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Disciplina: Microbiologia e Imunologia Aula 3: Morfologia microbiana Apresentação Nesta aula, descreveremos as estruturas comuns nas células procariotas. Muitas funções provavelmente já foram estudadas nas células humanas, mas agora o objetivo principal é demonstrar que algumas estruturas vitais surgiram há bilhões de anos em processos evolutivos que deram origem aos três domínios da vida. Objetivos Explicar as formas das células procariotas nos vários ambientes do planeta; Reconhecer as bases �siológicas das estruturas de procariotos; De�nir vírus e morfologia viral. Estrutura da célula bacteriana. (Fonte: Shutterstock) Morfologia das células Quais são as formas das células procariotas? Será que sua forma é capaz de in�uenciar a divisão ou captação de nutrientes? Quantas estruturas essenciais são necessárias nesse tipo de célula? Essas perguntas são lançadas para que, no decorrer da aula, você possa associar os processos seletivos para evolução dos seres vivos. Observe na �gura quantas estruturas estão presentes em uma bactéria típica. Repare também que algumas dessas estruturas (presentes nas células humanas, como as mitocôndrias) estão ausentes. Isso ocorre porque este modelo é uma versão mais simples de célula, embora todas as suas estruturas satisfaçam completamente as suas adaptações nos mais variados ambientes. Os estudos com bactérias têm fornecido há décadas informações sobre controle da expressão gênica, além do potencial biotecnológico, geoquímico e de biorremediações. Vamos conhecer suas características estruturais? (Fonte: Shutterstock) Forma celular Existem alguns padrões típicos: Coco Forma ovalada ou esférica. Bacilo Mais achatada, parecendo um cilindro Espirilo Mais comprida e torcida em um eixo central Organização Após se dividirem, muitas bactérias se mantêm organizadas em arranjos ou agrupamentos. Elas podem formar: Bacteria Neisseria gonorrhoeae. (Fonte: Shutterstock) Diplococos (duplas) Morfologia de algumas bactérias patogênicas ao homem. (Fonte: Shutterstock) Streptococcus pyogenes. (Fonte: Shutterstock) Longas cadeias Staphylococcus aureus. (Fonte: Shutterstock) Cachos Em alguns casos, esses agrupamentos podem apresentar uma forma geométrica, um cubo tridimensional composto de oito (Sarcina) ou quatro bactérias (Tétrade). Morfologia de algumas bactérias patogênicas ao homem Existe alguma lógica por trás dessas formas celulares? Sim. Suas diversas formas in�uenciam, por exemplo, na captura de nutrientes, no tipo de deslocamento etc.1 http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html = É da ordem de micrômetros. Tamanho da célula 1 micrômetro 0,001 centímetro As bactérias apresentam de 0,2 a 700 micrômetros 2 Mas a forma in�uencia na captura de nutrientes? Se pensarmos que uma célula pequena possui uma maior área super�cial em relação ao seu volume interno, sim. Ela pode trocar muitos nutrientes pela superfície. E, se capturam muitos nutrientes, bactérias pequenas podem crescer mais rápido. Elas se dividem mais e replicam mais vezes o seu DNA , podendo favorecer o aparecimento de mutações .3 4 Membrana Citoplasmática De aparência oleosa - e não �uida, como se pensava antes -, a membrana serve para garantir a barreira de permeabilidade e ancorar muitas proteínas de transporte e reações enzimáticas. Dentro da membrana celular (citoplasma) (Fonte: Shutterstock) http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html Tipos de transporte na membrana citoplasmática. (Fonte: Shutterstock) Toda membrana citoplasmática é uma estrutura delgada com características: Hidrofílica: Dupla camada de fosfolipídios voltada para os meios internos e externos em contato com o solvente; Hidrofóbica: No interior da dupla camada, pela presença de ácidos graxos. As moléculas pequenas e hidrofóbicas atravessam com facilidade a membrana por simples difusão, mas, se forem maiores e com carga (polares), elas precisarão do auxílio de proteínas transportadores. Essas proteínas são transmembrana: atravessam os dois lados da membrana para transportar íons e substâncias de várias maneiras (observe a �gura). (Fonte: Shutterstock) Há três tipos de transporte: 1 Uniporte: Substância levada em um único sentido; 2 Antiporte: Duas moléculas ou íons levados em sentidos contrários; 3 Simporte: Íon e molécula transportados; Exemplo Como exemplo desses transportes, podemos citar: Dissacarídeo lactose é levado com íons H+ (simporte); Íons de cálcio (Ca2 ) e sódio (Na ) atravessam em direções contrárias (antiporte); A água é transportada por proteínas aquaporinas, como a proteína AqpZ da bactéria Escherichia coli. + + Célula procariota A célula procariota exporta enzimas – chamadas de exoenzimas, como amilase e celulase - para produzir a glicose que será transportada pela célula. Em algumas bactérias patogênicas, como Salmonella, Shigella e Escherichia, existe um sistema de secreção que, em humanos, provoca a perda de eletrólitos, provocando infecções intestinais. O citoplasma da célula procariota é formado por 80% de água, contendo íons, proteínas enzimáticas, lipídeos e carboidratos. Estão presentes nesse citoplasma ribossomos, DNA e corpos de inclusão ou grânulos. Saiba mais A membrana plasmática de procariotos possui uma enzima chamada de ATPase ou F1F0. Para os organismos que utilizam oxigênio (aeróbios), ela é o local de síntese de ATP e de manutenção de um potencial elétrico. Essa enzima é tão importante que sua estrutura é praticamente conservada em todos os domínios de vida no planeta. Nos organismos estritamente anaeróbios, que não crescem na presença de oxigênio, a ATPase mantém a força próton motiva, mas sem gerar ATP. Observe na imagem que o �agelo está inserido em um local da membrana da bactéria por onde atravessam muitos íons H . Veja também que a estrutura da ATPase tem formação acoplada de moléculas de ATP para dar energia ao movimento. Após observar essa estrutura, é possível saber qual parte surgiu posteriormente nos eucariotos, substituindo a membrana plasmática na síntese de ATP: a mitocôndria. Agora, a endossimbiose estudada anteriormente faz todo o sentido, não é mesmo? + Membrana de procariotos com vários mecanismos de transporte e geração de ATP através da bomba próton motiva. (Fonte: MADIGAN et al., 2016) Estrutura geral das bactérias (Fonte: Shutterstock) Glicocálice Acima da parede celular, ancoram-se algumas estruturas externas com função de proteção, locomoção e troca de material genético, entre outras. Todas as bactérias apresentam uma camada viscosa externa à parede celular chamada de glicocálice. Ela é formada por um ou vários tipos de açúcar, além de aminoácidos como a glicina. Há dois tipos de camada: 1 Cápsula Bem aderido à parede celular. 5 2 Camada limosa Frouxamente associado à parede celular. Cápsula da bactéria Acinetobacter calcoaceticus, integrante da microbiota intestinal Micrografia eletrônica de Salmonella typhi, mostrando flagelos e as fimbrias mais curtas (ampliação 7,800 x). Foto de J.P. Duguid and J.F. Wilkinson. Fonte: Enciclopédia britânica. Fímbrias e Pili Ainda na superfície da célula bacteriana, há estas duas estruturas formadas por proteínas: Clique nos botões para ver as informações. Estruturas mais longas, �lamentosas, que possuem forte adesão a superfícies e auxiliam na �xação e formação do bio�lme. Fímbrias Mais longo e �no que as fímbrias, aparece em menor número. Sua principal função é trocar o DNA entre as bactérias durante a conjugação, mas serve também para auxiliar a bactéria a se arrastar pela superfície em movimentos pulsantes. Pili http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html Flagelos São estruturas formadas pela proteína �agelina, que funciona em movimentos como uma hélice de barco com gasto de energia. Escherichia coli, exemplo de bactéria com presença de flagelo. (Fonte: Shutterstock)Os �agelos estão presos e ancorados na membrana citoplasmática em várias posições:6 Monótricas Em uma das extremidades. Lofótricas Presos em tufo de �agelos. Anfítricas Nas duas extremidades da célula. Perítricas