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◗ Introdução A criação de parasitóides in vitro é um assunto ainda recente, embora os conhe- cimentos sobre a área tenham avançado bastante nos últimos anos e hoje já exis- tam vários casos de sucesso de produção desses inimigos naturais em dietas artificiais (Cônsoli & Parra, 1997a, 1999) (Capítulo 15). Dos países que iniciaram as pesquisas de criação in vitro de Trichogramma spp. no início da década de 70, apenas a China é capaz de produzir esse parasitóide em larga escala, permitindo o contro- le de pragas por meio de sua liberação (Cônsoli, 1997). Países como França, EUA e, mais recentemente, Brasil também buscam o desenvolvimento e aprimoramen- to dessa nova técnica de criação, que proporcionará grandes avanços no atual sis- tema de produção de parasitóides (Grenier, 1997). Hoje, um dos principais objetivos do desenvolvimento de uma dieta artificial para parasitóides, além da simplificação e barateamento do processo de produção, é ampliar os conhecimentos sobre a bionomia e fisiologia do parasitóide, suas exi- gências nutricionais e a interação do inimigo natural e seu hospedeiro. CRIAÇÃO IN VITRO DE Bracon hebetor Introdução 277 Criação de parasitóides in vitro 278 Bracon hebetor: hospedeiros e biologia 280 Criação in vitro de B. hebetor no Brasil 281 Desenvolvimento da dieta artificial 282 Dietas artificiais para a criação de B. hebetor 283 Capacidade de paralisação e parasitismo por B. hebetor criado nas diferentes dietas e no hospedeiro natural A. kuehniella 287 Qualidade dos insetos produzidos in vivo e in vitro 288 Considerações finais 289 277 ◗ SANDRA REGINA MAGRO ◗ JOSÉ ROBERTO P. PARRA Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola, Esalq/USP, 13418-900, Piracicaba, SP � � � � � 16 CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 277 A maioria dos trabalhos de criação in vitro tem sido feita com endoparasitóides, abordando aspectos de sua biologia e nutrição, e poucos são os relacionados com a criação in vitro de ectoparasitóides como Bracon hebetor Say (Hymenoptera, Braco- nidae) e espécies afins. Dessa forma, visando contribuir para os conhecimentos sobre as exigências nutricionais de parasitóides, foram realizadas pesquisas com B. hebetor, um ectopa- rasitóide larval e importante agente de controle natural de vários lepidópteros- praga, buscando desenvolver uma dieta artificial e estabelecer um sistema para sua criação in vitro. Esse parasitóide, que ocorre em ecossistemas de grãos armazenados (Keever et al., 1985; Prozell & Schöller, 1998), onde ataca muitas traças, tais como Plodia interpunctella (Hueb.) e Anagasta kuehniella (Zeller), é de fácil criação in vivo em laboratório e sua produção in vitro poderá servir de modelo para criação de outros parasitóides, tendo ainda como característica desejável maior tamanho em relação a outros parasitóides criados in vitro, como Trichogramma spp. ◗ Criação de parasitóides in vitro A importância de parasitóides como agentes de controle tem estimulado o interesse em estudos dietéticos, visando a criação massal sobre meios sintéticos como alternativa para redução dos custos de produção. Contudo, o desenvolvi- mento de tais tecnologias in vitro requer conhecimentos sobre a fisiologia e o metabolismo de parasitóides e um entendimento da natureza das interações para- sitóide/hospedeiro. Métodos de criação in vitro têm sido usados para examinar as exigências nutri- cionais quantitativas e qualitativas, bem como a bioquímica nutricional, e o aper- feiçoamento dessas técnicas depende de estudos e conhecimentos sobre a fisiologia do parasitóide no que se refere a nutrição, genética e comportamento (Thompson, 1986). Apesar dessas limitações, tecnologias de criação estão disponíveis e muitos parasitóides/predadores podem ser criados continuamente em meios artificiais (Guerra et al., 1993; Thompson, 1999). Cônsoli & Parra (1997a) citaram Prell (1915) como o primeiro autor a criar um parasitóide, Parasetigena agilis, em dieta artificial para estudos de sua biologia. Entretanto, o interesse pela utilização dessa técnica de criação para produção de insetos para uso em programas de controle biológico começou a aumentar, espe- cialmente para parasitóides, apenas na década de 70. Os mesmos autores relataram que técnicas in vitro já permitiram a criação de 71 espécies de parasitóides, obten- do-se adultos em 53 delas. As pesquisas estão concentradas nas ordens Diptera e Hymenoptera, com 16 e 55 espécies estudadas, respectivamente. A ordem Hyme- noptera, no entanto, tem apresentado maior número de casos bem-sucedidos. O primeiro relato de criação de Trichogramma pretiosum Riley, de ovo a adulto, em dieta artificial sem adição de componentes de ovos do inseto hospedeiro foi feito por Hoffman et al. (1974). Os autores verificaram que as porcentagens de pupação e emergência dos adultos foram semelhantes nos dois sistemas de criação (in vivo e in vitro). Os parasitóides criados em dieta artificial acasalaram e oviposita- ram de forma similar àqueles produzidos in vivo; contudo, aproximadamente 60% dos adultos criados em meio artificial não expandiram completamente as asas. Na América do Sul, Parra e Cônsoli (1992) foram os primeiros a obter a criação de um parasitóide (T. pretiosum) in vitro, embora com baixa viabilidade e grande deforma- ção de abdômen e asas dos parasitóides produzidos. Cônsoli & Parra (1996) estudaram a biologia de T. pretiosum e T. galloi Zucchi criados em hospedeiro alternativo e em dieta artificial e verificaram que o desenvol- C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S278 CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 278 vimento de ovo a adulto foi alongado para T. pretiosum criado em dieta artificial; no entanto, não foram observadas diferenças para T. galloi produzido nos dois sistemas de criação. Embora tenha havido problemas de má-formação de abdômen e asas e redução na viabilidade dos parasitóides criados in vitro, não foram observadas dife- renças no tamanho dos adultos e na morfologia do aparelho genital dos parasitóides provenientes dos dois sistemas de criação. Em trabalho subseqüente, Cônsoli & Parra (1997b) verificaram que as duas espécies desse parasitóide mostraram diferen- ças nas exigências nutricionais para seu desenvolvimento, mas hemolinfa de inseto (70%) e gema de ovo (20%) foram essenciais para ambas. Os autores concluíram que a má-formação de asas estava relacionada com a alta umidade nos recipientes de criação, sendo essa característica observada em T. galloi quando criado também em hospedeiro natural em condição de alta umidade relativa. Nordlund et al. (1997), pesquisando a viabilidade de T. minutum Riley produzi- do in vitro por dez gerações consecutivas, constataram que fêmeas criadas in vitro foram maiores, mais longevas e parasitaram mais ovos de Helicoverpa zea (Bod- die)do que aquelas criadas in vivo. A porcentagem de emergência dos adultos foi semelhante nos dois sistemas de criação; entretanto, houve maior índice de defor- mação de adultos naquela população criada in vitro, para todas as gerações. Traba- lho recente de Xie et al. (1997) mostrou a criação de T. minutum e T. brassicae Bezdenko, de ovo a adulto, em dietas sem componentes de insetos, e a melhor dieta proporcionou viabilidade larval de 94% e pupal de 28% para T. minutum. Tais estudos representam um avanço no desenvolvimento da criação desses parasitói- des in vitro, pois eliminam totalmente a necessidade de produção simultânea de outra espécie de inseto. Thompson (1975) utilizou dieta líquida dissolvida em pedaços de algodão para o ectoparasitóide Exeristes roborator (Fabricius), transferindo larvas para dietas novas sempre que havia ressecamento destas; o autor obteve viabilidade total de 30% e os machos apresentaram tamanho semelhante ao daqueles criados em hos- pedeiro natural. O maior problema encontrado nesse procedimento de criação foi que o líquido livre envolvia e matava larvas do ectoparasitóide, particularmente nos primeiros ínstares.Apesar de E. roborator não apresentar adaptações respirató- rias ou alterações essenciais para viver em meios líquidos como os endoparasitói- des, quando se adicionou agente gelificante à dieta líquida, os parasitóides mostraram crescimento e desenvolvimento semelhantes aos daqueles criados em duas espécies de hospedeiros naturais, Pectinophora gossypiella (Saunders) e Phthori- maea operculella (Zeller). A porcentagem de parasitóides obtidos foi superior a 80%, maior do que quando criados em hospedeiros naturais. Os parasitóides produzidos in vitro foram comparáveis, em tamanho, àqueles criados in vivo e, muitas vezes, com uma proporção maior de fêmeas. As fêmeas criadas in vitro foram normais com relação à alimentação e prontamente ovipositaram, com uma produção adequada de ovos para a espécie. Bracon mellitor Say e Catolaccus grandis Burks, importantes ectoparasitóides de Anthonomus grandis Boheman, foram criados com sucesso em dietas contendo hemolinfa de inseto de diferentes fontes; contudo, as porcentagens de pupação e emergência de adultos foram muito menores, para as duas espécies, quando com- paradas aos insetos criados em hospedeiro natural (Guerra, 1992). No ano seguin- te, Guerra et al. (1993), trabalhando com os mesmos parasitóides em dietas artificiais desprovidas de componentes de insetos, observaram que o ciclo de vida de ambos foi reduzido significativamente em relação à criação in vivo. A emergên- cia de adultos foi maior para C. grandis produzido in vitro e não diferiu estatistica- mente do controle para B. mellitor criado em dieta artificial. 279C R I A Ç Ã O I N V I T R O D E B r a c o n h e b e t o r CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 279 Guerra & Martinez (1994) adaptaram a dieta previamente desenvolvida por Guerra et al. (1993) para a criação de C. grandis e, nesse caso, números significati- vamente superiores de ovos foram conseguidos quando se adotou o sistema de criação fechado in vitro, comparados àqueles obtidos no método de criação in vivo, tendo larvas do bicudo-do-algodoeiro como hospedeiro. O período larval e a dura- ção do ciclo de vida (ovo-adulto) foram consideravelmente menores quando se uti- lizou o método de criação in vivo, embora a diferença numérica tenha sido menor do que um dia; no entanto, a produção de adultos foi significativamente maior (25%) quando criados in vitro. Os resultados indicam que não houve efeito no comportamento geral dos parasitóides, no acasalamento, na fecundidade e na fer- tilidade, quando comparados aos parasitóides criados in vivo. C. grandis foi produzido em cinco dietas artificiais por Rojas et al. (1996), veri- ficando-se que não houve diferença na razão sexual da progênie das fêmeas cria- das tanto em hospedeiro natural como em dieta artificial; apesar disso, o peso das pupas foi significativamente menor do que o controle e as fêmeas criadas in vitro produziram menos ovos. Esses resultados demonstraram haver uma correlação entre o peso das pupas e a fecundidade para esse ectoparasitóide. Em trabalho subseqüente, Rojas et al. (1997) descreveram a viabilidade do uso de dietas artificiais para