Glicólise: Oxidação da Glicose a Piruvato

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Glicólise
Bioquímica para Enfermagem
Prof. Dr. Didier Salmon
MSc. Daniel Lima
Glicólise
	Oxidação da glicose a piruvato
O que acontece com a glicose que ingerimos?
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Via Glicolítica
Citossol
Glicólise (quebra da glicose) – via catabólica, transdução da energia presente na glicose em ATP e NADH
1 molécula de glicose é degradada em 10 reações enzimáticas a 2 moléculas de piruvato
10 Etapas catalisadas por enzimas livres no citossol
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Pode ser dividida em fases
hexoquinase
fosfoglicose isomerase
fosfofrutoquinase-1
triose fosfato isomerase
G0’ = - 16,7 kJ/mol
G0’ = + 23,8 kJ/mol
G0’ = - 14,2 kJ/mol
G0’ = + 1,7 kJ/mol
aldolase
G0’ = + 7,5 kJ/mol
Investimento de energia 
A glicose é fosforilada duas vezes e clivada para gerar duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato. 
Fase Preparatória (Gasto de ATP) – investimento de energia
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Pode ser dividida em fases
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase
fosfoglicerato quinase
fosfoglicerato mutase
enolase
piruvato quinase
G0’ = + 4,4 kJ/mol
G0’ = - 18,8 kJ/mol
G0’ = + 6,3 kJ/mol
G0’ = + 7,5 kJ/mol
G0’ = - 31,4 kJ/mol
Recuperação de energia
As duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato são convertidas em 2 moléculas de piruvato com a produção de 4 ATPs, tendo um saldo líquido de 2 ATPs.
Fase de pagamento: recuperação da energia investida com saldo positivo de 2 ATPs e 1 NADH
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Delta G fisiológico diferente do delta G padrão
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As Reações da Glicólise
	Hexoquinase
1ª Etapa: Dupla fosforilação as custas de 2 ATPs
Hexoquinase - catalisa reação exergônica, irreversível nas condições celulares
Fosforilação da Glicose no carbono 6
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As Reações da Glicólise
	Fosfoglicose isomerase
Isomerização de uma aldose em uma cetose (glicose em frutose)
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As Reações da Glicólise
	Fosfofrutoquinase-1 (PFK1)
As Reações da Glicólise
	Aldolase
Nas concentrações pequenas
de reagentes a reação é reversível
2ª Etapa: clivagem da hexose produzindo 2 trioses fosforiladas, que são interconvertíveis
Reaction #4 is catalyzed by aldolase. It has a strongly positive Delta G zero prime. In the cell, however, the reaction is pulled by reactions ahead of it (which remove products) and pushed by reactions behind it (which increase amounts of reactants), making the Delta G favorable (negative). The products of this reaction are G3P and DHAP.
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Reação da Aldolase (Classe I)
Em aldolase de mamífero, os principais resíduos de aminoácidos envolvidos cataliticamente na reacção são a lisina e a tirosina. A tirosina actua como um aceitador eficiente de hidrogénio enquanto a lisina covalentemente liga-se e estabiliza os intermediários.
Uma base de Schiff (ou azometina), nomeada após Hugo Schiff, é um grupo funcional que contém uma ligação dupla carbono-nitrogênio com o átomo de nitrogênio conectado a um grupo arila ou alquila mas não há hidrogênio
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As Reações da Glicólise
	Interconversão de trioses (Triose Fosfato Isomerase)
As Reações da Glicólise
As Reações da Glicólise
	Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
3ª etapa: oxidação e nova fosforilação das trioses fosfato (por Pi), formando 2 moléculas de 1 intermediário com 2 grupos fosfato
Reaction #6 is catalyzed by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. It contains the only oxidation reaction of glycolysis. Electrons from G3P are donated to NAD+ to form NADH. Note that an additional phosphate group is added to G3P in this reaction to form 1,3BPG. The overall Delta G zero prime is slightly positive. The amount of NAD+ is critical for determining the direction of this reaction.
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As Reações da Glicólise
 Oxidação do aldeído (gliceraldeído 3-fosfato) a ácido carboxílico, com redução de NAD. Reação termodinamicamente favorável. 
