Métodos instrumentais de análise para o estudo de células e tecidos - Microscopia

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Objectivos: 
◉◉◉◉ Listar e descrever as ferramentas de estudo da célula
◉◉◉◉ Definir e analisar a metodologia usada na:
-Microscopia óptica e electrónica; -Microscopia de 
fluorescência; 
-Microscopia de contraste de fase; -Microscopia confocal; -
Microscopia Electrónica de Transmissão e de Varrimento.
◉◉◉◉ Listar e descrever a preparação do material biológico para a 
microscopia óptica e electrónica
Métodos instrumentais de análise para o estudo 
de células e tecidos - Microscopia
BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR IBIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR IBIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR IBIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR I
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA 
Poder de 
resolução
�Microscopia depende de: 
- técnicas de preparação 
das amostras biológicas 
- poder de resolução dos 
microscópios
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Algumas descobertas importantes na 
história da microscopia
1611 - Kepler sugere maneiras de construir 1 microsc composto
1881 - Retzius, Cajal e outros desenvolvem técnicas de 
coloração e lançaram os fundamentos da anatomia 
microscópia
1879 - Flemming descreve o comportamento dos 
cromossomas na mitose de cél animais.
1683 - Leeuwenhoek visualiza pela 1ªx uma bactéria
1882 a 1899 – Klebs e Pasteur utilizando variados corantes 
identificam importantes agentes patogénicos.
1886 – Zeiss constroi uma série de lentes q permite revelar 
estruturas nos limites teóricos da luz visível
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na 
histhisthisthistóóóória da microscopiaria da microscopiaria da microscopiaria da microscopia
1932 – Zernicke inventa o microscópio de contraste de fase
Estes 2 microsc permitem que células vivas não coradas sejam 
vistas em detalhe pela 1ª vez
1981 – Allen e Inoué – aperfeiçoam o microscópio óptico 
de contraste com sistema de vídeo avançado
1988 – Microscópios confocais de varredura comerciais 
passam a ser amplamente utilizados
1898 – Golgi descreve pela 1ªx o aparelho de Golgi depois 
da coloração das células com nitrato de prata
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Detalhes revelados pelo microscópio óptico
O limite máximo de resolução de 1 microscópio óptico 
é determinado pelo comprimento de onda da luz 
visível, q varia de 0,4 µµµµm (violeta) a 0,7 µµµµm
(vermelho).
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Limite de resolução – é o limite de separação pelo qual 
2 objectos podem ser distinguidos.
Limite de resolução depende de:
- comprimento de onda da luz (λλλλ)
- abertura numérica do sistema de lentes (an)
Detalhes revelados pelo microscópio óptico
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
A abertura numérica – é a capacidade do 
sistema de lentes recolher a luz.
- lentes secas - an não pode ser maior que 1
- lentes de imersão – an pode chegar a 1,4 
Qto > a an > a resolução e > a luminosidade.
Detalhes revelados pelo microscópio óptico
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica -
Fixação
A fixação imobiliza,
mata e 
preserva e endurece as células.
torna-as permeáveis aos corantes e 
produz uma ligação cruzada entre as suas
macromoléculas, permitindo que estas 
permaneçam estabilizadas nas suas posições
naturais
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica -
Fixação
Procedimentos antigos usavam ácidos e solventes orgânicos
como o álcool. Diferentes poderes de penetração ∴∴∴∴ usados em 
combinações.
Actualmente usam-se os aldeídos (formaldeído e glutaraldeído) 
que formam ligações covalentes com os grupos amino-livres das 
proteínas produzindo ligações cruzadas. 
Qualquer tratamento usado na fixação pode alterar a estrutura 
da célula ou das suas moléculas ∴∴∴∴ uma alternativa é o 
congelamento rápido.
Vantagens- proteínas bem preservadas
Desvantagens- estrutura fina da célula é destruída pelos cristais 
de gelo
O tecido congelado é seccionado com um criostato (micrótomo
mantido numa câmara a ↓↓↓↓ T)
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica -
Embebição
Mesmo após a fixação os tecidos são macios e frágeis e 
precisam de ser embebidos em ceras MO 
resinas, ME
1º na forma líquida de seguida na forma sólida (por 
esfriamento ou polimerização).