a criação massal de C. grandis, uma vez que os parasitóides mostraram-se prontamente aptos ao parasitismo e controle da praga e os custos de produção foram drasticamente reduzidos. Testes de campo demonstraram a poten- cialidade desse agente de controle biológico quando criado in vitro (Morales-Ramos et al., 1998). Registro da criação de B. hebetor em dieta artificial encapsulada em parafilme foi feito por Xie et al. (1989). O parasitóide completou o desenvolvimento larval em 12-13 dias, na temperatura de 26-28ºC e umidade relativa de 75-80%. As viabili- dades das fases de ovo, larva e pupa foram respectivamente 72%, 48% e 24%. Yaz- lovetsky et al. (1992) estudaram a possibilidade de criação desse mesmo ectoparasitóide em meio oligídico, constatando o desenvolvimento do segundo íns- tar até o estágio de pupa, com cerca de 80% de adultos normais. ◗ Bracon hebetor: hospedeiros e biologia B. hebetor possui um grande número de hospedeiros, havendo relatos de sua ocorrência em laboratório e em condições naturais. Quase todas as espécies de lepi- dópteros que atacam produtos armazenados são por ele parasitadas. Os hospedei- ros mais freqüentes são: Anagasta kuheniella (Zeller) (Parra et al., 1989; Shonouda & Nasr, 1998), Ephestia cautella (Walker) (Hagstrum, 1983; Wool et al., 1987), Cadra cautella (Walker) (Cline et al., 1984; Keever et al., 1985, 1986; Cline, 1989; Cline & Press, 1990; Brower & Press, 1990), Plodia interpunctella (Hueb.) (Reinert & King, 1971; Keever et al., 1985, 1986; Brower & Press, 1990; Jervis et al., 1994), Corcyra cephalonica Stainton e Helicoverpa armigera Hbn. (Nikam & Pawar, 1993). Esse ectoprasitóide é eficiente no controle de traças de produtos armazenados, reduzindo a população dessas espécies, e por isso é considerado um potencial agen- te de controle biológico (Cline et al., 1984; Wool et al., 1987; Prozell & Schöller, 1998). Esse braconídeo mostra melhores resultados no controle das traças em altas temperaturas (Parra et al., 1989), sendo atraído pelo frass de A. kuehniella (Parra et al., 1996). A liberação de predadores e parasitóides que atacam diferentes fases do desenvolvimento da praga pode melhorar a eficiência do controle biológico e superar o complexo de pragas em produtos armazenados (Keever et al., 1986). C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S280 CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 280 Brower & Press (1990) citaram experiências positivas na utilização de parasitóides em programas de controle biológico de lepidópteros-praga em grãos armazenados. Eles salientaram que o emprego de inimigos naturais, incluindo B. hebetor, propor- cionou melhores resultados do que o controle convencional com Malathion em amendoim. Inoue (1997) encontrou boas perspectivas de controle de Sitotroga cerealella (Olivier) em milho armazenado quando esse parasitóide foi associado a T. pretiosum. Quanto a sua biologia, Serra (1992), utilizando A. kuehniella como hospedeiro, constatou que houve uma relação inversa entre a duração do desenvolvimento desse braconídeo e a elevação da temperatura em todas as fases de seu ciclo, bem como na longevidade dos adultos. O limiar térmico inferior de desenvolvimento para esse parasitóide foi de 13,9ºC e a constante térmica, de 150,8 GD. A tempera- tura mais adequada para a criação do parasitóide, segundo o mesmo autor, é a de 32ºC, sendo constatado que B. hebetor promove a paralisação do hospedeiro em temperaturas superiores a 8ºC e oviposita quando a temperatura do ambiente está acima de 14ºC. No que se refere à idade do hospedeiro, o mesmo autor verificou que B. hebe- tor paralisa igualmente lagartas de quarto e quinto ínstares, mas o parasitismo foi significativamente maior naquelas de quinto ínstar. Hagstrum (1983) também observou que a freqüência de ataque de B. hebetor sobre E. cautella aumentou em lagartas de último ínstar; menor taxa de sobrevivência foi verificada para insetos criados em lagartas hospedeiras menores (Taylor, 1988). A tabela de vida de fertilidade de B. hebetor em C. cephalonica foi estudada por Nikam & Pawar (1993). Estes constataram que a duração das fases imaturas e a longevidade desse ectoparasitóide foram de 13 e 37,5 dias, respectivamente, enquanto a relação entre macho e fêmea da descendência foi 1,9:1. Esses autores verificaram, ainda, que a capacidade inata de aumento foi de 0,215 por fêmea por dia e que a população multiplicou-se 52,12 vezes em um período de 18,38 dias (uma geração). Serra (1992) observou, a 25ºC, que a duração da fase larval foi de 14,5 dias, com longevidade das fêmeas de 18,7 dias e razão sexual de 0,7. Quanto à capaci- dade de parasitismo e ritmo de postura, o mesmo autor constatou que B. hebetor deposita, em média, 231 ovos, com uma grande variação, oscilando entre 6 e 631 ovos por fêmea. A quantidade média de ovos colocada por diatambém foi variá- vel. Nikam & Pawar (1993) verificaram que o número médio da progênie desse parasitóide foi de 258,9, com uma pequena variação nos valores observados. ◗ Criação in vitro de B. hebetor no Brasil As pesquisas para o desenvolvimento de dieta artificial e elaboração de um sis- tema de criação para ectoparasitóides iniciaram-se em 1998 no Brasil (Magro et al., 1998). A proposta da pesquisa era desenvolver uma metodologia que pudesse ser adaptada para criação de ectoparasitóides em geral e que servisse de modelo para estudos futuros de nutrição e fisiologia de ectoparasitóides. Como ocorre freqüentemente na criação de A. kuehniella do Laboratório de Biologia de Insetos, da Esalq/USP, onde a referida traça é utilizada como hospedei- ro alternativo para a criação de Trichogramma spp., B. hebetor foi adotado como obje- to de estudo pela facilidade de ser obtido e criado em laboratório e, como comentado anteriormente, por seu grande porte, comparado a outros parasitóides normalmente produzidos in vitro. 