Por todo o corpo da célula. http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html O movimento pode ocorrer por taxia, ou seja, ele é provocado pela presença de substâncias consideradas atrativas ou repelentes. Na ausência desse gradiente químico, a bactéria apresenta um movimento �agelar aleatório, mas, a partir do reconhecimento da substância, ela inicia movimentos mais amplos, menos oscilantes e direcionados. Se a concentração começar a diminuir, a bactéria lentamente interrompe o seu movimento e reorienta a sua direção. Esses movimentos são chamados de quimiotaxia. A bactéria consegue monitorar o ambiente utilizando, na membrana plasmática, proteínas sensoriais denominadas MCP. Através delas, a bactéria percebe a presença de maltose (atrativo) e de metais pesados, como níquel (repelente). Os movimentos também podem ocorrer em resposta à presença de luz (fototaxia) e oxigênio (aerotaxia). Grânulos Onde ocorre o armazenamento de substâncias. Há reservatórios de carbono, ferro, enxofre, fosfato inorgânico, fosfolipídios e ácidos nucléicos que variam conforme o gênero e a espécie. Magnetossomo Algumas células o possuem. Magnetossomos funcionam como uma bússola respondendo a um campo magnético. Não se sabe ao certo como eles operam, mas uma hipótese é de que sejam responsáveis pela orientação das bactérias marinhas para os sedimentos no fundo do mar onde podem se alimentar. Saiba mais Em áreas impactadas por derrame de petróleo, aumenta muito a quantidade de bactérias no sedimento, pois elas se alimentam de hidrocarboneto. O planeta controla seus desastres - e o nome disso é biorremediação.7 Bio�lme É a associação de vários tipos de micro-organismos sobre uma superfície, como dentes, válvulas cardíacas e próteses anatômicas. Além de impedir o reconhecimento das células fagocitárias do nosso sistema de defesa, essa ecologia microbiana, no caso dos dentes, cria um ambiente propício para a formação da cárie. Pela grande oferta de carboidratos, a atividade metabólica intensa dessas bactérias faz com que elas produzam muitos ácidos que desmineralizam a superfície do dente e ganhem acesso a tecidos mais profundos. O uso de corantes odontológicos auxilia na identificação de biofilmes sobre a superfície dos dentes. (Fonte: Shutterstock) Endósporo As bactérias em condições críticas para sobrevivência, como carência nutricional , levam à formação do endósporo em um processo denominado esporulação. A estrutura do endósporo é formada por: Externamente: Fina camada de proteínas; Internamente: Várias capas formadas por proteínas especí�cas do endósporo e um córtex contendo peptideoglicano. 8 9 O cerne contém, além da membrana citoplasmática, o citoplasma de aspecto gelatinoso com DNA, ribossomos e outros constituintes essenciais para a célula. Não possui água devido à presença de ácido picolínico e cálcio, importante para a manutenção da fase latente. http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html Peptidoglicano de parede celular bacteriana. (Fonte: ROMANIUK; CEGELSKI, 2018) Parede Celular Com o transporte de solutos para o interior da bactéria, a tendência seria um aumento na pressão interna, levando ao risco de rompimento. Para evitar que isso ocorra, as bactérias possuem uma estrutura rígida denominada parede celular. Localizada acima da membrana citoplasmática, ela é importante para manter o ambiente interno protegido de alterações do meio. A parede celular é formada pelos polissacarídeos N-acetilglicosamina (NAG) e N-acetilmurâmico (NAM) dispostos em uma estrutura linear. Entre essas camadas, mantendo-as unidas, há peptídeos e tetrapeptídeos. Saiba mais A enzima lisozima produzida pelas glândulas lacrimais e salivares cliva a ligação entre o NAG e o NAM. Com isso, a bactéria não consegue manter intacta a sua estrutura, transformando-se em protoplasto. Localizadas na membrana citoplasmática, as enzimas transpeptidases têm a importante função de organizar os peptídeos para as ligações cruzadas da parede celular. O antibiótico penicilina atua