Aula5_Lehn06_Enzimologia

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Enzimologia
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
A vida e a energia para a vida
	Duas condições fundamentais:
Autorreplicação
Metabolismo
	Catálise enzimática
	A queima de açúcares é a principal forma segundo a qual retiramos energia do meio ambiente para vivermos
	Um saco de açúcar pode permane-
cer anos na prateleira do supermercado
	A prateleira não tem enzimas!
	Nos animais, a glicose libera sua energia química em segundos
	Reações catalíticas promovem a oxidação da glicose ao quebrar ligações químicas que armazenam energia
Participam das vias bioquímicas
	Enzimas realizam o controle preciso do metabolismo celular
	O metabolismo energético 
é um dos principais 
temas de estudo 
da bioquímica
	Permitem resposta 
e adaptação a um
meio em mudança 
O que são as enzimas?
	Proteínas notáveis, altamente especializadas
	Alto grau de especificidade com substratos
	Poder catalítico extraordinário
	Muito maior do que catalisadores sintéticos
	Aceleram reações químicas
	Em condições suaves de temperatura e pH
	São o centro e o objeto de estudo principal da bioquímica
	Atuando de forma organizada catalisam centenas de reações que degradam as moléculas dos nutrientes e conservam suas energias
	Doenças ocorrem quando elas não funcionam bem
	Como os cientistas descobriram as enzimas?
LOUIS PASTEUR
	1835: Berzelius, conceito de catálise 
	1885: fermentação do acúcar por lêvedos, 
gerando álcool
	Vitalismo: o mágico élan vital
	1896: Edward Buchner consegue fermentar o açúcar num extrato de lêvedo sem vida!
	Fermentos, portanto, catalisavam reações químicas (açúcar a álcool) – biocatalisadores
	Enzima vem do grego εν ζυμη, cuja tradução é “no lêvedo”
Louis Pasteur
1822-1895
Um pouco de história...
EMIL FISCHER
	 Sacarase
	Quebra da sacarose em glicose e frutose
	 Produziu diversos análogos de sacarose para testar se a enzima funcionava
	Determinadas mutações tornavam os análogos resistentes à sacarase
	Modelo de ação enzimática 
chave-e-fechadura
Hermann Emil Fischer
1852 - 1919
Enzimas são proteínas?
	Qual a natureza das enzimas?
	O químico orgânico alemão Richard 
Willstätter (1872–1942) – ganhador do 
Nobel pela estrutura da clorofila – 
conseguiu separar o componente enzimático de um preparado biológico e não encontrou nenhuma proteína!
	1926 (EUA) – J Summer cristaliza a urease e conclui: enzimas são proteínas!
	 Willstater criticou os resultados…
James Batcheller Sumner
1887-1955
SIM! 
Mas como funcionam?
	 Kunitz e Northrop 
	Eletroforese e centrifugação: enzimas 
estão na fração protéica!
	Mesmo em quantidades proteícas 
indetectáveis pelos métodos, as 
enzimas continuavam tendo atividades
	 Como as milhares de reações catalíticas eram possíveis a uma proteína?
	
John Howard Northrop
1891-1987
*
	1902: Emil Fischer (Estrasburgo) e Hofmeister (Berlim), proteínas eram formadas de aminoácidos que, ligados por ligações peptídicas, formavam cadeias polipeptídicas
POLÍMEROS DE AMINOÁCIDOS?
?
Finalmente, Sanger
	 1952 
	Publica a primeira estrutura primária
de uma proteína: a Insulina, com 51
aminoácidos
	O trabalho mostrava também que a 
estrutura das proteínas poderia ser
descrita pela sua sequência de aminoácidos, do N ao C terminal
	A sequência, entretanto, não ajudava a prever a função da proteína (antes da bioinformática)
Frederick Sanger
13 August 1918
CONCLUSÃO: HISTÓRIA DA BIOQUÍMICA
	As enzimas realizam reações catalíticas e transformam moléculas umas nas outras
	Os organismos biológicos são ricos em enzimas e as enzimas funcionam também fora dos organismos biológicos → biotecnologia!
	As enzimas são proteínas formadas por polímeros de aminoácidos
	A multiplicidade de função se dá pela interação tridimensional formada (modelo chave-fechadura) por interações 
não-covalentes a partir de uma série de 
aminoácidos ligados covalentemente 
(ligação peptídica)
>gi|386828|gb|AAA59172.1| insulin [Homo sapiens] 
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR
REAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
*
Toda enzima é proteína?!
