 4 mL de tampão Binding 
 Aplicar a amostra 
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• Montar o adaptador superior na coluna 
• Retirar 1 mL do extrato proteíco bruto para um eppendorf (etiquetá-lo BQ-TxGxEB) 
• Com o conta gotas de plástico aplicar a amostra restante de extrato proteico na 
• coluna. (Anote o volume de amostra inicial que aplicou) 
• Recolha para um tubo Falcon de 50 mL todo o eluído da coluna. (Etiquete este 
• tubo - BQ-TxGx-F1) 
 Primeira Lavagem 
• Com o conta gotas de plástico aplique 10 mL de tampão Binding 
• Recolha para um tubo Falcon de 15 mL todo o eluído da coluna. (Etiquete este 
• tubo - BQ-TxGx-F2) 
 Segunda Lavagem 
• Com o conta gotas de plástico aplique 6 mL de tampão Wash 
• Recolha para um tubo Falcon de 15 mL todo o eluído da coluna. (Etiquete este 
• tubo - BQ-TxGx-F3) 
Parte B 
Material Biológico 
• Amostras das frações recolhidas das cromatografias 
Materiais 
• Tubos eppendorfs de 1,5 mL 
• Suporte para os tubos 
• 1 Frasco de vidro com capacidade ~100mL 
• 1 proveta de vidro de 50 mL 
• Micropipetas P1000, P200 e P20 
• Pontas descartáveis azuis e amarelas 
• Cuvettes de plástico 
Reagentes 
• Solução A do corante BCA (comercial) 
• Solução B do corante BCA (comercial) 
• Solução padrão de BCA a 1 mg/mL (comercial) 
Equipamento 
• Colorímetro com filtro ~550 nm* ou espectrofotómetro UV-visível 
*Alteraçãono protocolo de 560 nm, para 550nm. 
 
 
 
 
TP3 
 
11 
 
Segurança 
 
Tabela 2 - Riscos e Segurança 
Reagentes Riscos Segurança 
Solução A do corante BCA 
(comercial) 
Pouco arriscada. 
Possível irritação em 
contacto com pele, olhos 
ou zonas mucosas. 
Utilizar material de 
segurança básico (bata, 
luvas e óculos). 
Solução B do corante BCA 
(comercial) 
 
Solução padrão de BCA a 
1 mg/mL (comercial) 
 
 
Procedimento experimental 
 
Preparação da curva padrão 
 Utilizando a solução padrão de 1 mg/mL de proteína BSA, efetue as diluições necessárias 
para colocar em microtubos 200 μL de solução de proteína, de acordo com o quadro 
seguinte: 
Tabela 3 - Curva Padrão de proteína BSA 
Tubo [BSA]Final 
(mg/ml) 
V BSA (μL) 
(Solução inicial) 
V H2O 
(μL) 
V final 
1 0 0 200 200 μL 
2 0,1 10 190 200 μL 
3 0,2 20 180 200 μL 
4 0,4 40 160 200 μL 
5 0,5* 50 150 200 μL 
6 0,6* 60 140 200 μL 
7 0,8* 80 120 200 μL 
*Alteração de concentrações de BSA utilizadas. 
 Preparar o reagente BCA 
• Retire 50 mL de solução A de BCA para um frasco passado por água destilada. 
• Adicione 1 mL de solução B de BCA. Agite a mistura para homogeneizar a cor 
(deve estar verde). 
 Aplique 1 mL do reagente BCA preparado a cada tubo da curva padrão, feche o tubo e leve 
ao vortex 5-10 s. 
 Coloque a 37 ºC a incubar durante 30 min. 
 Deixe arrefecer e leia a Absorvância a 560 nm. 
TP3 
 
12 
 
Preparação das amostras: 
 
 Para cada amostra de frações que recolheu, efetuar, para microtubos e em duplicado, as 
diluições indicadas no quadro – com um volume final de 200 μL 
Tabela 4 - Valores de diluição das amostras 
Fração Sigla da 
fração 
Diluição Vfração (µL) VH2O (µL) Vfinal (µL) 
Extrato bruto EB 1/5 40 160 200 
Flow-through F1 1/5 40 160 200 
Wash I F2 1 200 0 200 
Wash II F3 1 200 0 200 
Elute F4 ½ 100 100 200 
Desalt F5 ½ 100 100 200 
 
