Western Blotting

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ANNA BEATRIZ VARGAS DA SILVA
JOÃO AUGUSTO
JULIA BRANDÃO MARTINS
KARINE RAATS
VITOR FRANCISCO
WESTERN BLOTTING
ANÁLISE DE PROTEÍNAS
WESTERN BLOTTING: ANÁLISE DE PROTEÍNAS
• Um experimento western blotting, também conhecido como protein 
immunoblotting, foi introduzido por Towbin, em 1979 e tornou-se uma técnica 
de rotina muito utilizada na biologia molecular para análise de proteínas.
• Com esta técnica, é possível detectar, caracterizar e semi-quantificar 
múltiplas proteínas, principalmente aquelas que estão em baixas quantidades 
na amostra, obtendo informações sobre a massa molecular e a quantidade 
relativa existente.
Introdução
WESTERN BLOTTING: ANÁLISE DE PROTEÍNAS
• Baseia-se na separação das proteínas por peso molecular através de uma eletroforese, 
seguindo-se da transferência para uma membrana e a detecção da proteína de interesse 
com um anticorpo específico.
• Os passos para a elaboração dessa técnica pode ser resumida em cinco etapas:
1ª - Extração e quantificação das proteínas
2ª - Eletroforese em gel de poliacrilamida
3ª - Transferência das proteínas para uma membrana
4ª - Incubação e detecção da proteína específica
5ª - Revelação dessa membrana para análise dos dados
Técnica
WESTERN BLOTTING: ANÁLISE DE PROTEÍNAS
• As amostras são homogenizadas por sonicação (quebra das células por ondas sonoras de alta 
frequência) ou por força mecânica (centrifugação) resultando em uma mistura homogênea dos 
componentes da célula.
• O método espectroscópico utilizado para quantificação é o método de Bradford, pois é mais 
rápido, não exige aquecimento e apresenta alta sensibilidade para baixas concentrações de 
proteínas.
• Baseia-se na mudança de cor através das interações hidrofóbicas e iônico que estabilizam o 
complexo proteína-corante (da solução ácida avermelhada para a cor azulada com presença de 
proteínas).
• Para quantificar a concentração de proteínas na amostra deve-se fazer uma curva de 
padronização com concentrações conhecidas de uma proteína (soroalbumina bovina, BSA) 
x absorbância em 595 nm (comprimento de onda que o complexo proteína-corante absorve). 
• A partir dessa curva obtém-se a equação de ajuste linear na qual é possível substituir os valores 
médios de absorbâncias das amostras, obtendo-se assim os valores da concentração das proteína.
1ª - Extração e quantificação das proteínas
WESTERN BLOTTING: ANÁLISE DE PROTEÍNAS
• As proteínas da amostra são separadas de acordo com o peso molecular usando-se a eletroforese em gel, 
a técnica mais utilizada é a eletroforese desnaturante, em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), fazendo 
com que as proteínas sejam separadas por peso molecular.
• Inicialmente prepara-se o gel, que será uma matriz inerte através da qual as proteínas poderão migrar. 
Para que as proteínas migrem apenas em uma direção ao longo do gel, as amostras são carregadas lado-a-
lado em "valas" feitas no gel. Elas são então separadas por massa em "bandas" dentro de cada canaleta. 
Uma canaleta é reservada para um "marcador", ou ladder, uma mistura disponível comercialmente de 
proteínas de pesos moleculares conhecidos.
• As proteínas podem possuir cargas positivas ou negativas, dependendo das cargas dos aminoácidos que 
as compõem. É utilizado, então, o SDS (sodium dodecyl sulfate), um poderoso detergente carregado 
negativamente, que se liga nas regiões hidrofóbicas das moléculas de proteínas mascarando a carga 
intrínseca, e permitindo que as proteínas migrem em direção ao polo positivo em um campo elétrico.