281C R I A Ç Ã O I N V I T R O D E B r a c o n h e b e t o r CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 281 Desenvolvimento da dieta artificial Fatores envolvidos. Vários são os fatores que devem ser levados em conta quando se pensa em criação in vitro de parasitóides. Cônsoli & Parra (Capítulo 15) fazem uma abordagem a respeito desse assunto e ressaltam a importância desses fatores, que podem afetar o desenvolvimento do parasitóide, tais como interação com o hospedeiro (fatores biológicos/fisiológicos), consistência (fatores físicos) e pH e pressão osmótica (fatores químicos). Quanto à nutrição, a maioria das dietas para parasitóides tem em sua compo- sição algum conteúdo de insetos (hemolinfa de lagartas ou pupas ou ainda extrato de ovos de hospedeiro), além de outras fontes nutricionais, como soro fetal bovino e soro de albumina bovina. Contudo, as traças dos grãos armazenados, que são hos- pedeiras naturais de B. hebetor, apresentam tamanho bastante reduzido, o que difi- culta a extração da hemolinfa/holotecidos pupais. Assim, tornou-se imprescindível testar e selecionar outros hospedeiros (não naturais, uma vez que os naturais são muito pequenos) para a extração de holotecidos pupais para a confecção da dieta artificial para esse ectoparasitóide. Seleção do hospedeiro para extração da hemolinfa. Inicialmente, foram testadas lagartas de sete espécies para a criação in vivo de B. hebetor, sendo três hos- pedeiros naturais [A. kuehniella, C. cephalonica (ambas Lepidoptera, Pyralidae) e S. cerealella (Lepidoptera, Gelechiidae)] e quatro espécies de lepidópteros hospedeiras não naturais, mas criadas rotineiramente no Laboratório de Biologia dos Insetos, da Esalq/USP [Diatraea saccharalis (Fabr.) (Lepidoptera, Crambidae), Spodoptera frugi- perda (J.E. Smith) (Lepidoptera, Noctuidae), Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepi- doptera, Noctuidae) e Heliothis virescens (Fabr.) (Lepidoptera, Noctuidae)]. As traças de produtos armazenados (A. kuehniella, S. cerealella e C. cephalonica) foram produzidas segundo os métodos propostos por Parra (1997), Bleicher et al. (1987) e Bernardi et al. (2000), respectivamente, sendo utilizado o último ínstar larval para o parasitismo. A broca da cana-de-açúcar (D. saccharalis), a lagarta-da-maçã-do-algodoeiro (H. virescens), a lagarta-do-cartucho-do-milho (S. frugiperda) e a lagarta-da-soja (A. gemmatalis) foram criadas em dietas artificiais conforme Parra & Mishfeldt (1992), Moretti & Parra (1983), Nalim (1991) e Greene et al. (1976), respectivamente. Ofe- receram-se as dietas às lagartas recém-eclodidas em tubos de vidro cilíndricos (2,5 cm de diâmetro x 8,5 cm de altura) tampados com chumaço de algodão hidrófugo, segundo a metodologia de Parra (1999). Essas espécies foram submetidas ao para- sitismo quando as lagartas se apresentavam no terceiro (D. saccharalis) ou quarto ínstar (demais espécies), idades em que foram mais paralisadas e parasitadas por B. hebetor, quando expostas por um período de 24 horas, em relação a outros ínstares (S.R. Magro, dados não publicados). De modo geral, o hospedeiro afetou o tempo de desenvolvimento (ovo-adul- to) e a viabilidade de B. hebetor, havendo tendência de redução da fase larval e melhores resultados de viabilidade total (ovo-adulto) quando os insetos foram cria- dos nas três traças dos grãos armazenados (hospedeiros naturais); a duração média do ciclo (ovo-adulto) foi de 12,5 dias, com viabilidade ao redor de 90%. D. saccha- ralis mostrou-se um bom hospedeiro para a criação de B. hebetor, observando-se duração da fase larval próxima àquela obtida nos hospedeiros naturais, bem como elevada viabilidade (76%). Os demais insetos testados como hospedeiros, além de afetarem drasticamente a duração das fases de desenvolvimento de B. hebetor e pro- porcionarem baixas viabilidades, levaram à formação de pupas e/ou adultos defor- mados, bem como a elevada proporção de pupas sem casulo (Magro & Parra, C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S282 CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 282 2001). Os adultos de B. hebetor provenientes da criação nos hospedeiros naturais e na broca da cana-de-açúcar (D. saccharalis) apresentaram capacidade semelhante de parasitismo, sendo selecionados, para a extração de holotecidos pupais, A. kuehniel- la (hospedeiro natural) e D. saccharalis. Dietas artificiais para a criação de B. hebetor Preparo e composição da dieta. Os holotecidos pupais utilizados na confecção das dietas foram obtidos de pupas de A. kuehniella e D. saccharalis, com idade entre 24 e 48 horas. As pupas passaram por um tratamento térmico (62ºC por 10 minutos) para inativação das fenoloxidades, enzimas responsáveis pela melanização da hemolinfa (Shapiro & Ignoffo, 1973). Em seguida, as pupas foram esterilizadas superficialmente por meio da imersão em solução de hipoclorito de sódio (2% por 10 minutos) e lava- das em água destilada. Os holotecidos pupais extraídos pela compressão em seringa descartável e estéril foram ainda centrifugados por 3 minutos a 2.000 rpm. Descartou- se o material precipitado, utilizando-se o sobrenadante, ao qual foram adicionados os demais componentes da dieta (Tabela 16.1, ver encarte colorido na página 11-E). TABELA 16.1 COMPOSIÇÃO (%) DAS DIETAS ARTIFICIAIS UTILIZADAS PARA AVALIAR O DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE Bracon hebetor (Magro, 2000) Dietas 1 1 2 3 4 5 6 7 2 Holotecidos pupais de D. saccharalis 60 50 50 – – – 40 Holotecidos pupais de A. kuehniella – – – 60 50 50 – Soro fetal bovino 12 15 10 12 15 10 – Hidrolisado de lactoalbumina 12 15 10 12 15 10 – Solução de extrato de levedura – – 10 – – 10 – Gema de ovo 16 20 20 16 20 20 20 Leite semidesnatado – – – – – – 20 Água destilada – – – – – – 10 Mistura de sais de Neisenheimer3 – – – – – – 10 Anticontaminantes4 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 1 Dieta para criação in vitro de Trichogramma galloi e T. pretiosum (Consoli, 1997). 