	Não!, há alguns RNAs que funcionam enquanto enzimas também
	Componente químico adicional necessário para a função
	Cofator: íons inorgânicos
	Coenzima: moléculas orgânicas complexas
	Se liga muito firmemente: grupo prostético
	Enzima completa: holoenzima
	Parte protéica: apoenzima ou apoproteína
Nomenclaturase das enzimases
	Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do substrato ou à atividade realizada
	Urease – hidrolisa a uréia
	DNA-polimerase – polimeriza DNA
	Pepsina – pepsis vem do grego (digestão)
	Sistema de classificação
enzimático – EC number
	Quatro números: 2.7.1.1
	2: transferase
	7: fosfotransferase
	1: transfere P para grupo OH-
	1: tem D-glicose com aceptor
Reação enzimática
	Reação se dá em fases: 
	Enzima aumenta a velocidade das reações
	Os catalisadores aumentam a velocidade das reações por que diminuem a energia de ativação
Equilíbrio químico
	As enzimas realizam, muitas vezes, as reações nos dois sentidos 
	A concentração de substratos e produtos é o que define a velocidade das reações
	Poder catalítico das enzimas vem da energia livre liberada na formação de ligações fracas quando da interação enzima-substrato
	Interações fracas entre ES são otimizadas no estado de transição
Bastonase
	Pauling (1946): Enzima deve ser complementar ao Estado de transição (ET), não ao substrato
	ET não é forma estável
	Interações fracas entre a enzima e o substrato propulsionam a catálise enzimática
	Necessidade de múltiplas interações fracas explica pq alguns prots são tão grandes
Estabiliza o substrato
Especificidade enzimática
	Deriva da formação de múltiplas interações fracas entre a enzima e a molécula do substrato específico
	Redução da entropia pela ligação
	Dessolvatação do substrato
	Ajuste induzido, proteína tbm muda de conformação
Grupos catalíticos
	Catálise geral ácido-base
	Transferência de prótons
	Catálise covalente
	Formação de lig. covalente
transitória entre E e S
	Ativação do substrato
	Catálise por íons metálicos
	Estabilizam estados de transição
	1/3 das enzimas conhecidas usam íons metálicos nas reações catalíticas
	Enzimas muitas vezes usam as três 
estratégias de catálise em conjunto -- quimiotripsina
Cinética enzimática
	Experimentos de mutagênese sítio-dirigida permite que os pesquisadores investiguem o papel de cada aminoácido na função protéica
	A concentração do substrato [S] influi na velocidade das reações catalisadas por enzimas
	Velocidade máxima é abstraída para concentrações excessivas de Substrato
	Constante de Michaelis
	kM = [S] correspondente a ½ Vmax; 
	
	Reação enzimática ocorre por etapas
	Ligação reversível da enzima ao substrato
	Estado estacionário: concentrações constantes de enzima e enzima + substrato
Reações com 2 ou mais substratos
	Enzimas podem formar os chamados complexos ternários ou realizar as reações uma-depois-da-outra
	Velocidade das reações químicas depende também da faixa de pH
	Maior velocidade está normalmente associada ao pH do ambiente onde a enzima atua
Inibição reversível
	Inibição competitiva
	Inibidor compete pela ligação ao sítio ativo
	A ligação do inibidor altera os parâmetros cinéticos, tornando a reação mais lenta
	Os inibidores irreversíveis ligam-se covalentemente ou destroem grupos funcionais da enzima
	Podem ser usados como drogas
Exemplos de reações enzimáticas
	Quimiotripsina
	Lisozima 
	Hexocinase
	Enolase
	Beta-lactamases
	Proteases do HIV
A quimiotripsina
	Catalisa a hidrólise de ligações peptídicas adjacentes a aminoácidos aromáticos (Trp, Phe, Tyr)
	Forma intermediário acil-enzima covalente
	
A hexocinase
	Sofre um ajuste induzido quando ligada ao substrato
	Fosforila um resíduo de glicose
	Primeiro passo da via glicolítica
	Adição de Xilose “engana” a enzima e faz com que ela fosforile a água
A enolase
	Realiza desidratação reversível de 2-fosfoglicertato a fosfoenolpiruvato
	Dímero com 436aa
	Catálise geral ácido base+ estabilização do estado de transição
	Interações estabilizam intermediário (enolato)
	Ligações de H com outros aa’s do sítio ativo contribuem para o mecanismo geral
A lisozima
	Agente antibacteriano natural encontrado nas lágrimas e clara de ovo
	Peptideoglicano da parede de bactérias é seu substrato
	Constituinte da parede microbiana que protege da lise osmótica
	Enzima rompe ligação glicosídica
	Monômero com 129 aa’s
	Mecanismo específico de ação enzimática ainda é controverso
“mesmo uma infinidade de experimentos não pode provar que algo esteja certo, mas um único experimento pode provar que está errado”. 