 Aplique 1 mL do reagente BCA preparado a cada tubo da da curva padrão, feche o tubo e 
vortex 5-10 s. 
 Coloque a 37 ºC a incubar durante 30 min. 
 Deixe arrefecer e leia a Absorvância a 560 nm. 
Parte C 
Material Biológico 
• Amostras das frações recolhidas nos processos cromatográficos realizados antes. 
Material 
• Micropipetas P1000, P200, P20 
• Pontas descartáveis amarelas e azuis 
• Frasco/garrafão com capacidade para 1 L 
• Proveta de 500mL ou 1 L 
• Tina para banho maria 
• Flutuador de Microtubos 
• Microtubos de 2 mL, 1,5 mL 
• Tubos Falcon de 15 mL e 50 mL 
• Pipetas de Pasteur de vidro e tetinas 
• Tinas ou caixas para corar géis 
Reagentes 
• Solução de Acrilamida/Bis-acrilamida (37,5:1) a 40 % (m/v), (Comercial, NZYTech) 
(https://www.nzytech.com/products-services/biochemicals/mb15601/) 
• Solução de APS 10% (m/v) (APS = persulfato de amónio) (já preparada) 
• TEMED (Comercial, marca Carl-Roth) 
➢ Como todas as poliaminas, o TEMED apresenta um odor pungente. 
• Solução Tampão B (Tampão 1,5M TRIS-HCl pH=8,8) * 
• Solução Tampão C (Tampão 0,5M TRIS-HCl pH=6,8) * 
TP3 
 
13 
 
• Tampão de Corrida Tris-Glicina-SDS (1X), a preparar a partir da solução stock (5X) 
• 5x SDS-PAGE Sample Loading Buffer (Comercial, NZYTech) 
(https://www.nzytech.com/products-services/for-protein-applications/mb11701/) 
• Solução corante de coomassie Roti®-Blue (preparada da solução coloidal (5x) 
concentrada, comercial, da Carl Roth) 
➢ Verter e misturar lentamente 20 mL da solução coloidal (5X) em 60 mL de água 
com 20 mL de metanol 
• Solução descorante (25% metanol em água) 
(Quer a acrilamida quer a bis-acrilamida são carcinogénicas e neurotóxicas quando isoladas, em 
sólido ou em solução. Quando polimerizadas, não apresentam risco, à exceção resquícios de 
monómeros. É obrigatório o uso de luvas no manuseamento destes reagentes, bem como do 
material de laboratório que contacte com estes. Como todas as poliaminas, o TEMED apresenta 
um odor pungente. Abra e feche o frasco rapidamente. O loading buffer também tem um odor 
pungente, devido à presença de tióis redutores como o DTT.) 
Equipamento 
• Sistema de eletroforese vertical 
• Sistema de vazamento de géis verticais 
• Fonte de alimentação 
• Placa de agitação e aquecimento 
Segurança 
 
Tabela 5 - Riscos e Segurança 
Reagente Risco Segurança 
Solução de 
Acrilamida/Bis-acrilamida 
(37,5:1) a 40 % (m/v), 
(Comercial, NZYTech) 
Extremamente perigoso. 
Pode provocar defeitos 
genéticos, cancro, 
irritação, problemas de 
fertilidade. 
Utilizar material de 
segurança básico (bata, 
luvas e óculos). 
Manusear com extremo 
cuidado. 
Solução de APS 10% 
(m/v) (APS = persulfato de 
amónio) 
H272. Pode agravar um 
incêndio, comburente. 
H302. Nocivo se ingerido. 
H315. Causa irritação à 
pele. 
H319. Causa irritação 
ocular séria. 
H335. Pode causar 
irritação respiratória. 
H334. Quando inalado 
pode causar sintomas 
alérgicos, asma ou 
dificuldades de respiração. 
P280. Usar luvas de 
proteção. 
P305+P351+P338. SE 
NOS OLHOS: Lavar 
cuidadosamente com água 
durante vários minutos. 
Remover as lentes de 
contato, se presentes e de 
fácil remoção. Continue 
enxaguando. 
P302+P352. SE NA 
PELE: Lavar com bastante 
água e sabão. 
TP3 
 
