Aula 7 O sequenciamento de Sanger

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Disciplina: Plataformas Moleculares para as
Atividades Biológicas
Aula 7: O sequenciamento de Sanger
Apresentação
Imagine que no laboratório de diagnósticos moleculares, você tenha acabado de realizar um diagnóstico de uma doença
infecciosa causada por um vírus que pode circular no país na forma de diferentes genótipos, os quais estão associados a
maior ou menor gravidade da doença que provocam. 
Nesta aula, abordaremos como elucidar o sequenciamento nucleotídico parcial ou total do genoma para a classi�cação
genotípica, bem como para o levantamento de possíveis mutações nas cepas circulantes associadas à virulência.
Bons estudos!
Objetivos
Discutir os princípios da técnica de sequenciamento genômico;
Enumerar as etapas necessárias para sua execução passo a passo;
Correlacionar a técnica de Sanger com a replicação do DNA.
Histórico
As possibilidades de estudo são inúmeras, a partir do sequenciamento parcial ou total do genoma. É possível realizar análise de
mutações genéticas associadas a uma determinada patologia, detecção da presença de polimor�smos, identi�cação de
patógenos, classi�cações genotípicas, relações evolutivas, entre outras.
Você consegue imaginar a riqueza de informações que podem ser obtidas a partir do
sequenciamento genômico de um vírus, bactéria, parasita, ou mesmo do homem?
 Método de sequenciamento de genoma | Fonte: Ktsdesign / Shutterstock
É uma metodologia que permite a enumeração da ordem das bases nitrogenadas constitutivas do genoma celular ou do
agente infeccioso presente em uma amostra. Ela permite acessar todo o mapa genético que dá origem às proteínas celulares ou
dos patógenos citados.
Você sabe o que é o sequenciamento genômico?
1
Vejamos a seguir um breve histórico dessa metodologia:
http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0072/aula7.html
1995
Nesse ano aconteceu o sequenciamento do
primeiro genoma, o da bactéria chamada
Haemophilus in�uenza.
2003
Em função da sua maior complexidade, o
genoma humano foi concluído apenas nesse
ano, após vários anos de trabalho e da dedicação
de cientistas de diferentes países.
Atualmente
Diante de insumos adequados e equipamentos
especí�cos, sequenciar um pequeno fragmento
de ácido desoxirribonucleico (DNA) é uma tarefa
relativamente simples.
Um dos grandes marcos para os estudos em biologia molecular foi a revelação do modelo de dupla hélice do DNA em 1953. A
partir de então, foi possível compreender:
A complexidade e diversidade de genomas;
Os mecanismos de hereditariedade;
O �uxo da informação genética nos organismos.
Naquela época, por menor que fosse um fragmento de DNA, parecia uma tarefa impossível decifrar sua sequência de
nucleotídeos. Esse desa�o foi contornado, nos anos seguintes, com o surgimento das metodologias de sequenciamento
genômico.
Inicialmente, Allan Maxam e Walter Gilbert criaram um método de sequenciamento baseado em hidrólise química. Tratava-se de
uma metodologia complexa, que utilizava elementos radioativos. Em função disso, acabou sendo substituída pela técnica
enzimática, reprodutível e e�caz, desenvolvida por Frederick Sanger, utilizada até hoje.
A técnica Sanger é baseada na interrupção da cadeia nucleotídica.
O pesquisador percebeu que se ele mimetizasse in vitro o processo de replicação da molécula de DNA, interrompendo a
polimerização da nova �ta, nucleotídeo a nucleotídeo, ele seria capaz de produzir inúmeras moléculas de DNA, que difeririam em
apenas um nucleotídeo umas das outras. Desse modo, bastaria ao �nal separá-las pelo tamanho, para elucidar a ordem correta
das bases nitrogenadas no genoma do organismo estudado.
Atividade
1. PC-RJ (2013) – O DNA (ácido desoxirribonucleico) é constituído por uma longa �ta dupla de nucleotídeos. O sequenciamento
de DNA é um processo que determina a ordem desses nucleotídeos. A �ta dupla é formada pelo pareamento das bases. Dessa
forma, referente ao pareamento desses nucleotídeos, não é correto a�rmar:
a) Adenina se pareia com timina.
b) A sequência desse pareamento é responsável pelas características genéticas do homem e de todos os seres vivos.
c) A guanina se pareia com citosina.
d) As bases dos nucleotídeos são adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C).
e) A guanina se pareia com adenina.