2 Dieta desenvolvida na França para criação in vitro de Trichogramma spp. (Gomes, com. pes.). 3 Formulação: (NaCl 7,5g; KCl 0,1g; NaHCO 3 0,2g)/litro de água destilada. 4 Penicilina, estreptomicina e anfotericina (Antibiotic-Antimycotic Gibco BRL); µL/ml de dieta. Sistema de criação. A dieta preparada foi colocada sobre um pedaço de para- filme distendido sobre uma placa de Petri e em seguida recoberta por outra pelícu- la de parafilme também distendida (Figura 16.1, ver encarte colorido na página 11-E). Os ovos do parasitóide obtidos da criação no hospedeiro natural A. kuehniella foram transferidos, com o auxilio de um pincel fino, para o sistema de criação. Todo o conjunto foi mantido em condições controladas de temperatura (25±2ºC), umi- dade relativa (60±10%) e fotofase (14 horas). Embora essa técnica tenha proporciando o desenvolvimento completo de B. hebetor, a maior viabilidade total (ovo-adulto) obtida foi de 43,07% na dieta 7, em comparação aos 74% no hospedeiro natural (Tabela 16.2). A viabilidade de ovosfoi maior no hospedeiro natural, o que pode ser explicado pelo fato de, nos testes das dietas, os ovos terem sido transferidos para as placas com o auxílio de um pincel, e 283C R I A Ç Ã O I N V I T R O D E B r a c o n h e b e t o r CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 283 esse procedimento pode ter danificado o córion de alguns deles, inviabilizando-os. Maiores prejuízos ocorreram nas dietas 5 e 6, com 56 e 64% de viabilidade de ovos, respectivamente (Tabela 16.2); as demais dietas apresentaram variação entre 66 e 78% para tal viabilidade e não diferiram daquele valor resultante do inseto criado em A. kuehniella (88%). Todas as dietas afetaram a viabilidade larval, cujos valores foram inferiores ao obtido no hospedeiro natural (92%) (Tabela 16.2). As maiores viabilidades ocorre- ram nos meios artificiais 7 e 1, com 59 e 50% de viabilidade larval, respectivamen- te. A viabilidade pupal foi alta em todos os tratamentos. Assim, a viabilidade do ciclo total foi variável, dependendo do substrato de criação. Indubitavelmente, a maior viabilidade ocorreu no hospedeiro natural (74%), valor próximo ao verificado por Serra (1992), que encontrou uma viabili- dade total, para B. hebetor em A. kuehniella, de 60,1%. Dentre as dietas, as de núme- ros 1 e 7 superaram numericamente as demais, com 36 e 43% de viabilidade total, respectivamente. As dietas também exerceram efeito sobre a duração do ciclo desse parasitóide. De modo geral, aquelas que continham em sua formulação suspensão de holoteci- dos pupais (HTP) de A. kuehniella (dietas 4, 5 e 6) levaram a um desenvolvimento mais longo das fases imaturas, com duração de aproximadamente 17 dias para o ciclo total (ovo-adulto), em comparação à obtida no hospedeiro natural, A. kueh- niella (15,5 dias) (Tabela 16.3). Valores mais próximos àqueles observados no hos- pedeiro natural foram verificados nas dietas que apresentavam em sua composição holotecidos pupais de D. saccharalis (dietas 1, 2, 3 e 7). Observaram-se efeitos seme- lhantes para outros braconídeos (C. grandis e B. mellitor), sendo o ciclo de vida des- tes variável, quando foram utilizadas hemolinfas de diferentes insetos como componente principal da dieta (Guerra, 1992). A duração da fase larval foi a mais afetada pelas diferentes dietas. Valores de duração dessa fase, observados nos diferentes meios, foram sempre numericamen- te superiores àquele obtido no hospedeiro natural. As dietas 2, 4, 5, 6 e 7 apresen- taram duração da fase larval superior a 7 dias, enquanto em hospedeiro natural foram obtidos 5,8 dias, número significativamente inferior. As dietas 1 (60% de HTP de D. saccharalis) e 3 (50% de HTP de D. saccharalis acrescida de mais uma fonte de proteína – extrato de levedura) foram estatisticamente semelhantes ao hospe- deiro A. kuehniella. TABELA 16.2 VIABILIDADE (%) DE FASES E DO CICLO TOTAL (OVO-ADULTO) DE Bracon hebetor CRIADO EM SETE DIETAS ARTIFICIAIS E EM Anagasta kuehniella COMO HOSPEDEIRO NATURAL. TEMPERATURA: 25±2ºC; UMIDADE RELATIVA: 60%±10%; FOTOFASE: 14 HORAS (Magro, 2000) Tratamento Viabilidade (%) Ovo Larva Pupa Ciclo total Dieta 1 (Ds) 73,00 ± 4,64 ab 50,63 ± 8,81 bc 100,00 ± 0,00 a 36,00 ± 6,00 bc Dieta 2 (Ds) 66,00 ± 5,34 ab 26,69 ± 5,46 c 100,00 ± 0,00 a 17,00 ± 3,39 cd Dieta 3 (Ds) 75,20 ± 7,48 ab 36,03 ± 5,03 bc 100,00 ± 0,00 a 27,00 ± 4,64 bcd Dieta 4 (Ak) 78,00 ± 4,06 ab 33,89 ± 4,61 bc 91,66 ± 5,27 a 24,42 ± 3,74 bcd Dieta 5 (Ak) 56,00 ± 8,57 b 34,21 ± 1,62 bc 95,00 ± 5,00 a 18,25 ± 3,25 cd Dieta 6 (Ak) 64,00 ± 4,85 b 23,53 ± 6,84 c 96,67 ± 3,33 a 13,17 ± 2,15 cd Dieta 7 (Ds) 76,00 ± 6,96 ab 59,13 ± 7,35 b 98,57 ± 1,43 a 43,07 ± 4,70 b A. kuehniella 88,00 ± 5,83 a 92,25 ± 4,75 a 91,25 ± 3,91 a 74,01 ± 6,89 a Obs.: médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade. (Ds e Ak representam dietas à base de holotecidos pupais de Diatraea