14 
 
H317. Pode causar uma 
reação alérgica na pele. 
P304+P341. SE 
INALADO: Se a 
respiração é difícil, 
remover a vítima para um 
ambiente de ar 
puro e permanecer em 
repouso em uma posição 
confortável para respirar. 
P342+P311. Se 
experiências, sintomas 
respiratórios: Chamar o 
CENTRO DE 
INTOXICAÇÕES ou um 
médico. 
TEMED (Comercial, 
marca Carl-Roth) 
H225. Líquido e vapor 
facilmente inflamáveis. 
H302+H332. Nocivo por 
ingestão ou inalação. 
H314. Provoca 
queimaduras na pele e 
lesões oculares graves. 
P210. Manter afastado do 
calor, superfícies quentes, 
faísca, chama aberta e 
outras 
fontes de ignição. Não 
fumar. 
P280. Usar vestuário de 
proteção/proteção ocular. 
Solução Tampão B 
(Tampão 1,5M TRIS-HCl 
pH=8,8) 
 
Solução Tampão C 
(Tampão 0,5M TRIS-HCl 
pH=6,8) 
Corrosivo em metais, pele 
e órgãos. 
Utilizar material de 
segurança básico (bata, 
luvas). 
Tampão de Corrida Tris-
Glicina-SDS (1X), a 
preparar a partir da 
solução stock (5X) 
 
5x SDS-PAGE Sample 
Loading Buffer 
(Comercial, NZYTech) 
 
Solução corante de 
coomassie Roti®-Blue 
(preparada da solução 
coloidal (5x) concentrada, 
comercial, da Carl Roth) 
Inflamável e corrosivo. Utilizar material de 
segurança básico (bata, 
luvas e óculos). 
Manter longe da chama. 
Solução descorante (25% 
metanol em água) 
Inflamável. Manter longe da chama. 
 
TP3 
 
15 
 
Procedimento experimental 
Preparação do gel SDS-PAGE 
• Limpar cuidadosamente os vidros com etanol, para remover manchas de gordura agarrada 
que pode levar a polimerização irregular. 
• Montar os moldes de vidro no suporte e verificar que esteja estanque. 
• Preparar a solução do gel resolvente com concentração de 12 % de acrilamida-
bisacrilamida, num falcon de 50 mL, de acordo com a tabela: 
 
Figura 4 - Valores para preparo de Gel SDS-PAGE /Moodle - Sebenta Lab IIIB 
• Com cuidado, mas com rapidez, vazar a solução do gel entre os dois vidros, com auxílio 
de uma pipeta de Pasteur 
• Depois de vazar com cuidado, evitando fazer bolhas, recobrir muito suavemente com 
água destilada (do esguicho). 
• Deixar polimerizar (mínimo 30 min) 
• Preparar o gel stacking num falcon de 50 mL, de acordo com a tabela 
 
Figura 5 - Valores para preparo de Gel SDS-PAGE /Moodle - Sebenta Lab IIIB 
 
• Quando o gel resolvente estiver polimerizado,e antes de colocar os agentes 
polimerizantes, retirar a água que está sobre o gel resolvente. Garantir que o pente está 
limpo. 
• Vazar com muito cuidado deixando 1-2 mm da superfície, e colocar rapidamente o pente. 
(Evite criar bolhas, colocando-o ligeiramente inclinado, e depois endireitando-o) 
• Deixar polimerizar (10 - 30 min). 
TP3 
 
16 
 
 
Preparação das amostras para SDS-PAGE 
 
• Colocar em microtubos bem etiquetados 20 µL de cada amostra 
• Juntar a cada microtubo 5 µL de loading buffer (5x). 
• Ferver em banho-maria 5 min as amostras (barquinho numa tina em cima da placa) 
• Secar os tubos e fazer um Spin-down (centrifugar 1 min a Vmax=13000 ×g) 
 
Eletroforese 
• Montar os géis na tina. 
• Encher com o Tampão de eletroforese Tris-Glicina-SDS (1x) a zona do meio (verificar 
que não há fugas), e depois o reservatório grande. 
• Aplicar as amostras nos poços do gel, anotando a ordem de aplicação. 
• Aplicar 5 µL de Marcador de Proteínas-Padrão num poço separado. 
• Colocar a tampa, ligar à fonte de alimentação. 
• Correr 15-20 min a 100 V (até à entrada das amostras no gel resolvente) e 120 V até as a 
frente de migração atingir o fim do gel (durante ~ 60 min); ter em atenção para evitar que 
as bandas de proteínas não migrem para fora dos géis. 
 