2 R – CO – H + 2 NAD+ + 2 H2O → 2 R – CO – OH + 2 NADH + 2 H+
2. Ligação do Ác. Carboxílico com Pi, formando anidrido carboxílico-fosfórico, que é endergônica.
2R – CO – OH + 2 HPO4-2 → 2 R – CO – O – PO3-2 + H2O
	As reações ocorrem acopladas por um intermediário rico em energia.
	Reação pode ser inibida pelo arseniato que compete com o fosfato
A oxidação do carbono torna a entrada do Pi favorável ...
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Oxidação pelo NAD+
fosforólise
Inibição de GAP desidrogenase
As Reações da Glicólise
	Fosfoglicerato quinase
	Formação de ATP por transferência de fosforila
4ª etapa: transferência dos grupos fosfato para ADP, formando 4 ATPs e 2 piruvatos.
Fosforilação ao nível do substrato!!
Acoplamento das reações GAPDH e PGK:
 GAP + Pi + NAD+ → 1,3-BPG + NADH DG 0’ = +6.3 kJ/mol 
1,3-BPG + ADP → 3PG + ATP DG 0’ = -18.5 kJ/mol
			 DG 0’ = -12.2 kJ/mol 
As Reações da Glicólise
	Fosfoglicerato mutase
As Reações da Glicólise
	Enolase
	Reação de desidratação
As Reações da Glicólise
	Piruvato quinase
Duas partes: - ADP ataca a fosforila do PEP formando ATP e enolpiruvato
	 - tautomerização do PEP a piruvato 
Acoplamento das reações: -61.9 kJ/mol (hidrólise de PEP) suficiente para impulsionar a síntese do ATP.
	 A glicólise é uma via quase que universal, onde 1 molécula de glicose é oxidada a 2 moléculas de piruvato sendo a energia liberada conservada em 2 moléculas de ATP e 2 moléculas de NADH 
	 Todas as enzimas da via glicolítica são citoplasmáticas e seus intermediários são moléculas fosforiladas de 3 ou 6 átomos de carbono 
	 Na fase preparatória da glicólise, 2 moléculas de ATP são consumidas 
	 Na fase de pagamento da glicólise, há produção de 1 molécula de NADH e 2 moléculas ATP para cada triose. 
Resumindo...
Equação geral da glicólise
Glicose + 2ATP + 2NAD+ + 4ADP + 2Pi 
2Piruvatos + 2ADP + 2NADH + H+ + 4ATP + H2O 
2
2
Glicose + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi 
2Piruvatos + 2NADH + H+ + 2ATP + H2O 
De onde vem a glicose circulante?
Gliconeogênese
Quebra do glicogênio, alimentação ou gliconeogênese
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Digestão de Carboidratos
	Inicia-se na boca
	a-amilase salivar: rompimento das ligações a(1→4)
	Amilopectina e glicogênio possuem ligações a(1→6), e sendo assim, o produto da digestão da a-amilase contém uma mistura de moléculas de oligossacarídeos menores e ramificados.
Como adquirimos os carboidratos da dieta?
Digestão inicia-se na boca (digestão do amido -> amilase salivar)
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Digestão de Carboidratos
	A digestão dos carboidratos cessa temporariamente no estômago, devido ao pH que inativa a a-amilase salivar
	O conteúdo gástrico é neutralizado pelo bicarbonato secretado pelo pâncreas, e a a-amilase pancreática continua o processo digestivo no intestino
	
Digestão de Carboidratos
	A digestão final ocorre pela ação de enzimas da mucosa intestinal –dissacaridases e oligossacaridases
	Há a absorção de monossacarídeos pelas células da mucosa intestinal
Estrutura e Papel dos Polissacarídeos
Como os açúcares que ingerimos na alimentação entram na via glicolítica?
Outros açucares além da glicose: frutose e galactose
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Frutose
	A frutose livre presente em frutos ou formada pela hidrolise da sacarose é fosofrilada pela hexoquinase. Esta é a principal via pela qual a frutose entra na via glicolítica.
	Frutose + ATP → frutose-6-fosfato + ADP
	No fígado a frutose entra na via glicolítica através da frutoquinase que catalisa a fosforilação do C1 da frutose.