 Albert Einstein
Medicamentos
	Muitos são inibidores de enzimas são usados para tratar doenças; desde as dores de cabeça até a AIDS
	Penicilina (Alexander Fleming, 1928)
	Peptideoglicano: polímero de açúcares e D-aa’s da parede bacteriana
	Penicilina interfere na síntese do peptideo glicano ao mimetizar um segmento D-Ala-D-Ala
	Inibem reação de transpeptidase
Os Beta-lactâmicos
	Penicilina: degradada no 
ambiente do estômago
	Penicilina V: estável em meio ácido pode ser administrada em via oral
	Amoxilina: ampla faixa de ação; antibiótico β-lactâmico + prescrito
	O ataque da Ser à porção amida do anel leva a um produto acil-enzima que é praticamente irreversível
	Transpeptidase inativa!
	Bloqueia síntese da parede bacteriana
	Rompe-se devido à pressão osmótica
As Beta-lactamases
	Enzimas que quebram o anel beta-lactâmico das penicilinas
	Disseminaram-se em bactérias submetidas à pressão seletiva
	O mau uso dos antibióticos
Guerra contra as bactérias
	Acido clavulânico: inativa irreversivelmente as Beta-lactamases
	Clavulin: amoxilina + ácido clavulânico
	Foram encontradas bactérias resistentes ao ácido clavulânico...
	Desenvolvimento e descoberta de novos antibióticos é uma indústria em crescimento
Os antivirais: (1) o que é um vírus?
	Anatomia molecular viral
	Ácido nucléico envolto por uma capa protetora feita de proteínas (capsídeo)
	Uma única molécula de ácido nucléico de fita simples ou dupla (fita positiva ou negativa)
	Genomas compactos
	Contêm apenas as proteínas 
necessárias à replicação viral
	Genomas da ordem de Kb
Parasitismo intra-celular
	O vírus não tem metabolismo próprio
	Não é um organismo de vida-livre
	Parasita intra-celular obrigatório
	Forma de cristal
	Sequestra a maquinaria molecular da célula
	Mecanismo moleculares de 
produção preferencial dos 
 genes virais (fator sigma 
 próprio e específico)
*
Variedades virais
	Vírus de DNA
	Precisam chegar ao núcleo para serem primeiramente transcritos em RNA
	Vírus de RNA
	Podem atuar no citoplasma
	Vírus de RNA com transcrição reversa
	Acontece a transcrição reversa do RNA 
em DNA e o DNA é normalmente 
integrado ao genoma do hospedeiro
HIV
	SIDA: Síndrome da imunodeficiência humana
	Pandemia
	Matou 25 milhões de pessoas nos últimos 25 anos
	Retrovírus (lentivirus)
	2 cópias de um RNA fita simples (fita +)
	Nove genes
	Capsídeo é formado por cerca de 2000 proteínas p24
	0,6% da população humana está infectada
AZT (azidotimidina)
	Mimetiza um nucleotídeo de timina
	Azida no lugar de hidroxila
	Prejudica a ação da transcriptase reversa
	Atrasa o desenvolvimento dos vírus, ainda que, 
aos poucos o vírus se torne resistente
Transcriptase reversa mutante passa a não reconhecer mais o AZT
Outros tratamentos
	Inibidores de protease
	Impedem a protease do HIV de clivar as proteínas produzindo componentes maduros
	Inibidores de integrase
	Impedem o vírus de integrar seu DNA no genoma do hospedeiro
	Inibidores de fusão
	Interferem nas proteínas gp120 e gp41 ou bloqueiam receptores celulares de ligação ao HIV
	Coquetel anti-AIDS
	dificulta a adaptação do vírus a várias frentes moleculares de ataque, diminui comprovadamente o número de vírus no sangue
Proteases do HIV
	O RNA do vírus é traduzido em grandes proteínas
	Essas proteínas precisam ser hidrolisadas em proteínas individuais do capsídeo
	A protease do HIV é uma aspartil-protease
	2 resíduos de Asp facilitam ataque da água à ligação peptídica
Inibidores de proteases