inibindo a enzima transpeptidase. O autor dessa descoberta (Alexander Fleming) percebeu que não havia crescimento de bactérias se a cultura estivesse contaminada por bolor. Com a sua descoberta, começou a era dos antibióticos. Micoplasmas Patógenos que não possuem parede celular, substituindo-o por uma membrana citoplasmática bem rígida rica em esteróis. A teoria para a ausência dessa parede é que esses micro- organismos naturalmente vivem em ambientes osmoticamente protetores. Arqueas não possuem parede celular nem membrana externa: sua rigidez é substituída por uma pseudomureína, que é a união de N-acetilglicosamina e N-acetiltalosaminurônico. Estrutura da célula de Mycoplasma. A bactéria é o agente causador de doenças sexualmente transmissíveis, pneumoniae, pneumonia atípica e outros distúrbios respiratórios. Não é afetado por muitos antibióticos . (Fonte: Shutterstock) Dependendo dos constituintes da parede celular, as bactérias são divididas em dois grupos: Gram -Negativas e Gram- positivas. Em contato com álcool, as bactérias não têm cor. 10 Vamos conhecer as características dessas duas classi�cações? Gram-positivas http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html Resultado da coloração de cocos Gram-positivos. (Fonte: Shutterstock) Acima, podemos ver o resultado da adição do corante Fucsina em bactérias Gram-positivas: coloração �nal roxa. A parede celular pode apresentar aproximadamente 20 camadas (mais espessas que as poucas camadas de Gram-negativas). Além disso, elas também possuem ácidos teicóico e lipoteicóico ligados à membrana citoplasmática. Estas bactérias podem ter diferentes organizações e formas: Gram-negativas (Fonte: Shutterstock) Nas bactérias Gram-negativas, o vermelho é a coloração �nal após adição do corante Fucsina. Na parede celular, está presente o ácido diaminopimélico. Além disso, ele possui uma membrana externa acima dos peptidoglicanos. Na �gura abaixo, repare no LPS (lipopolissacarídeo) , considerado uma das toxinas mais agressivas para o homem. Também podemos observar a existência de um espaço delimitado entre as membranas citoplasmática e externa. Ele possui muitas enzimas hidrolíticas que transformam os nutrientes para serem transportados. O espaço periplásmico também tem quimiorreceptores para orientar o deslocamento da bactéria até onde haja a maior concentração do alimento que ele desejar. 11 Estrutura da parede celular de bactérias Gram-negativas. (Fonte: Shutterstock) Corte de uma bactéria Gram-negativa mostrando peptídoglicano (PG), membrana externa (OM) e membrana interna (IM). (Fonte: ERICKSON, 2017) Estas bactérias apresentam diferentes organizações e formas: (Fonte: Shutterstock) A morfologia do vírus Na verdade, ela é denominada vírion, que é partícula infecciosa viral. Os vírus estão em todos os ambientes do planeta e em todos os seres vivos, inclusive em bactérias. Em procariotos, eles auxiliam na transferência de genes, embora participem também da manutenção do ciclo de matéria nos oceanos. http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html Como de�nimos os vírus? Parasitas intracelulares? A resposta é sim. No entanto, devemos ter cuidado, pois também existem bactérias intracelulares, como Chlamydia e Ricketsia. Vírus são de�nidos como estruturas subcelulares, de replicação intracelular, cuja função básica é a replicação e ampli�cação do seu genoma. Podemos, assim, diferenciá-los das bactérias. Estrutura Formada por uma superfície de proteínas em arranjos geométricos bem de�nidos chamados de capsômeros. O conjunto de capsômeros forma o capsídeo . Na estrutura do capsídeo, são projetadas ainda as glicoproteínasespecializadas no reconhecimento da célula hospedeira. Elas são chamadas de espículas. O capsídeo envolve o material genético e algumas proteínas, a maioria delas enzimas utilizadas para iniciar a sua replicação na célula. Alguns vírus possuem uma membrana fosfolipídica sobre o capsídeo; por isso, eles são denominados vírus envelopados. 