	Frutose + ATP → frutose-1-fosfato + ADP
	A frutose-1-fosfato é clivada em gliceraldeído e diidroxicetona-fosfato pela frutose 1-fosfato aldolase. A diidroxicetona-fosfato é convertida em gliceraldeído-3-fosfato e o gliceraldeído é fosforilado. Portanto os produtos frutose-1-fosfato entram na via glicolítca como gliceraldeído-3-fosfato. 
	
Frutose
gliceraldeído-3-fosfato
Triose quinase
Frutose-1-fosfato-aldolase
VIA GLICOLÍTICA
Frutose-1-fosfato
Frutose-1-fosfato-aldolase
gliceraldeído + diidroxicetona-fosfato
Entry of fructose to the glycolysis cycle may be problematic in some cases. Fructose can be converted to F6P by hexokinase. Fructose can also be converted to fructose-1-phosphate (F1P) by fructokinase. Conversion of F1P to glyceraldehyde and DHAP allows fructose to be metabolized byglycolysis without being controlled by PFK. Ingestion of a lot of fructose (via high fructose corn syrup in many foods) may be a factor in obesity.
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Como os açúcares que ingerimos na alimentação entram na via glicolítica?
Galactose
	Galactose é um monossacarídeo resultante da hidrolise da lactose (açúcar presente no leite e seus derivados) 
Galactoquinase
Deficiency of galactose conversion enzymes results in accumulation of galactose (from breakdown of lactose). Excess galactose is converted to galactitol (a sugar alcohol). Galactitol in the human eye lens causes it to absorb water and this may be a factor in formation of cataracts.
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Resumindo...
Os destinos do Piruvato
Condições anaeróbicas
Condições anaeróbicas
Condições aeróbicas
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Um pouco de história...
	Louis Pasteur
	1861: crescimento de leveduras, por grama de glicose, maior na presença do que na ausência de ar. “EFEITO PASTEUR”: Glicose consumida mais lentamente na presença de ar do que na ausência.
	Teoria vitalista (“força vital”)
	Eduard Buchner
	1907 – Prêmio Nobel
	Derruba a Teoria vitalista – a fermentação ocorre sem vida organizada – Zimases
	Harden e Young
	1909: isolamento do primeiro intermediário da via glicolítica
	1929: Arthur Harden - Prêmio Nobel
	Descoberta de um procedimento para acelerar a fermentação: adição de Pi ao meio.
	
Destinos do Piruvato em Anaerobiose
	Fermentação (Reoxidação do NADH)
	Alcoólica
	Lática
Lactato é um “beco sem saída”
O equilíbrio da reação é favorecido em direção a formação do lactato devido ao G negativo da reação.
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Otto Meyerhof
	1922: Prêmio Nobel
	Descoberta da correlação entre o consumo de oxigênio e o metabolismo do ácido lático nos músculos de coelho
Ativador: obtido por autólise de levedura. 
O ativador perde a atividade se aquecido por 1 minuto a 50ºC e conserva-se bem em gelo.
 
Você pode imaginar a natureza desse ativador? 
Para você é espantoso que se obtenha um ativador de músculo de coelho a partir de levedura?
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Metabolismo do Etanol no Fígado
Acetaldeído desidrogenase
Ressaca
Álcool
desidrogenase
O álcool desidrogenase está presente no nosso corpo porque necessitamos metabolizar o álcool produzido em pequenas quantidades pela digestão e quebra dos carboidratos e, em grandes quantidades pelas bactérias em nosso intestino.
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Hipoglicemia pelo Etanol
Sensibilidade Diferencial ao Etanol
	Consumo de álcool segundo diferentes padrões levou a uma evolução divergente.
	Existem várias enzimas ADH no homem: dímeros (5 genes). ADH são essenciais pois quebram e metabolizam as moléculas de álcool (tóxico) que é absorvida para o sangue.