O material biológico embebido é seccionado com um 
micrótomo/ultramicrótomo
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica -
Embebição
O micrótomo – é um 
aparelho com uma 
lâmina metálica afiada
As secções:
- de 1 a 10 µm de espessura,
- colocadas sobre a superfície 
plana de uma lâmina de vidro
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica -
Coloração
Depois de fixado e seccionado, o 
material biológico tem que ser corado
para poder ser observado ao microscópio.
Uma vez que que os corantes têm 
diferentes afinidades e poderes de 
penetração têm que ser utilizadas em 
combinações. 
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Há uma relativa falta de especificidade dos corantes a nível 
molecular que tem levado ao desenvolvimento de procedimentos 
de coloração mais selectivos e racionais, particularmente a 
métodos que revelem proteínas específicas ou outras 
macromoléculas na célula. 
Preparação do material biológico para a microscopia óptica -
Coloração
Assim algumas enzimas podem ser localizadas nas células 
através da sua actividade catalítica.
Regiões mais sensíveis podem ser avaliadas através de 
fluorocromos
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de Fluorescência
Moléculas fluorescentes absorvem luz a 1 determinado λλλλ e 
emite um λλλλ + longo, visualizado através de 1 filtro contra 
um fundo escuro
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de Fluorescência
O 1º permite a 
passagem de λλλλ
q excitem 
determinados 
fluorocromos
O 2º permite 
passagem de 
λλλλ emitidos 
qdo o corante 
fluoresce
Os fluorocromos são detectados em microsc de fluorescência q 
difere dos normais por ter uma luz + potente q passa por 2 
conjuntos filtros:
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de Fluorescência
Imagem 
de FISH 
com 
fluorescein
e 
rodamina
A fluoresceina emite fluorescência verde qdo excitada com luz azul
A rodamina “ “ vermelha “ “ “ “ amarel/verde
As 2 cores 
são vistas 
separada/ 
alternando 
conjuntos de 
filtros
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de Fase
Qdo se fixa 1a cél ela perde alguns componentes ou
são simples/ distorcidos
∴∴∴∴ a forma + correcta de examinar as células seria quando estas 
ainda estivessem vivas, sem as fixar ou congelar.
Qdo a luz atravessa 1a cél viva a fase do λ é alterado de acordo com o 
índice de refracção da cél. 
A luz ao passar através do núcleo é retardada e deslocada em relação à
luz que atravessam áreas + delgadas.
O microsc de contraste de fase explora os efeitos da 
interferência qdo estes 2 conjuntos de ondas se recombinam, 
criando uma imagem da estrutura da célula
Microscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de Fase
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
A luz q passa 
através de 1a cél
não corada 
sofre pouca 
alteraçãode 
amplitude e ∴
os detalhes das 
estruturas não se 
conseguem ver
As partes coradas 
da cél
Reduzem a 
amplitude e ∴
A imagem colorida 
da cél é vista
Microscopia Microscopia Microscopia Microscopia ConfucalConfucalConfucalConfucal
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Para a microscopia óptica 1 tecido tem q ser cortado em secções 
q, qto + fina a secção + nítida é a imagem. 
Neste processo a informação 3D é perdida.