13 14 Estrutura 3D do vírus influenza, causador da gripe. As glicoproteínas azuis representam a hemaglutinina (HA); em verde, a neuraminidase (NA). O capsídeo em vermelho é formado pelas proteínas M1. O interior contém 8 fragmentos de RNA. Classi�cação De acordo com a morfologia viral, os vírus são classi�cados em: http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula3.html Icosaedro Lembra uma �gura geométrica de 20 faces. Helicoidal Semelhante a um cilindro. Complexos Misto de helicoidal e icosaédrico, como o vírus da gripe. A divisão na classi�cação dos vírus distribui-se em sete grupos de acordo com o genoma viral do tipo DNA ou RNA disposto em uma �ta simples ou �ta dupla de ácido nucléico. Nas células humanas, não existem duas �tas de RNA. Por isso, quando a célula detectar esse material genético, ela irá responder imediatamente para ativar a defesa imunológica. Existem vários mecanismos de detecção de infecção viral. Um deles é a presença de proteínas estranhas a ela. As bactérias, por exemplo, possuem enzimas endonucleases que degradam ácidos nucléicos que lhe são estranhos. Isso signi�ca que bactérias também estão se protegendo dos vírus. Replicação As etapas gerais de replicação do vírus começam com: Adsorção: reconhecimento do receptor celular; Penetração; Desnudamento do capsídeo; Ativação das suas enzimas para começar a replicação; Replicação do genoma; Síntese de proteínas; Montagem do capsídeo para que ele possa sair. Cada vírus tem um ciclo de replicação especí�co. Alguns ciclos são mais rápidos do que outros, além de também serem diferentes quanto à sua penetração. Ciclo de replicação do HIV. Este vírus RNA será inserido no DNA da célula hospedeira. Para isso, ele transformará o RNA em DNA utilizando a enzima transcriptase reversa. (Fonte: Shutterstock) Infecção As infecções provocadas pelos vírus podem ser: Agudas (quadro clínico mais rápido. Exemplos: dengue, chikungunya e zika); Crônicas (quando o vírus se replica continuamente, como nas hepatites B e C); Latente (quando a crise vem e passa, como na infecção por herpes). Atenção Alguns vírus podem ser responsáveis por tumores, como alguns tipos de HPV. Essa visão geral dos vírus nos ajuda a entender que eles são mais complexos do que imaginamos e que estão ativamente em processo de evolução. Convido você a ler um pouco mais sobre os vírus marinhos para entender que eles não existem somente para nos provocar doenças. Atividade 1 - A forma bacteriana mais comum é a esférica. O termo microbiológico que descreve essa forma é: a) Cocos b) Bacilos c) Diplococos d) Espirilo 2 - O gênero Streptococcus pode ser rapidamente identi�cado, pois as bactérias apresentam a forma de: a) Cocos dispostos em pares. b) Cocos enfileirados em linha reta. c) Cocos formando cachos. d) Bacilos em linha reta. 3 - A bactéria Gram-positiva é identi�cada por possuir: a) Uma segunda membrana externa que retém o corante cristal violeta. b) Múltiplas camadas de peptideoglicano que auxiliam a reter o cristal violeta. c) Uma cápsula espessa que prende o cristal violeta. d) Apresenta um espaço periplásmico que retém o cristal violeta. 4 - Qual a função da fímbria na estrutura de uma bactéria? a) Aderir a bactéria a várias superfícies. b) Permitir que a bactéria se mova em ambientes líquidos. c) É um sensor de nutrientes no ambiente. d) São vias de secreção de enzimas. 5 - Qual o objetivo da bactéria formadora de endósporo? a) Permitir à bactéria produzir uma série de esporos para serem espalhados no ambiente. b) Auxiliar a bactéria para se diferenciar em fases de crescimento mais rápidas. c) Permitir que a bactéria sobreviva em condições de ausência de oxigênio. d) Permitir que a bactéria sobreviva em períodos longos de calor e desidratação. 