2. SEDUC-CE - 2013 - O sequenciamento do genoma humano determinou a sequência de:
a) Aminoácidos das proteínas dos cromossomos humanos.
b) Aminoácidos dos genes humanos.
c) Bases nitrogenadas das proteínas humanas.
d) Nucleotídeos do DNA dos cromossomos humanos.
e) Nucleotídeos do rna dos cromossomos humanos.
A técnica de Sanger
O método de Sanger corresponde à incorporação de nucleotídeos modi�cados na molécula de DNA, os quais não possuem a
hidroxila livre no carbono 3’ da pentose.
Dica
Você se lembra da estrutura básica de um nucleotídeo? Caso ainda possua dúvidas quanto à sua estrutura básica, basta retornar
à aula 2.
A seguir, vamos conhecer as características dessa técnica.
A diferença entre oligonucleotídeos e didesoxiribonucleotídeos
Por causa da ausência do grupamento hidroxila no carbono 3’ da pentose, os nucleotídeos modi�cados não possuem capacidade
de fazer ligação química com um próximo nucleotídeo.
Isso signi�ca que os nucleotídeos recém incorporados ligam os fosfatos presentes nos seus carbonos 5’ à hidroxila do carbono 3´
presente no nucleotídeo imediatamente anterior.  
Desse modo, a partir do momento em que os nucleotídeos modi�cados são incorporados, eles determinam a interrupção
prematura da cadeia.
Você se recorda que o sentido de polimerização da fita de DNA é considerado 5´-> 3’?
Esses nucleotídeos modi�cados são chamados de didesoxiribonucleotídeos (ddNTPs).
A diferença para os oligonucleotídeos normais (dNTPs) está ilustrada na �gura a seguir.
 Diferença entre os oligonucleotídeos (dNTPs) e os didesoxiribonucleotídeos (ddNTPs) | Fonte: ALBERTS, B; JOHNSON, A; LEWIS, J.; RAFF, M.; WALTER, P.; ROBERTS, K.; MORGAN, D.
Biologia Molecular da Célula. 6.ed. Porto Alegre: ArtMed, 2017.
Mas, para determinar a interrupção da cadeia, é necessário possuir os quatro tipos de ddNTPs possíveis, sendo um para cada
uma das bases nitrogenadas que compõem o DNA: A, G, C e T.
É preciso polimerizar fragmentos de DNA de diferentes tamanhos, cuja diferença entre eles seja apenas um nucleotídeo. Sendo
assim, certamente, serão produzidos fragmentos terminados por todas as quatro bases, conforme ilustra a �gura a seguir.
 Término prematuro da cadeia de DNA por didesoxiribonucleotídeos (ddNTPs) marcados | Fonte: MENCK, C. F. M.; SLUYS, M-A. V. Genética Molecular Básica: dos Genes aos Genomas.
1.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2017.
A reação de sequenciamento
A reação de sequenciamento é muito semelhante a uma reação em cadeia da
polimerase (PCR).
A diferença entre as técnicas consiste apenas no fato de, no sequenciamento, usarmos apenas um iniciador ou primer por vez, e
não o par de primers. Se usássemos ambos os primers, como o DNA é uma molécula dupla-�ta, não conseguiríamos discernir
quais das �tas estaríamos sequenciando, pois as duas reações de sequenciamento estariam acontecendo simultaneamente.
Desse modo, é preciso organizar o sequenciamento, e separar os tubos de reação, de acordo com os sentidos do primer.
Para preparar uma reação de sequenciamento, além da molécula de DNA que servirá de molde, é necessário:
1
Um primer por reação.
2
A enzima DNA polimerase, responsável pela polimerização da
nova �ta.
3
Os substratos da enzima, ou seja, os dNTPs e os ddNTPs.
A relação dNTP x ddNTP
Para poder produzir os diferentes fragmentos de DNA, você também precisa de dNTPs normais, do contrário, não seria capaz de
produzir diferentes moléculas, cuja diferença entre elas seja apenas um nucleotídeo.  
Se só colocássemos ddNTPs na reação, as moléculas seriam abortadas imediatamente após a incorporação desses nucleotídeos
modi�cados. 
Além da modi�cação no carbono 3’, em função da ausência da hidroxila, os ddNTPs também possuem outra diferença:
Você sabe por que é necessáriotanto dNTP quanto ddNTP?
Eles são marcados com uma �uorescência especí�ca, isto é, cada ddNTP associado a uma
base nitrogenada (A, T, C e G) �uoresce em uma cor diferente quando excitado com laser.
Dessa forma, é possível distinguir a terminação de cadeia de cada molécula, pela cor revelada por cada uma delas. Você saberá
através dessas cores, quais moléculas terminaram em A, em T, em C e em G.