Corar as proteínas no gel 
 
• Desligar a fonte e retirar os géis da tina, e do seu suporte. 
• Abrir os vidros e transferir os géis (remova o stacking) para as tinas de corar 
• Cobrir com a solução corante e incubar 30 min a 37 ºC, até o gel ficar todo azul 
• Recolher a solução corante e adicionar a solução descorante. 
• Incubar a 37ºC mais 30 min ou deixar o/n. 
• Guarde o gel numa mica e registe uma fotografia do mesmo. 
• Colocar as cuvettes na orientação correcta; 
• Não deixar marcas nem sujidade nas faces da cuvette. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TP3 
 
17 
 
4. Tratamento de dados 
1. Dados de espectrofotometria da GFP 
Após analise das soluções contendo a proteína GFP, pode-se gerar um gráfico de absorção da 
mesma, mostrando o espectro absorvido. 
 
Figura 6 - Absorvância GFP 
Conforme o espectro acima, pode-se observar um pico de absorção em ≅ 274nm. 
2. Purificação da proteína por Cromatografia 
Ord Coluna Solução 
Aplicada 
Concentração 
de 
Imidazole(mM) 
Volume 
Aplicado 
(mL) 
Observações 
1 IMAC Tampão 
Binding 
20 Equilibrar 
Coluna 
2 IMAC Extrato 
Bruto 
20 20-1=19 1° aplicação 
da amostra 
3 IMAC Tampão de 
ligação 
20 5 Formação de 
uma camada 
amarela 
4 IMAC Tampão de 
lavagem 
75 3 
5 IMAC Tampão de 
eluição 
(Elution) 
500 2,5 
6 PD-10 F4 em 
tampão 
elution 
500 2,5 2° aplicação 
da amostra 
7 PD-10 Solução de 
eluição PBS 
0 3,5 
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
250 300 350 400 450 500
Espectro de abs da GFP
Abs/ESP Abs/ES2 Abs/F4 Abs/F5
TP3 
 
18 
 
 Coluna IMAC 
 
 
Fração 
Operação 
efetuada 
Volume 
aplicado 
(mL) 
Volume 
recolhido 
Cor Presença 
de 
proteína 
(GFP) 
Observações 
EB Lise 
celular – 
Extrato 
Bruto 
20 20 Turvo / 
Amarelado 
Sim Presença de 
proteínas e 
demais 
substâncias 
desconhecidas 
F1 2 19 ≅ 19 Translucido Não 
F2 3 10 ≅ 9 Translucido Não 
F3 4 6 ≅ 5,5 Translucido Não 
F4 5 4 ≅ 4 Turvo Sim Proteína 
purificada 
Desalt 
F5 
6-7 4 ≅ 3,5 Turvo Sim Proteína 
purificada 
Figura 7 - Cromatografia por afinidade 
 Diagrama genérico para o processo de purificação via Cromatografia de afinidade. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1° passo: Inserir a amostra 
concentrada. Extrato 
celular lisado. 
O resultado será a primeira 
fração, F1, 
aproximadamente o valor 
total da amostra inicial. 
2° passo: Lavagem com 
Binding Buffer (20 nM 
imidazolo) 
O resultado será a segunda 
fração, F2, a qual não 
apresentará proteínas. 
3° passo: Lavagem com 
Wash Buffer (75 mM 
imidazolo) 
O resultado será a segunda 
fração, F3, a qual não 
apresentará proteínas. 
4° passo: Eluição com 
solução Elution (500 mM 
imidazolo) 
Está etapa é responsável por carregar as 
proteínas de interesse, desprendendo-as da 
coluna de afinidade, portando, f4 
apresentara significativa quantidade de 
proteínas alvo. 
TP3 
 