6 - Um vírus do tipo RNA utiliza qual local para se replicar dentro da célula? a) Parede celular b) Núcleo c) Mitocôndria d) Matriz citoplasmática 7 - Qual das opções a seguir é um exemplo de vírus que provoca uma infecção crônica no paciente? a) Vírus da Hepatite B. b) Vírus da herpes simples. c) Vírus varicella-zoster. d) Vírus influenza. Notas Deslocamento 1 Na �gura 1, temos o �agelo, prolongamento em uma das extremidades da bactéria que lhe garante o movimento. Bactérias2 Uma exceção é a Thiomargarita: ela apresenta 750 micrômetros de comprimento e está localizada em sedimentos dos oceanos. DNA3 O DNA aparece em duas formas: Nucleoide: uma única molecula de DNA linear; Plasmídeo: uma ou vearias cópias de DNA circulares. Mutações4 A explicação para as mutações está no tipo de genoma das bactérias: o haploide (uma cópia dos seus genes). Nossas células são diploides. Por isso, houve nelas uma mutação que será passada adiante, fato muito vantajoso para a sua resistência e evolução. Cápsula5 Dois exemplos de bactéria produtora de cápsula: Streptococcus mutans, responsável pela cárie; Streptococcus pneumoniae, bactéria responsável pela pneumonia. Flagelos6 Além de bactérias, é muito comum a presença de �agelos no domínio archaea. Controla7 As cianobactérias, produtoras de oxigênio no planeta, possuem vesículas de gás que lhes permitem �utuar nas colunas d’água de lagos e oceanos. Já as bactérias dos gêneros Bacillus e Clostridium são especializadas na formação de endósporos. Carência nutricional8 Restrição no fornecimento de nutrientes necessários ao desenvolvimento vegetativo, como carbono ou nitrogênio. Endósporo9 Bactérias dos gêneros Bacillus e Clostridium são especializadas na formação de endósporos. Gram10 O termo Gram é uma referência ao médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram por conta de sua metodologia desenvolvida em 1882. Ao trabalhar com Carl Friedlander em um hospital de Berlim observando amostras de pulmão, Gram identi�cou o bacilo causador da doença febre tifoide vermelha (Corynebacterium diphtheriae). Esse método é exclusivo para a bacteriologia, não sendo utilizado em arqueas. Nas suas experiências, Gram percebeu que a mistura de cristal violeta e iodo tornava as bactérias roxas ao microscópio, pois essa mistura era insolúvel deixando-as assim por muito tempo. No entanto ao gotejar álcool sobre essas bactérias roxas, Gram rapidamente percebeu que algumas perdiam a cor enquanto outras não. LPS (lipopolissacarídeo)11 Na verdade, o LPS, por ser produzido no interior das células de microrganismos e não ser secretada para o meio externo, é considerado uma endotoxina. Essa substância é considerada tóxica para nós por estimular uma resposta imunológica muito forte, podendo fazer com que o hospedeiro entre em choque hipovolêmico. Sua pressão arterial é capaz de ser tão reduzida que o levaria à morte. Se essas bactérias alcançarem a circulação sanguínea, chamada de bacteremia, pode haver ainda bastante vasodilatação, febre e um quadro realmente bem agressivo. Exemplos dessas bactérias: Escherichia coli e os gêneros de Shigella e Salmonella. Capsídeo13 Há vírus contendo mais de um capsídeo. É o caso do rotavírus, que provoca diarreia em adultos e crianças. membrana fosfolipídica14 Essas membranas fazem parte da célula hospedeira e são retiradas no momento da saída da partícula viral por um mecanismo de brotamento. Referências ERICKSON, H. How bacterial division might cheat turgor pressure – a uni�ed mechanism of septal division in gram-positive and gram-negative bacteria. In: Bioassays. v. 39. n. 8. 2017. MADIGAN, M. T. et al. Microbiologia de Brock. 14. ed. Porto Alegre: Artmed, 2016. ROMANIUK, J. A. H.; CEGELSKI, L. Peptidoglycan and teichoic acid levels and alterations in S. aureus by cell-wall and whole-cell nuclear magneticresonance. In: Biochemistry. v. 57. n. 26. jul. 2018. TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017. Próxima aula Tipos de metabolismo microbiano; Condições para crescimento de populações de bactérias. Explore mais Assista ao vídeo da Fiocruz sobre o mosquito Aedes: Conhecendo os mosquitos Aedes - transmissores de arbovírus <https://www.youtube.com/watch?v=3tiuRHuzST4. Acesso em: 20 fev. 2019> . https://www.youtube.com/watch?v=3tiuRHuzST4.%20Acesso%20em:%2020%20fev.%202019
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