Com isso, será produzida uma variedade de moléculas, de diversos comprimentos, emitindo diferentes �uorescências. Basta
apenas separá-las por tamanho, em ordem crescente, e ler suas respectivas �uorescências, para descobrir a ordem correta das
bases nitrogenadas, conforme ilustra a �gura a seguir.
 Esquema representando a metodologia tradicional de Sanger | Fonte: ALBERTS, B; JOHNSON, A; LEWIS, J.; RAFF, M.; WALTER, P.; ROBERTS, K.; MORGAN, D. Biologia Molecular da Célula.
6.ed. Porto Alegre: ArtMed, 2017.
A eletroforese capilar
Pense no questionamento abaixo:
Se você respondeu que seria através de eletroforese, você acertou. No caso da metodologia de Sanger, a eletroforese é realizada
de forma automatizada.
Como você separaria diferentes moléculas de DNA em função de seu tamanho ou peso
molecular?
A eletroforese acontece em tubos capilares, no interior de equipamentos conhecidos
como sequenciadores.
Ela reproduz o que acontece normalmente nos géis de agarose, onde as moléculas de DNA migram com facilidade inversamente
proporcional ao seu tamanho. Isto é, as moléculas menores encontram menos resistência de migração, conseguindo liderar a
corrida eletroforética.
Atividade
3. FIOCRUZ (2010) - O método de sequenciamento Sanger:
a) É baseado na modificação química do DNA utilizando piperidina e foi, inicialmente, desenvolvido por Allan Maxam e Walter Gilbert e,
mais tarde, modificado por Sanger.
b) É baseado na incorporação de didesoxinucleotídeos que, ao serem incorporados, impedem a adição de nucleotídeos adicionais.
c) Requer todas as enzimas necessárias para a replicação de DNA como Helicases, Polimerases, porém, não necessita da Primase pois são
adicionados iniciadores artificiais com os nucleotídeos e didesoxinucleotídeos.
d) Depende do preparo de géis de acrilamida para separar os diferentes fragmentos de DNA que serão analisados.
e) É limitada pela necessidade do uso de isótopos radioativos para a marcação dos fragmentos de DNA que serão sequenciados.
4. PC-RJ (2011) – Se em uma reação de sequenciamento pelo método de Sanger, o análogo didesoxi do CTP (ddCTP) fosse
acrescentado à mistura de reação em uma concentração maior que aquela do dCTP, isso poderia afetar os resultados da seguinte
forma:
a) Os trechos sequenciados seriam mais longos do que aqueles que seriam obtidos com concentrações menores de ddCTP devido à
pouca afinidade da DNA polimerase por esse substrato.
b) Na presença de excesso de ddCTP, o DNA polimerase não daria início à reação de duplicação da cadeia molde e não seriam obtidos
produtos.
c) Os trechos sequenciados apresentariam excesso de nucleotídeos da citosina, o que introduziria um viés nos resultados.
d) Seriam formados mais oligonucleotídeos de cadeia dupla, nos quais a citosina e a guanina estariam pareados e, devido à maior
estabilidade dessa ligação, ocorreria a interrupção da reação da polimerase.
e) Seria impossível sequenciar inteiramente o DNA, uma vez que aumentaria muito a probabilidade de que ddCTP fosse incorporado na
cadeia e, assim, interrompesse prematuramente a reação da polimerase.
Análise de resultados
Imagine que no �nal da eletroforese capilar fosse possível, através de um detector, você capturar a informação colorimétrica
daquele último ddNTP incorporado, que determinou a interrupção prematura da cadeia, conforme ilustra a �gura a seguir.
 Eletroforese automatizada | Fonte: ALBERTS, B; JOHNSON, A; LEWIS, J.; RAFF, M.; WALTER, P.; ROBERTS, K.; MORGAN, D. Biologia Molecular da Célula. 6.ed. Porto Alegre: ArtMed, 2017.
É exatamente assim que você consegue enumerar a ordem das bases nitrogenadas nucleotídeo a nucleotídeo. À medida que as
diferentes moléculas, em ordem crescente de tamanho, alcançam o �m da corrida, suas respectivas �uorescências são
detectadas e encaminhadas para um software, que associa as cores a cada base nitrogenada. Com isso, ao �nal da reação, você
obtém um mapa genético da amostra que buscou sequenciar, conforme ilustra a �gura a seguir.
 Fluorescência e cromatograma | Fonte: MENCK, C. F. M.; SLUYS, M-A. V. Genética Molecular Básica: dos Genes aos Genomas. 1.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2017.