Com o Mic confucal de 
varrimento a partir de 1a série 
de secções tiradas em ≠≠≠≠s 
profundidades e armazenadas 
em computador é fácil 
reconstruir a imagem 3D
o Mic confucal de varrimento é para o 
microscopista o que o CAT scanner é
para o radiologista. Ambos fornecem 
imagens seccionadas detalhadas do 
interior de uma estrutura intacta. Gastrula – Drosophila
mic convencional e de fluorescênc confucal
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia Electróóóónica de Transmissão (TEM)nica de Transmissão (TEM)nica de Transmissão (TEM)nica de Transmissão (TEM)
TEM TEM TEM TEM –––– ‘‘‘‘TransmissiomTransmissiomTransmissiomTransmissiom ElectronElectronElectronElectron MicroscopeMicroscopeMicroscopeMicroscope’’’’
Teorica/ tem 1a resolução 10 000x > q o MO e 1 poder de 
resolução - 1Å
Na prática tem 1a resolução 100x > q o MO e 1 poder de 
resolução 20Å
Porquê? Devido a problemas na preparação da amostra
Contraste e
Danos causados pela radiação
No TEM os electrões atravessam a amostra para formar a imagem
Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na 
histhisthisthistóóóória da microscopia electrria da microscopia electrria da microscopia electrria da microscopia electróóóónicanicanicanica
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
1897 – J. Thompson anuncia a existência de partículas carregadas 
–va/ + tarde denominadas “electrões”
1931– Ruska et al constróem o 1º TEM 
1935 – Knoll demonstra a viabilidade do mic electrónico de 
varredura 
1939 - Siemens produz o 1º TEM para fins comerciais
1945 – Porter, Claude e Fullam, usam o TEM para examinar célula 
em cultura depois de fixadas e contrastadas com OsO4
1948 – Pease e Baker, preparam secções de mat biológico de 0,1 a 
0,2 µµµµm
1952 – Palade, Porter e Sjöstrand desenvolvem métodos de 
fixação e corte q possibilitam pela 1ªx a visualização de várias 
estruturas intracelulares
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na 
histhisthisthistóóóória da microscopia electrria da microscopia electrria da microscopia electrria da microscopia electróóóónicanicanicanica
1953 – Porter e Blum desenvolvem o 1º ultramicrótomo
1956 – Glauert et al propõem a resina epoxi araldite como agente 
de inclusão. 
1961 – Luft introduz a resina Epon
1957 – Robertson descreve a estrutura trilaminar da membrana 
celular vista pela 1ªx no TEM 
1959 – Singer usa anticorpos acopolados à ferratina para 
detectar moléculas da célula 
1965 – Cambridge instruments produz o 1º microscópio de 
varrimento 
1968 – De Rosier e Klug descrevem técnicas para a reconstituição 
de estruturas 3D a partir de micrografias electrónicas 
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a 
microscopia electrónica
1º com gluteraldeído que faz com que as moléculas de proteínas 
façam ligações covalente/ cruzadas com os seus vizinhos
2º com tetróxido de ósmio q se liga e estabiliza as bicamadas
lipídicas assim como as proteínas
FixaFixaFixaFixaççççãoãoãoão
DesidrataDesidrataDesidrataDesidrataççççãoãoãoão
Como a amostra é exposta ao vácuo mto forte não pode ser 
analisada viva, com H2O, ∴∴∴∴ é feita a desidratação numa série 
crescente de alcoóis
Preparação do material biológico para a 
microscopia electrónica
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
EmbebiEmbebiEmbebiEmbebiççççãoãoãoão
Feita com uma resina q se polimeriza formando 1 bloco sólido de 
plástico 
CorteCorteCorteCorte
Cortes ultrafinos (na ordem 
dos 50 a 100nm de 
espessura) feitos num 
ultramicrótomo e colocados 
numa grelha
ContrastaContrastaContrastaContrastaççççãoãoãoão
Feito com sais de metais pesados como o urânio e o chumbo
Preparação do material biológico para a 
microscopia electrónica
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
mitocôndria
nucléolo
vacúolo
ribossomas
RE
Golgi
Microscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia Electróóóónica de Varrimentonica de Varrimentonica de Varrimentonica de Varrimento
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Secções finas obtidos por TEM são pedaços bidimensionais de 
tecidos e não transmitem de imediato a organização 3D dos 
componentes celulares
Este é conseguido usando o microscópio 
electrónico de varrimento, q é num 
aparelho <, + simples e + barato do q 
um TEM.
Utiliza os electrões q são dispersos ou 
emitidos da superfície da amostra ∴
somente características da superfície
podem ser examinadas e a resolução 
atingível não é mto alta macrófago
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia Electróóóónica de Varrimentonica de Varrimentonica de Varrimentonica de Varrimento
A amostra é fixada,
desidratada e 
coberta com uma camada fina de metal pesado de 
seguida
varrida por um feixe de electrões.
A quantidade de electrões emitidos é medido para controlar a intensidade 
de um 2º feixe, q se move em sincronia com o 1º e forma a imagem num 
écran. 
Como a imagem tem brilhos e sombras dá 1a aparência 3D.
Cílio do ouvido interno do boi