saccharalis e A. kuehniella, respectivamente.) C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S284 CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 284 No entanto, a duração da fase pupal foi pouco influenciada pelas dietas; houve até um alongamento dessa fase na dieta natural, embora diferindo apenas da dieta 2 (HTP de D. saccharalis) (Tabela 16.3). Com esses dados verifica-se que as dietas que continham em sua composição holotecidos pupais de D. saccharalis, em diferentes concentrações (dietas 1, 2, 3 e 7), proporcionaram uma duração de ciclo total (ovo-adulto) semelhante àquela verifi- cada nos insetos desenvolvidos no hospedeiro natural (A. kuehniella). Contudo, dessas quatro, as dietas 1 e 3 foram as que se destacaram por não mostrar diferen- ça significativa em nenhum dos parâmetros avaliados relativos à duração do ciclo, quando comparadas aos insetos criados em A. kuehniella. Todas as dietas apresentaram características nutricionais que proporcionaram o desenvolvimento total do parasitóide, em maior ou menor escala, sugerindo a potencialidade de criação desse inseto em meios sintéticos; além disso, demonstra- ram que o sistema utilizado foi adequado, possibilitando às larvas a aquisição do alimento e posteriormente desenvolvimento até a fase adulta. A quantidade de dieta oferecida aos parasitóides (150 µL/20 ovos) foi suficien- te para o desenvolvimento de até 14 insetos (número máximo obtido por repeti- ção), tendo havido ainda sobra de alimento. TABELA 16.3 DURAÇÃO (DIAS) DAS DIFERENTES FASES E TOTAL (OVO-ADULTO) DE Bracon hebetor CRIADO EM SETE DIETAS ARTIFICIAIS E EM Anagasta kuehniella. TEMPERATURA: 25±2ºC; UMIDADE RELATIVA: 60%±10%; FOTOFASE: 14 HORAS (Magro, 2000) Tratamento Viabilidade (%) Ovo Larva Pupa Ciclo total Dieta 1 (Ds) 1,58 ± 0,121 a 6,27 ± 0,231 bc 7,46 ± 0,206 ab 15,30 ± 0,200 c Dieta 2 (Ds) 1,30 ± 0,122 a 7,11 ± 0,323 ab 7,04 ± 0,088 b 15,45 ± 0,244 c Dieta 3 (Ds) 1,61 ± 0,149 a 6,81 ± 0,165 abc 7,88 ± 0,220 ab 16,30 ± 0,371 abc Dieta 4 (Ak) 1,79 ± 0,096 a 7,56 ± 0,208 a 7,65 ± 0,242 ab 17,00 ± 0,129 a Dieta 5 (Ak) 1,75 ± 0,147 a 7,62 ± 0,197 a 7,65 ± 0,187 ab 17,02 ± 0,327 a Dieta 6 (Ak) 1,76 ± 0,080 a 7,43 ± 0,137 a 8,05 ± 0,354 ab 17,24 ± 0,261 a Dieta 7 (Ds) 1,64 ± 0,107 a 7,41 ± 0,161 a 7,60 ± 0,235 ab 16,66 ± 0,209 ab A. kuehniella 1,58 ± 0,133 a 5,84 ± 0,350 c 8,18 ± 0,138 a 15,59 ± 0,221 bc Obs.: médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade. (Ds e Ak representam dietas à base de holotecidos pupais de Diatraea saccharalis e A. kuehniella, respectivamente.) Há, contudo, necessidade de adaptações e aperfeiçoamentos, visando melho- rar esse sistema de criação, especialmente no que diz respeito à transferência de ovos do parasitóide, pois a inviabilidade dos ovos, comprovadamente ocasionada pelo manuseio, foi um dos grandes responsáveis pela baixa viabilidade total. Outro parâmetro utilizado em busca de uma dieta com características nutricio- nais adequadas para a criação de B. hebetor foi a formação de casulo protetivo. Ape- nas cerca de 2% das pupas oriundas de larvas que se desenvolveram no hospedeiro natural não formaram casulo (Figura 16.2, ver encarte colorido na página 12-E e Figu- ra 16.3). O mesmo não ocorreu nos insetos criados nas dietas artificiais, sendo encon- trados nas dietas 1 e 3, 20 e 30% de pupas sem casulo, respectivamente. Nas demais dietas, foram registrados de 60 a 70% de pupas sem casulo, valores significativamen- te superiores aos encontrados para insetos criados em A. kuehniella (Figura 16.3). Mais uma vez verifica-se a superioridade da dieta 1 em relação às demais, pois esta, além de proporcionar uma duração de ciclo do parasitóide semelhante àque- la verificada no hospedeiro natural (Tabela 16.3) e também alta viabilidade (Tabe- 285C R I A Ç Ã O I N V I T R O D E B r a c o n h e b e t o r CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 285 C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A SI T Ó I D E S E P R E D A D O R E S286 FIGURA 16.3 Médias de pupas de Bracon hebetor que não formaram casulo quando criadas em diferentes dietas artificiais e em Anagasta kuehniella (hospedeiro). Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 1% de probabilidade. (Ds e Ak representam dietas à base de holotecidos pupais de Diatraea saccharalis e A. kuehniella, respectivamente) (Magro, 2000) FIGURA 16.4 Fenograma obtido da análise de agrupamento para sete dietas e hospedeiro natural testados para Bracon hebetor. Fenograma UPGMA por distância euclidiana média. Grau de correlação fenética (CCC): 0,847; grau de encadeamento (C): 0,667; P (35%) = 0,577. (Números de 1 a 7 correspondem às dietas; 8, ao hospedeiro natural, Anagasta kuehniella) (Magro, 2000) CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 286 la 16.2), levou ao desenvolvimento de maior número de pupas com casulo (ape- nas 20% sem produção de seda) (Figura 16.3), sendo dentre as dietas aquela que mais se aproximou do hospedeiro natural. A ausência de casulo protetivo para parasitóides criados em dieta artificial tam- bém foi relatada por Guerra (1992) para B. mellitor. Esse autor verificou que apro- ximadamente 65% das pupas não formaram casulo. Entretanto, em tal caso, essa forma atípica de pupação não afetou a sobrevivência pupal ou a emergência dos adultos. A falta/inadequação da alimentação afeta a ecdise nos insetos, bem como a glândula de seda para lepidópteros como Bombyx mori L. e Galleria mellonella L. (Prudhomme et al., 1985; Sehnal & Akai, 1990), e aquelas que ficam sem se ali- mentar produzem casulos pouco fibrosos, utilizando