Para uma mesma amostra, você obterá o sequenciamento genômico obtido a partir dos diferentes sentidos de leitura.
Com isso, você poderá fazer uma espécie de prova real do seu sequenciamento, con�rmando o resultado encontrado, por meio da
complementariedade entre as duas �tas.
Lembra-se de que é necessário separar as reações que acontecem com os primers direto
e reverso?
Um pouco mais de conhecimento
O sequenciamento genômico através da metodologia de Sanger contribuiu de forma substancial para o desenvolvimento de
diversos estudos cientí�cos, voltados para a área de genômica.
Entretanto, sua vazão limitada restringe sua aplicação no caso da necessidade de geração massiva de informação.
A partir dessa técnica, novas metodologias de larga escala surgiram, conhecidas como
sequenciamento de nova geração (NGS).
As novas abordagens promovem a geração de maior volume de dados, bem como permitem a cobertura de genomas completos,
exigindo a experiência de pro�ssionais voltados para a área de bioinformática para o processamento e análise dos dados
gerados.
Atividade
5. UFRJ (2016) – O método de Sanger baseia-se em uma reação de sequenciamento com utilização de terminadores de cadeia
(didesoxinucleotídeos, ddNTPs) marcados com �uorescência, além de nucleotídeos naturais (dNTPs). Originalmente, o produto da
reação era submetido a uma eletroforese em gel de poliacrilamida que permitia realizar a leitura da sequência inicial de DNA.
Atualmente, a eletroforese é feita em capilar dentro dos sequenciadores automáticos. Sobre o método, assinale a opção correta:
a) A reação de sequenciamento de Sanger é realizada com dois iniciadores por reação e uma mistura de nucleotídeos dNTPs e ddNTPs,
em que os ddNTPs encontram-se em maior quantidade do que os dNTPs, e a leitura da sequência é realizada de baixo para cima no gel
de poliacrilamida (sentido 5’-3’ da fita nascente), após a eletroforese.
b) A reação de sequenciamento de Sanger é realizada com apenas um iniciador por reação e uma mistura de nucleotídeos (dNTPs) e
didesoxinucleotídeos (ddNTPs), em que os dNTPs encontram-se em maior quantidade do que os ddNTPs e a leitura da sequência é
realizada de baixo para cima no gel de poliacrilamida (sentido 5’-3’ da fita nascente), após a eletroforese.
c) A reação de sequenciamento de Sanger é realizada com apenas um iniciador por reação e uma mistura de nucleotídeos (dNTPs) e
didesoxinucleotídeos (ddNTPs), em que os ddNTPs encontram-se em maior quantidade do que os dNTPs e a leitura da sequência é
realizada de baixo para cima no gel de poliacrilamida (sentido 5’-3’ da fita nascente) após a eletroforese.
d) A reação de sequenciamento de Sanger é realizada com dois iniciadores por reação e uma mistura de nucleotídeos (dNTPs) e
didesoxinucleotídeos (ddNTPs), em que os ddNTPs encontram-se em maior quantidade do que os dNTPs e a leitura da sequência é
realizada de cima para baixo no gel de poliacrilamida (sentido 5’-3’ da fita nascente), após a eletroforese.
e) A reação de sequenciamento de Sanger é realizada com apenas um iniciador por reação e uma mistura de nucleotídeos (dNTPs) e
didesoxinucleotídeos (ddNTPs), em que os ddNTPs encontram-se em maior quantidade do que os dNTPs e a leitura da sequência é
realizada de cima para baixo no gel de poliacrilamida (sentido 5’-3’ da fita nascente), após a eletroforese.
Notas
Bases nitrogenadas 1
A: adenina, G: guanina, C: citosina e T: timina.
Referências
ALBERTS, B; JOHNSON, A; LEWIS,J.; RAFF, M.; WALTER, P.; ROBERTS, K.; MORGAN, D. Biologia Molecular da Célula. 6.ed. Porto
Alegre: Editora ArtMed, 2017.
BIANCO, B.; LIPAY, M.V.N. Biologia Molecular – Métodos e Interpretação. 1.ed. São Paulo: Roca, 2015.
MENCK, C. F. M.; SLUYS, M-A. V. Genética Molecular Básica: dos Genes aos Genomas. 1.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2017.
WATSON, J. D.; BAKER, T. A.; STEPHEN, P. B.; GANN, A.; LEVINE, M.; LOSICK, R. Biologia Molecular do Gene. 7.ed. Porto Alegre:
Editora ArtMed, 2015.
ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. (Org.). Biologia Molecular Básica. 5.ed. Porto Alegre: Editora ArtMed, 2014.
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