Aula 7 - O sequenciamento de Sanger

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Você consegue imaginar a riqueza de informações que podem ser obtidas a partir do
sequenciamento genômico de um vírus, bactéria, parasita, ou mesmo do homem?
Método de sequenciamento de genoma | Fonte: Ktsdesign / Shutterstock
Você sabe o que é o sequenciamento genômico?
a) Adenina se pareia com timina.
b) A sequência desse pareamento é responsável pelas características genéticas do homem e de todos os seres vivos.
c) A guanina se pareia com citosina.
d) As bases dos nucleotídeos são adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C).
e) A guanina se pareia com adenina.
a) Aminoácidos das proteínas dos cromossomos humanos.
b) Aminoácidos dos genes humanos.
c) Bases nitrogenadas das proteínas humanas.
d) Nucleotídeos do DNA dos cromossomos humanos.
e) Nucleotídeos do rna dos cromossomos humanos.
Você se recorda que o sentido de polimerização da fita de DNA é considerado 5´-> 3’?
Diferença entre os oligonucleotídeos (dNTPs) e os didesoxiribonucleotídeos (ddNTPs) | Fonte: ALBERTS, B; JOHNSON, A; LEWIS, J.; RAFF, M.; WALTER, P.; ROBERTS, K.; MORGAN, D.
Biologia Molecular da Célula. 6.ed. Porto Alegre: ArtMed, 2017.
Término prematuro da cadeia de DNA por didesoxiribonucleotídeos (ddNTPs) marcados | Fonte: MENCK, C. F. M.; SLUYS, M-A. V. Genética Molecular Básica: dos Genes aos Genomas.
1.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2017.
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Você sabe por que é necessário tanto dNTP quanto ddNTP?
Esquema representando a metodologia tradicional de Sanger | Fonte: ALBERTS, B; JOHNSON, A; LEWIS, J.; RAFF, M.; WALTER, P.; ROBERTS, K.; MORGAN, D. Biologia Molecular da Célula.
6.ed. Porto Alegre: ArtMed, 2017.
Como você separaria diferentes moléculas de DNA em função de seu tamanho ou peso
molecular?
a) É baseado na modificação química do DNA utilizando piperidina e foi, inicialmente, desenvolvido por Allan Maxam e Walter Gilbert e,
mais tarde, modificado por Sanger.
b) É baseado na incorporação de didesoxinucleotídeos que, ao serem incorporados, impedem a adição de nucleotídeos adicionais.
c) Requer todas as enzimas necessárias para a replicação de DNA como Helicases, Polimerases, porém, não necessita da Primase pois são
adicionados iniciadores artificiais com os nucleotídeos e didesoxinucleotídeos.
d) Depende do preparo de géis de acrilamida para separar os diferentes fragmentos de DNA que serão analisados.
e) É limitada pela necessidade do uso de isótopos radioativos para a marcação dos fragmentos de DNA que serão sequenciados.
a) Os trechos sequenciados seriam mais longos do que aqueles que seriam obtidos com concentrações menores de ddCTP devido à
pouca afinidade da DNA polimerase por esse substrato.
b) Na presença de excesso de ddCTP, o DNA polimerase não daria início à reação de duplicação da cadeia molde e não seriam obtidos
produtos.
c) Os trechos sequenciados apresentariam excesso de nucleotídeos da citosina, o que introduziria um viés nos resultados.
d) Seriam formados mais oligonucleotídeos de cadeia dupla, nos quais a citosina e a guanina estariam pareados e, devido à maior
estabilidade dessa ligação, ocorreria a interrupção da reação da polimerase.
e) Seria impossível sequenciar inteiramente o DNA, uma vez que aumentaria muito a probabilidade de que ddCTP fosse incorporado na
cadeia e, assim, interrompesse prematuramente a reação da polimerase.
Eletroforese automatizada | Fonte: ALBERTS, B; JOHNSON, A; LEWIS, J.; RAFF, M.; WALTER, P.; ROBERTS, K.; MORGAN, D. Biologia Molecular da Célula. 6.ed. Porto Alegre: ArtMed, 2017.
Fluorescência e cromatograma | Fonte: MENCK, C. F. M.; SLUYS, M-A. V. Genética Molecular Básica: dos Genes aos Genomas. 1.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2017.
Lembra-se de que é necessário separar as reações que acontecem com os primers direto e
reverso?
a) A reação de sequenciamento de Sanger é realizada com dois iniciadores por reação e uma mistura de nucleotídeos dNTPs e ddNTPs,
em que os ddNTPs encontram-se em maior quantidade do que os dNTPs, e a leitura da sequência é realizada de baixo para cima no gel
de poliacrilamida (sentido 5’-3’ da fita nascente), após a eletroforese.
b) A reação de sequenciamento de Sanger é realizada com apenas um iniciador por reação e uma mistura de nucleotídeos (dNTPs) e
didesoxinucleotídeos (ddNTPs), em que os dNTPs encontram-se em maior quantidade do que os ddNTPs e a leitura da sequência é
realizada de baixo para cima no gel de poliacrilamida (sentido 5’-3’ da fita nascente), após a eletroforese.
c) A reação de sequenciamento de Sanger é realizada com apenas um iniciador por reação e uma mistura de nucleotídeos (dNTPs) e
didesoxinucleotídeos (ddNTPs), em que os ddNTPs encontram-se em maior quantidade do que os dNTPs e a leitura da sequência é
realizada de baixo para cima no gel de poliacrilamida (sentido 5’-3’ da fita nascente) após a eletroforese.
d) A reação de sequenciamento de Sanger é realizada com dois iniciadores por reação e uma mistura de nucleotídeos (dNTPs) e
didesoxinucleotídeos (ddNTPs), em que os ddNTPs encontram-se em maior quantidade do que os dNTPs e a leitura da sequência é
realizada de cima para baixo no gel de poliacrilamida (sentido 5’-3’ da fita nascente), após a eletroforese.
e) A reação de sequenciamento de Sanger é realizada com apenas um iniciador por reação e uma mistura de nucleotídeos (dNTPs) e
didesoxinucleotídeos (ddNTPs), em que os ddNTPs encontram-se em maior quantidade do que os dNTPs e a leitura da sequência é
realizada de cima para baixo no gel de poliacrilamida (sentido 5’-3’ da fita nascente), após a eletroforese.