	População do Sudeste Asiático: maior intolerância ao álcool – acúmulo de acetaldeído – rubor alcoólico (“Asian flush”) 
	Sudeste asíatico: ~ 50 % pop. possui o alelo mutante ALDH2*2 (8% da atividade do gene wt) 
	Alcoolismo (tolerância ao álcool)
	Populações europeias: alelos ADH2 e ADH3 menos ativas metabolizam lentamente o etanol
Sensibilidade Diferencial ao Etanol
	Homens x Mulheres
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Regulação da Glicólise
Regulação da Glicólise
1. Número de enzimas (por controles transcricionais/traducionais; Ocorre em minutos ou até horas).
2. Mudança da atividade enzimática (ocorre em segundos) por:
	 Modificação covalente ou ligação a proteína reguladora
	 Regulação alostérica
	 Seqüestro da enzima ou do substrato em compartimentos diferentes
Fluxo de metabólitos de uma via metabólica pode ser modulado por:
Regulação da via glicolítica
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Via glicolítica
	Reações irreversíveis
	Hexoquinase
	Fosfofrutoquinase-1
	Piruvato quinase
 
 DGº muito negativo
G0’ = - 16,7 kJ/mol
G0’ = - 14,2 kJ/mol
G0’ = - 31,4 kJ/mol
	O fluxo da via glicolítica precisa se regulado em respostas às condições dentro e fora da célula.
	Duas demandas principais:
	Produção de ATP
	Fornecimento de blocos para biossíntese.
	3 enzimas-chave:
	Hexoquinase 
	Fosfofrutoquinase-1
	Piruvato quinase
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Hexoquinase
	Glicose + ATP Glicose-6-fosfato + ADP + H+
HK
inibidor
Hexoquinase
	Isoformas
	I, II e III – cinética michaelliana
	Km < 0,1 mM
	[plasmática] de glicose = 5 a 8 mM
	Ou seja, isoformas I, II e III funcionam sempre na Vmáx
Glicoquinase
	Hexoquinase (músculo): I, II, e III 
	Glicoquinase ou Hexoquinase IV – presente no fígado: menor afinidade pela glicose.
	Ligada a uma proteína reguladora forma um complexo inativo.
Glicoquinase
	Não é inibida por glicose-6-fosfato
	Maior Km pela glicose: 10 mM
	Regulada pela [glicose]plasmática 
	Regulação por sequestro no núcleo celular
Estado Alimentado
> 10 mM
Hepatócito
Glicose não é desperdiçada quando estiver abundante, síntese de glicogênio e ácidos graxos
Glicoquinase
	Não é inibida por glicose-6-fosfato
	Maior Km pela glicose: 10 mM
	Regulada pela [glicose]plasmática
	Regulação por sequestro no núcleo celular
Jejum
< 10 mM
Hepatócito
Fígado não compete com demais órgãos pela glicose escassa. Prioridade cérebro e músculo 
Músculo?
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Fosfofrutoquinase-1 (PFK-1)
	Fru 6-F → Fru 1,6-bF 
	A partir desse ponto o açúcar está comprometido com a via glicolítica
	Reação altamente exergônica e irreversível
	DG0’ = - 14,2 kJ/mol
	Além do sítio ativo essa enzima possui diversos sítios onde inibidores e ativadores alostéricos se ligam.
Before this enzyme's reaction, glucose-6-phosphate can potentially travel down the pentose phosphate pathway, or be converted to glucose-1-phosphate for glycogenesis.
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Reguladores Alostéricos da PFK-1
	Negativos: ATP (retroinibição) e Citrato (CK)
	Positivos: AMP (músc. Esq.) e frutose 2,6-bifosfato
ATP – Alta de energia (diminuição glicolítica)
ADP, AMP – Baixa de energia (aumento da via glicolítica)
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Reguladores Alostéricos da PFK-1
	Negativos: ATP (retroinibição) e Citrato (CK)
	Positivos: AMP (músc. Esq.) e frutose 2,6-bifosfato
De maneira pouco comum, o ATP, que é um substrato da enzima, também é um modulador alostérico negativo.
A ligação do AMP reverte parcialmente a inibição provocada pelo ATP
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Reguladores Alostéricos da PFK-1
	Negativos: ATP (retroinibição) e Citrato (CK)
	Positivos: AMP (músc. Esq.) e frutose 2,6-bifosfato
Quando a glicose é abundante, há um excesso de frutose-6-fosfato, que passa a ser fosforilada também pela PFK2, gerando frutose-2,6-bifosfato.