19 
 
 Coluna PD-10 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Parte B – Quantificação proteica das frações recolhidas 
 A curva padrão, utilizada para quantificar as proteínas nas amostras, foi feita com 
base na leitura da proteína BSA, segue no quadro abaixo, os valores relativos da leitura. 
Tubo BSAfinal 
(mg/mL) 
V BSA (μL) 
Solução inicial 
V H2O (μL) V final Abs 550nm 
1 0 0 200 200 0,11 
2 0,1 10 190 200 0,33 
3 0,2 20 180 200 0,55 
4 0,4 40 160 200 0,95 
5 0,5 50 150 200 1,16 
6 0,6 60 140 200 1,28 
7 0,8 80 120 200 1,59 
 
 Estes dados quando aplicados a uma reta, representam uma precisão de 99,23%, gerando 
também a equação de reta “Y= 1,8725x + 0,1573”, a qual possibilita o calculo da quantidade de 
proteínas presentes nas demais amostras analisadas. 
 
Figura 8 - Reta de calibração BSA 
y = 1,8725x + 0,1573
R² = 0,99230
0,5
1
1,5
2
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
A
b
s 
5
5
0
n
m
Concentração protéica (mg/mL)
Leitura de BSA à 550nm (Abs)
1° passo: Aplicar tampão 
PBS na coluna. 
Este processo é responsável por 
alterar o tampão transportador 
da proteína purificada na 
coluna IMAC . 
2° passo: Aplicar a solução 
com a proteína purificada. 
(F4) 
Está etapa é responsável 
por separar a solução 
Elution da proteína. 
3° passo: Aplicar o tampão 
PBS e recolher a proteína. 
 
Neste momento, o PBS fará o carregamento 
da proteína absorvida pela coluna, sendo um 
tampão mais indicado para os processos de 
analise. O resultado é a amostra F5 (Desalt). 
TP3 
 
20 
 
 A partir da curva de calibração pode ser calculada a quantidade de proteínas presentes nas 
amostras, as quais foram devidamente preparas com os dados no quadro abaixo. 
Tubo Diluição V fração 
final(μL) 
V 
H2O 
(μL) 
V 
final 
(μL) 
Abs 
550nm 
Concentração 
proteica 
(mg/mL) 
EB 1 0,5 100 100 200 1,15 1,060294 
EB 2 0,2 40 160 200 0,66 1,342323 
F1 3 0,5 100 100 200 1,16 1,070975 
F1 4 0,2 40 160 200 0,6 1,182109 
F2 5 1 200 0 200 0,4 0,129613 
F2 6 0,5 100 100 200 0,28 0,131055 
F3 7 1 200 0 200 0,22 0,033485 
F3 8 1 200 0 200 0,21 0,028144 
F4 9 0,5 100 100 200 0,5 0,366035 
F4 10 0,2 40 160 200 0,43 0,728171 
F5 11 0,5 100 100 200 0,7 0,579653 
F5 12 0,2 40 160 200 0,42 0,701469 
F51 13 1 200 0 200 0,29 0,070868 
F52 14 1 200 0 200 0,3 0,076208 
Figura 9 - Amostras e concentração proteica. (F51 e F52 foram excluídas do gráfico por não apresentarem valores expressivos). 
Cromatografia Fração Quantidade 
de proteína 
(mg) 
% proteína 
recuperada 
IMAC EB 2,402 --------------- 
IMAC F1* 2,252 93,755204 
IMAC F2 0,26 10,82431307 
IMAC F3 0,061 2,539550375 
PD-10 F4 1,094 45,54537885 
PD-10 F5 1,28 53,2889259 
Figura 10 - % de proteínas purificadas 
 É importante ressaltar que na amostra F1, existe a possibilidade de haver contaminação 
por outras proteínas, visto que o processo de purificação encontrava-se no inicio. 
 Para aferir, levamos uma amostra do GFP a uma camara de UV, segue uma imagem do 
resultado. 
 A fluorescência vista na imagem, é a aproximadamente 270nm. 
F
ig
u
ra
 1
1
 - 
F
lu
o
rescên
cia
 F
4 
TP3 
 
21 
 
Parte C – Análise das frações recolhidas por eletroforese SDS-PAGE 
 Obs: As analises a seguir foram feitas com um gel da proteína frxA da turma 21, o qual 
apresentou melhores resultados, vale também ressaltar que são proteínas diferentes, visto que o 
trabalho do grupo 1/turma 23 executou a extração e purificação da proteína GFP. 
 Como não dispomos dos dados de espectrofotometria das amostras relacionadas a turma 
21, torna-se impossível determinar os graus de pureza de cada amostra. 
 