	Drogas que formam complexos não-covalentes com a protease do HIV
	Ligam-se fortemente: praticamente irreversíveis
	Cadeia principal com grupo hidroxil próximo a grupo benzil
	Grupo hidroxil mimetiza a água
	Resto da estrutura encaixa nas fendas da enzima
	Estrutura planejada para ser análoga ao estado de transição
	Sucesso terapêutico
	Aumentou longevidade e qualidade de vida dos doentes
Enzimas regulatórias
	Possui atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a certos sinais
	Ajustes na velocidade da via metabólica permite que as células se adaptem a condições em variação
	Tipos mais comuns
	Enzimas alostéricas (ligações reversíveis a compostos)
	Modificações covalentes
	Ativadas por remoção de segmentos peptídicos (irreversível)
	Subunidade regulatória é normalmente diferente da subunidade catalítica
Enzimas alostéricas
	Homotrópicas: o ativador é o próprio substrato (hemoglobina)
	Heterotrópicas: outro ativador
	Enzimas alostéricas
	Mais de um sítio regulatório
	Cada um específico para um regulador
	Aspartato-transcarbamoilase
	12 cadeias polipeptídicas
	Azul: catalíticas
	Vermelho/Amarelo: regulatórias
Enzimas alostéricas são reguladoras
	... de vias bioquímicas
	Normalmente são o primeiro passo da via
	“economiza” a execução das outras reações
	Único passo de regulação da via
	Inibição por retroalimentação: São inibidas pelo produto do último passo
	Inibição alostérica heterotrópica
Regulação por modificações covalentes 
	500 tipos diferentes Modificações pós-traducionais covalentes já foram descritos
	Proteínas inteiras podem ser adicionados como a ubiquitina e a sumo
	Ubiquitinilação marca proteína para degradação
	Sumoilação é encontrada em proteínas nucleares
	Mudanças substanciais afetam de forma significativa a função da enzima
	Fosforilação é a mudança mais comum
	Podem haver vários sítios fosforiláveis
Proteínas cinases e fosfatases
	Cinases: adicionam grupo fosforil a resíduos de Ser, Thr ou Tyr
	Básicas: fosforilam resíduos de vizinhança básica
	Preferências por resíduos próximos a Pro
	Atómos de O2 do grupo fosforil podem fazer pontes de H com outras regiões da proteína
	Reestabiliza a proteína estruturalmente
	Atuam em cascatas de sinalização celular
Cinases sítio-específicas
	Fosforilações são sítio-específicas
	Cada enzima reconhece uma ordem de aminoácidos e fosforila resíduos de S, T ou Y
	Sítio de reconhecimento
	Sítio de fosforilação
Fosforilações múltiplas
	São possíveis e permitem controle requintado da regulação
	Glicogênio sintase
	Catalisa a união de glicoses para formar glicogênio
	Fosforila em vários sítios (ver figura)
Proteólise de precursores
	Proteases não podem ser produzidas em estado ativo
	Do contrário destruiriam as proteínas celulares...
	Zimogênios são precursores das proteínases
	Só funcionam depois da ativação por proteínas 
	Ativação irreversível
	Mecanismo de produção de pró-proteínas ou pró-enzimas
Conclusões
	A atividade das vias metabólicas é regulada pelo controle da atividade de certas enzimas
	O conhecimento do mecanismo de ação das enzimas permite desenvolver medicamentos que inibam essa ação
	A inibição de uma enzima pode ser reversível, competitiva
	Os principais mecanismos de catálise são: ácido-básica, covalente e por íons metálicos
	As enzimas são catalisadores eficazes, aumentando a velocidade de ocorrência de uma reação
	Aula baseada
no livro do Lehninger
(Nelson e Cox)
	Capítulo 6
	Enzimas