A f2,6p é um modulador alostérico da PFK-1, aumentando a atividade dessa enzima.
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Frutose-2,6-Bifosfato
	O ativador mais potente da via glicolítica
Enzima bifuncional (PFK2/F2,6BPase)
	Atividades 6-fosfofruto-2-quinase e frutose-2,6-bifosfatase
	Regulação Alostérica
PFK2
Alta concentração de precursores biossintéticos
Citrato
O que quer dizer a animação?
Um ano após a descoberta da PFK2, descobriu-se uma enzima que catalisava a reação reversa, defosforilando a frutose-2,6-bifosfato em frutose-6-fosfato.
Por muito tempo tentou-se isolar a PFK-2 e a F2,6BPase, até descobrirem que elas eram uma única enzima
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Regulação por Controle Covalente
Piruvato quinase
	Último passo da via glicolítica
	Fosfoenolpiruvato + ADP → ATP + piruvato
	Tetrâmero apresentando diferentes isoformas
	L (fígado) e M (músculo)
	Regulação Alostérica
Ativação anterógrada
ATP /
*
Piruvato quinase
	Último passo da via glicolítica
	Fosfoenolpiruvato + ADP → ATP + piruvato
	Regulação por controle covalente
Piruvato quinase
	Também é um tetrâmero apresentando diferentes isoformas em diferentes tecidos.
	Isoforma L (fígado) e isoforma M (músculo).
	Diferença: regulação por ligação covalente (fosforilação)
Fígado deixa de fazer glicólise quando a [glicose] no sangue cai
This protein kinase phosphorylates liver pyruvate kinase to deactivate it. Muscle pyruvate kinase is not inhibited by epinephrine activation of protein kinase A. Glucagon signals fasting (no glucose available). Thus, glycolysis is inhibited in the liver but unaffected in muscle when fasting. An increase in blood sugar leads to secretion of insulin, which activates phosphoprotein phosphatase I, leading to dephosphorylationand activation of pyruvate kinase. These controls prevent pyruvate kinase from being active at the same time as the enzymes that catalyze the reverse reaction (pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase), preventing a futile cycle
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Regulação da via glicolítica
Via antagônica à glicólise: Gliconeogênese
	Síntese de glicose a partir de compostos que não são carboidratos: aminoácidos, lactato e glicerol
Três reações precisam ser contornadas para se fazer o caminho inverso à glicólise (gliconeogênese)
	Ênfase na etapa catalisada pela PFK-1. Assim como na PFK-2, existe uma enzima que catalisa a reação reversa: F1,6BPase.
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Fosfofrutoquinase-1 e Frutose-1,6-Bifosfatase
Que também é regulada por F2,6BP, regulação em conjunto com a PFK-1
Inibição de Ciclo fútil
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Frutose-2,6-Bifosfato
Regulação Glicólise x Gliconeogênese
Aspectos clínicos
1) Isquemia (Infarto do miocárdio):
Isquemia: 
	Falta de suprimento sangüíneo para um tecido orgânico; 
	Necrose do tecido por isquemia
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	Células tumorais Ascites convertem glicose equivalente a 30% do peso seco em lactato/h (Músculo esquelético humano = 6% do peso seco em lactato/h)
	Em muitos tumores, a taxa de entrada de glicose e a glicólise aumentam por um fator 10. 
2) Células tumorais: Otto Warburg – 1920
Efeito Warburg – Células malignas (invasivas) tem a via glicolítica aumentada em torno de 200x
Na tomografia de emissão de positrons podemos ver a captação de fluodeoxiglicose, mostrando localização de tumores com alta captação desse composto (Via glicolítica aumentada)
Explicações para o efeito Warburg - The Warburg effect may simply be a consequence of damage to the mitochondria in cancer, or an adaptation to low-oxygen environments within tumors, or a result of cancer genes shutting down the mitochondria because they are involved in the cell's apoptosis program which would otherwise kill cancerous cells
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Transformação de uma célula normal para tumoral:
	Mudança para um metabolismo glicolitico;
	Tolerância a baixo pH;
	Mais o tumor é agressivo maior é a sua taxa de fluxo glicolítico
 (superxpressão de enzimas glicolíticas e dos transportadores)