2ª - Eletroforese em gel de poliacrilamida
WESTERN BLOTTING: ANÁLISE DE PROTEÍNAS
Visualização de proteínas após eletroforese
• Essas proteínas podem ser visualizadas diretamente no SDS-PAGE por coloração direta do gel, por 
corantes como o Comassie-Blue ou por tratamentos com nitrato de prata. 
• O nitrato de prata é um dos métodos mais sensíveis de detecção, que permite a visualização de proteínas 
de até 10ng, enquanto que a coloração por Coomassie-Blue detecta proteínas de até 300ng.
WESTERN BLOTTING: ANÁLISE DE PROTEÍNAS
• Após a eletroforese, a proteína deve ser transferida do gel para uma membrana, atualmente usa-se a 
transferência eletroforética (electroblotting) que é muito mais rápida.
• O processo envolve o uso de almofadas porosas e papel de filtro para facilitar a transferência.
• Quando um campo elétrico é aplicado, as proteínas se movem para fora do gel de poliacrilamida e para 
a superfície da membrana, onde as proteínas se ligam firmemente. 
• O resultado é uma membrana com um padrão de proteína igual ao que estava originalmente no gel de 
poliacrilamida.
• Depois de terminado o tempo de aplicação da corrente elétrica, usa-se um corante denominado 
Ponceau S para confirmar a transferência das proteínas para a membrana, e verificar se essa 
transferência ocorreu de maneira igual para todas as amostras. 
3ª - Transferência das proteínas para uma membrana
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• Existem três tipos de membranas usadas para western blotting: de nitrocelulose, nylon ou PVDF 
(polyvinylidene fluoride). 
• Diferentes proteínas podem se ligar com eficiências diferentes nessas membranas:
3ª - Transferência das proteínas para uma membrana
Mais utilizada
Menor custo
WESTERN BLOTTING: ANÁLISE DE PROTEÍNAS
• Para visualizar uma proteína de interesse é utilizado um anticorpo específico que vai reagir com um 
epítopo (área da molécula do antígeno que se liga aos receptores celulares e aos anticorpos) da proteína, 
formando um complexo anticorpo-antígeno. 
1ª Etapa: Bloqueio
• A membrana possui uma alta afinidade por proteínas, dessa forma, é necessário bloqueá-la para evitar que 
os anticorpos se liguem a toda a superfície da membrana
• Para bloquear a membrana geralmente é utilizado leite em pó desnatado (LD), ou polímeros sintéticos como 
a poli-vinil-pilorridona (PVP). 
• O bloqueio é realizado com a solução de bloqueio (tampão TBS pH 7,5 + Tween 20 0,3% + Leite Desnatado 
5%) por 1 hora incubado em temperatura ambiente em constante agitação. Após o bloqueio, a membrana é 
lavada com a solução de lavagem (TBS + Tween 20 0,3%) por 3x a cada 5 minutos.
4ª - Incubação e detecção da proteína específica
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2ª Etapa: Incubação 
• A incubação da membrana com o anticorpo primário geralmente ocorre a 4ºC e, depois disso, a 
membrana é lavada 3x com tampão de lavagem para retirar todo o anticorpo que não está 
especificamente ligado à proteína de interesse.
• Depois da lavagem, a membrana é incubada com um anticorpo secundário. Esse anticorpo é um anti-
IgG, ou seja, é um anticorpo que reconhece um anticorpo.
• Esse anticorpo secundário possui alguma modificação que permitirá a visualização da proteína de 
interesse. As principais modificações utilizadas atualmente são:
 Conjugação do anticorpo com uma enzima (peroxidade ou fosfatase alcalina) 
 Associação do anticorpo com um fluoróforo
4ª - Incubação e detecção da proteína específica
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 Conjugação do anticorpo com uma enzima (peroxidade ou fosfatase alcalina) 
5ª - Revelação dessa membrana para análise dos dados
WESTERN BLOTTING: ANÁLISE DE PROTEÍNAS
 Associação do anticorpo com um fluoróforo
5ª - Revelação dessa membrana para análise dos dados