Figura 12 - Gel Turma 21 Grupo 1 e 2 - Dados de migração total e relativa das bandasproteicas 
Massa (kDa) D migrada (cm) D migrada 
relativa 
Log10 (massa kDa) 
96 1,2 1,2/5= 0,24 1,98 
66 1,7 1,7/5=0,34 1,81 
48 2,5 2,5/5=0,5 1,68 
40 2,9 2,9/5=0,58 1,60 
32 4,2 4,2/5=0,84 1,50 
26 5,00 5/5=1 1,41 
18,5 Não aparece no grafico 
Figura 13 - Gráfico e equação linear de desvio padrão com base no marcador 
TP3 
 
22 
 
 
Figura 14 Gráfico e equação linear de desvio padrão com base no marcador (poços sinalizados) 
 
 Utilizando-se da equação gerada pelo gráfico acima, ao adicionar a distância percorrida 
no gel SDS-PAGE a fórmula, é possível prever a massa da proteína purificada em cada uma das 
amostras. 
𝑦 = −80,529𝑥 + 98,309 
 Logo, ao adicionarmos o valor percorrido pelas bandas correspondentes das amostras, 
obtemos o peso aproximado da proteína recombinante. 
𝑦 = −80,529. 0,92 + 98,309 𝑦 = 24,22𝑘𝐷𝑎 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
y = -80,529x + 98,309
R² = 0,8161
0
20
40
60
80
100
0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
M
as
sa
 A
p
ar
en
te
 (
kD
a)
Mobilidade Relativa (cm)
Massa Aparente Vs Distancia Migrada
Massa
Linear (Massa)
TP3 
 
23 
 
5. Resultados 
Parte -A e B 
 Ao fim do procedimento, é possível apontar a quantidade relativa de proteínas 
recuperadas durante o método de purificação. Pode-se observar o mesmo no quadro abaixo. 
Tabela 6 - Resumo de resultados Parte A 
Tipo de 
Cromatografia 
Etapa Fração Coloração Quantidade 
de proteína 
(mg) 
% proteína 
recuperada 
Fluorescência 
IMAC 1 EB Turvo / 
Amarelado 
2,402 --------------- --------------- 
IMAC 2 F1* Translucido 2,252 93,755204 --------------- 
IMAC 3 F2 Translucido 0,26 10,82431307 --------------- 
IMAC 4 F3 Translucido 0,061 2,539550375 --------------- 
PD-10 5 F4 Turvo / 
Amarelado 
1,094 45,54537885 Sim (≅ 270nm) 
PD-10 6 F5 Turvo / 
Amarelado 
1,28 53,2889259 --------------- 
 
Parte - C 
 
 O gel de eletroforese, feito a partir dos resultados da turma BIOTEC21, apresentaram 
uma migração de ≅ 4,6cm, podendo ser conferidos todos os dados na tabela abaixo. 
Amostra Migração 
(cm) 
Migração 
relativa 
(cm) 
Formula 
Equação 
linear 
Tamanho 
aparente 
(kDa) 
1 4,6 0,92 𝑦
= −80,529𝑥
+ 98,309 
24,22 
2 4,6 0,92 𝑦
= −80,529𝑥
+ 98,309 
24,22 
 