apenas a seda que havia sido depositada antes do período de inanição. Pelas análises em microscopia óptica do material criado na Esalq/USP, não foi observada diferença na morfologia externa das glândulas salivares de B. hebetor criado in vivo e in vitro. De modo geral, pode-se dizer que o inseto possui um par de glândulas localizadas lateralmente ao corpo, distinguindo-se, aparentemente, ape- nas duas regiões: o ducto comum e uma região secretora. Há necessidade de apro- fundamento do estudo, por meio de análise de ultra-estrutura da glândula para caracterização das regiões e de suas funções. Na quantificação de proteína pelo método de Bradford (1976) das amostras de glândulas dos insetos que se alimentaram no hospedeiro natural (A. kuehniella) e daqueles criados na dieta 7 foram encontrados 3,196 microgramas de proteína por microlitro de amostra no primeiro caso e 0,849 no segundo. A separação das pro- teínas por eletroforese indicou que, aparentemente, não houve diferença qualita- tiva entre as amostras. No entanto, há um indício de que as glândulas dos insetos criados na dieta artificial continham menor quantidade de proteínas, evidenciada pela menor intensidade de coloração dessas bandas. Esse trabalho sugeriu que pos- sivelmente haja diferença na concentração de proteína do conteúdo das glândulas dos insetos criados na traça (hospedeiro natural) e na dieta artificial; entretanto, tal estudo deve ser aprimorado. Capacidade de paralisação e parasitismo por B. hebetor criado nas diferentes dietas e no hospedeiro natural A. kuehniella A capacidade de paralisação foi semelhante para praticamente todos os trata- mentos, exceto para os insetos criados na dieta 3, na qual B. hebetor paralisou menos de 50% dos hospedeiros. As demais dietas atingiram porcentagens de para- lisação semelhantes às observadas nos insetos criados no hospedeiro natural (75%), e os parasitóides alimentados na dieta 7 foram aqueles que apresentaram valor numérico mais próximo ao obtido pelos insetos criados em A. kuehniella (Tabela 16.4). A dieta 1 se destacou não apenas por proporcionar ciclo biológico do parasitói- de com duração próxima àquela verificada na criação do inseto no hospedeiro natural, elevada viabilidade e baixa proporção de indivíduos sem formação de casulo, mas também por apresentar alta capacidade de paralisação (Tabela 16.4), revelando-se um bom substrato para desenvolvimento desse ectoparasitóide; seu único aspecto negativo foi o de proporcionar baixo percentual de parasitismo. As dietas 6 e 7 também apresentaram índices elevados de paralisação e parasitismo, comparáveis aos verificados quando o inseto foi criado na dieta 1 e em A. kuehniel- la (hospedeiro natural). 287C R I A Ç Ã O I N V I T R O D E B r a c o n h e b e t o r CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 287 TABELA 16.4 CAPACIDADE DE PARALISAÇÃO E DE PARASITISMO, DURANTE 72 HORAS, DE Bracon hebetor CRIADO EM SETE DIETAS ARTIFICIAIS E EM HOSPEDEIRO NATURAL (Anagasta kuehniella). TEMPERATURA: 25±2ºC; UMIDADE RELATIVA: 60±10%; FOTOFASE: 14 HORAS (Magro, 2000) Tratamento Porcentagem (média) Paralisação Parasitismo1 A. kuehniella 75,10 ± 3,6 a 22,86 ± 2,9 a Dieta 7 (Ds) 71,49 ± 8,6 ab 13,28 ± 3,2 ab Dieta 6 (Ak) 67,13 ± 6,1 ab 12,11 ± 1,7 ab Dieta 5 (Ak) 66,13 ± 3,8 ab 9,86 ± 1,0 b Dieta 1 (Ds) 60,72 ± 4,4 ab 5,80 ± 8,9 bc Dieta 4 (Ak) 55,81 ± 4,3 ab 5,16 ± 1,3 bc Dieta 2 (Ds) 54,46 ± 6,2 ab 3,89 ± 1,3 c Dieta 3 (Ds) 48,68 ± 8,7 b 11,18 ± 1,7 ab 1 Porcentagem de parasitismo sobre o número total de lagartas oferecidas. Obs.: colunas seguidas por letras iguais não diferem entre si, pelo teste Tukey, ao nível de 5% de probabilidade. (Ds e Ak representam dietas à base de holotecidos pupais de Diatraea saccharalis e A. kuehniella, respectivamente.) Segundo Morrill (1942), as fêmeas de B. hebetor começam a introduzir o ovi- positor em lagartas hospedeiras logo após sua emergência, com o objetivo de para- lisá-las antes de iniciarem a oviposição. Doutt (1959) verificou que as fêmeas desse parasitóide, antes de ovipositarem, procuram paralisar todos os hospedeiros que houver nas proximidades. Esse procedimento permite ao parasitóide alimentar-se da hemolinfa que exsuda do corpo do hospedeiro, resultando em sua paralisação motora e, conseqüentemente, facilitando a oviposição (Beard, 1972); a morte do hospedeiro, contudo, demora a acontecer. Qualidade dos insetos produzidos in vivo e in vitro Machos provenientes das diferentes dietas apresentaram longevidade variável entre quatro e seis dias, valor inferior ao observado quando o parasitóide foi cria- do no hospedeiro natural. No entanto, as fêmeas do parasitóide criadas nas dietas foram tão longevas quanto aquelas produzidas no hospedeiro natural, chegando a uma longevidade média de 39 dias. A oviposição de B. hebetor foi distribuída durante toda a vida das fêmeas; o número total de ovos colocados pelas fêmeas, durante toda a vida, foi de 506, 576, 414, 489, 514, 393, 429 e 408 para insetos criados no hospedeiro natural (A. kueh- niella) e nas dietas de 1 a 7, respectivamente. Os valores de longevidade (fêmeas), parasitismo, ritmo de postura e número total de ovos depositados demonstraram a potencialidade da criação in vitro desse ectoparasitóide, bem como salientaram que, para a primeira geração criada no substrato artificial, a não formação de casulo não afetou o desempenho dos adul- tos. Há possibilidade, no entanto, que pela criação sucessiva em meios sintéticos possa ocorrer alguma deficiência nutricional, especialmente protéica, uma vez que se sabe que a seda é