 
TP3 
 
24 
 
 
6. Conclusão 
Ao fim do trabalho, é possível perceber a seria necessidade da indústria em criar um método 
de extração e purificação da proteína GFP que possa ser aplicado em meio industrial, 
possibilitando assim a produção em larga escala. 
Também é possível observar que o método utilizado neste trabalho, por mais que seja possível 
a extração e purificação da mesma, mostra uma baixa eficiência, gerando amostras com ≅ 50% de 
aproveitamento, também pode ser observado o facto da proteína GFP extraída neste trabalho não 
apresentar alto grau de fluorescência na frequência normal, facto que pode ser atribuído ao método 
de extração, o qual por vezes passa por determinados períodos onde não se mantem o controle 
preciso da temperatura, tampouco o controle de pH, que é citado em diversos artigos como um 
importante fator para a eficiência na extração da GFP. 
Também pode-se citar que o método de extração mais indicado, seria o método bifásico 
aquoso-micelar baseado em componentes salinos, onde, segundo pesquisas recentes, como 
Quental, M. V et al. 2015, dentre outros, afirmam maior simplicidade e eficácia nos resultados. 
Quando aos métodos de eletroforese, quando utilizados na proteína GFP, os resultados foram 
inconclusivos, não apresentando bandas nos géis, podendo ser devido a qualquer tipo de 
degradação ou algum erro de manuseio durante a preparação das amostras para a sequencia. 
Logo, para o desenvolvimento, foi utilizado um gel da turma 23, grupo 1 e 2, o qual contia 
amostras da proteína frxA. 
Após analise e comparação das bandas, o resultado obtido foi que a banda de frxA apresentava 
um tamanho aparente de 24kDa, que é um resultado muito próximo do obtido nos artigos de 
referência disponibilizados, 27kDa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TP3 
 
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29 
 
8. Apêndice 
Tabelas 
Tabela 1 - Riscos e Segurança ........................................................................................................ 9 
Tabela 2 - Riscos e Segurança ...................................................................................................... 11 
Tabela 3 - Curva Padrão de proteína BSA .................................................................................... 11 
Tabela 4 - Valores de diluição das amostras ................................................................................. 12 
Tabela 5 - Riscos e Segurança ...................................................................................................... 13 
 
Figuras 
Figura 1 - Proteína com cauda de Histidinas ou His-tag no C-terminal de uma proteína .............. 3 
Figura 2 - Colunas de cromatografia manuais (ou de fluxo gravitacional) (A, B) com resinas que 
quelatam Ni2+ (C). Formação do complexo entre o Ni2+ e as o grupo imidazole das cadeias 
laterais das histidinas, que permitem a fixação específica de proteínas com His-ta ....................... 4 
Figura 3 - Esquema da eletroforese (SDS-PAGE) .......................................................................... 7 
Figura 4 - Valores para preparo de Gel SDS-PAGE /Moodle - Sebenta Lab IIIB ....................... 15 
Figura 5 - Valores para preparo de Gel SDS-PAGE /Moodle - Sebenta Lab IIIB ....................... 15 
Figura 6 - Absorvância GFP ......................................................................................................... 17 
Figura 7 - Cromatografia por afinidade ........................................................................................ 18 
Figura 8 - Reta de calibração BSA ............................................................................................... 19 
Figura 9 - Amostras e concentração proteica. (F51 e F52 foram excluídas do gráfico por não 
apresentarem valores expressivos). ............................................................................................... 20 
Figura 10 - % de proteínas purificadas ......................................................................................... 20 
Figura 11 - Fluorescência F4 ........................................................................................................ 20 
Figura 12 - Gel Turma 21 Grupo 1 e 2 - Dados de migração total e relativa das bandas proteicas
....................................................................................................................................................... 21 
Figura 13 - Gráfico e equação linear de desvio padrão com base no marcador ........................... 21 
Figura 14 Gráfico e equação linear de desvio padrão com base no marcador (poços sinalizados)
....................................................................................................................................................... 22 
 
 
 
 
 
 
 
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file:///C:/Users/mafsc/Downloads/TP3%20(nao%20final).docx%23_Toc29765902
TP3 
 
30 
 
9. Anexos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15 Corange utilizado no Gel SDS-PAGE pg1 
 
Figura 16 Corange utilizado no Gel SDS-PAGE pg2 
TP3 
 
31 
 
 
Figura 17 Marcador Molecular Utilizado nas amostras pg1 
TP3 
 
32 
 
 
Figura 18 Marcador Molecular Utilizado nas amostras pg2