formada de proteína (Craig, 1997). A progênie (geração F1) foi igualmente viável para todos os tratamentos testa- dos, apresentando viabilidades de ciclo total (ovo-adulto) em torno de 80%. Entre- tanto, apesar da grande quantidade de ovos do parasitóide colocados sobre A. kuehniella quando criado nas diferentes dietas e no hospedeiro natural e da alta via- C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S288 CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 288 bilidade da F1, constatou-se nesse experimento que, após aproximadamente o tri- gésimo dia de vida adulta da geração maternal, a razão sexual da F1 caiu a zero, indicando que houve colocação de ovos não fecundados, que originaramape- nas machos. Pelo acompanhamento dos casais, sabia-se que as fêmeas eram copuladas, pois comprovadamente as primeiras posturas originaram machos e fêmeas. Assim, acredita-se que houve esgotamento dos espermatozóides e então as fêmeas passaram a depositar ovos haplóides, dando origem apenas a machos, pois esse inseto apresenta partenogênese arrenótoca. O aumento na produção de machos, com o envelhecimento das fêmeas, também foi observa- do por Corrêa-Ferreira & Zamataro (1989) para o parasitóide de ovos Trissolcus basalis (Wool.). Em parasitóides do gênero Bracon, espécie próxima a hebetor, ovos não fer- tilizados desenvolveram machos haplóides, mas ovos fertilizados, e portanto diplóides, podem dar origem a machos e fêmeas (Holloway et al., 1999). Ode et al. (1997) verificaram o efeito da produção de apenas machos por fêmeas de B. hebetor não acasaladas ou por aquelas em que foram removidos os espermato- zóides. Pela análise de agrupamento, constatou-se similaridade entre as dietas 4 e 5, com 72% de aproximação, e entre a dieta 1 e o hospedeiro natural, com probabi- lidade de 65% de acerto. As demais encontram-se associadas a um ou outro grupo em diferentes níveis (Figura 16.4). Assim, a dieta 1, a mais adequada também para a criação in vitro de T. pretio- sum e T. galloi (Cônsoli & Parra, 1997b), foi a que proporcionou condições mais pró- ximas àquelas do hospedeiro natural para a criação de B. hebetor. A análise de componentes principais proporcionou a identificação dos caracte- res que mais influenciaram a formação dos agrupamentos. A significância dessa análise foi superior a 70%, considerando-se os eixos X, Y e Z (Figura 16.5). As dietas 1 e 7 foram as que mais se aproximaram do hospedeiro natural, for- mando assim um grupo. A viabilidade larval foi o componente que mais influen- ciou esse agrupamento, seguido da duração do ciclo e da capacidade de paralisação. Contudo, a elevada duração de ciclo obtida nos parasitóides criados na dieta 7, bem como a alta proporção de pupas sem casulo, torna essa dieta mais distante do agru- pamento principal. Com isso, conclui-se que a dieta 1, levando-se em conta os parâmetros biológi- cos duração do ciclo, viabilidades larval e pupal, longevidade das fêmeas, fecundida- de e agressividade, é, dentre as dietas testadas, a mais adequada para a criação de B. hebetor. ◗ Considerações finais Este trabalho descreve o primeiro registro de criação in vitro de um ectoparasi- tóide na América Latina e demonstra a potencialidade dessa tecnologia para cria- ção de parasitóides, visando aprofundamento dos estudos de interação parasitóide/hospedeiro e de sua biologia. O resultado é consistente e traz perspectivas de novas pesquisas que contem- plem, principalmente, estudos de fisiologia, morfologia de imaturos e nutrição de B. hebetor. Os próximos passos devem esclarecer os mecanismos de produção e secreção da seda, o que está intrinsecamente ligado ao reconhecimento das neces- sidades nutricionais desse parasitóide, especialmente protéicas, haja vista que a seda é constituída de proteína (Craig, 1997). 289C R I A Ç Ã O I N V I T R O D E B r a c o n h e b e t o r CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 289 ◗ Referências bibliográficas Beard, R.L.1972. Effectiveness of paralyzing venom and its relation to host discrimination by braconid wasps. Ann. Entomol. Soc. Am. 65: 90-93. Bernardi, E.B, M.L. Haddad & J.R.P. Parra. 2000. Comparison of artificial diets for rearing Corcyra cephalonica (Stainton, 1865) (Lepidoptera: Pyralidae) for Trichogramma mass pro- duction. Rev. Bras. Biol. 60: 45-52. Bleicher, E., C.P. Stein, J.R.P. Parra & I.L. Rodriguez Filho. 1987. Método modificado de cria- ção de Sitotroga cerealella (Oliv., 1819) (Lep.: Gelechiidae) para estudos com Trichogram- ma. An. Soc. Entomol. Brasil 16: 447-451. 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(Números 1 a 7 correspondem às dietas; 8 ao hospedeiro natural, Anagasta kuehniella.) (Magro, 2000). CONTROBIOLOG•Cap.16 21/5/02 8:40 AM Page 290 Cline, L.D. & J.W. Press. 1990. Reduction in almond moth (Lepidoptera: Pyralidae) infesta- tion using commercial packaging of foods in combination with the parasitic wasp, Bra- con hebetor (Hymenoptera: Braconidae). J. Econ. Entomol. 83: 1110-1113. Cline, L.D., J.W. Press & B.R. Flaherty. 1984. Preventing the spread of the almond moth (Lepidoptera: Pyralidae) from infested food debris to adjacent uninfested packages, using the parasite Bracon hebetor (Hymenoptera: Braconidae). J. Econ. Entomol. 77: 331-333. Cônsoli, F.L. 1997. Criação in vitro de Trichogramma galloi Zucchi, 1988 e T. pretiosum Riley, 1879 (Hym.: Trichogrammatidae): desenvolvimento de um ovo artificial e aprimora- mento de dietas artificiais. Piracicaba, Esalq, 153p. (Tese de Doutorado). Cônsoli, F.L. & J.R.P. Parra. 1996. 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