Tecnicas de Coloração

Prévia do material em texto

COLÉGIO INTEGRADO SÃO FRANCISCO
Técnico em Farmácia
TÉCNICAS LABORATORIAS:
COLORAÇÃO DE GRAM, COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
 E ANTIBIOGRAMA
NATHÁLIA ROCATTO MARCHIORO
LUANA BATISTA DOS SANTOS 
Mogi Guaçu
2020
SUMÁRIO
COLORAÇÃO DE GRAM	0
 	1.1 Introdução	0
	1.2 Princípio da Técnica de Gram	0
	1.3 Metodologia da Técnica de Gram	0
	1.4 Observações Importantes	0
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN	0
Introdução	0
	2.2 Princípio da Técnica de Ziehl-Neelsen	0
	2.3 Metodologia da Técnica de Ziehl-Neelsen	0
	2.4 Observações Importantes	0
ANBIOGRAMA	0
Introdução	0
	3.2 Princípio do Antibiograma	0
	3.3 Metodologia do Antibiograma	0
		3.3.1 Leitura do Antibiograma	0
	3.4 Observações Importantes	0
	As técnicas laboratoriais é um conjunto de regras a serem seguidas, com a finalidade de orientar o profissional, para uma melhor execução de uma atividade padrão. É um documento que traduz o planejamento do trabalho a ser cumprido. É uma descrição detalhada de todas as medidas necessárias para a realização de uma tarefa. Se tratando de laboratórios microbiológicos, existem diversos métodos que dentre eles estão: a coloração de gram, a coloração ziehl-neelsen e o antibiograma.
1 COLORAÇÃO DE GRAM
1.1 Introdução
	Hans Christian Joachim Gram (Figura 1) foi o responsável pelo desenvolvimento do método de coloração de Gram. 
	Gram nasceu em 13 de setembro de 1853 na cidade de Copenhague, na Dinamarca. Filho do advogado e professor de jurisprudência Frederik Terkel Julius Gram e de Louise Christiane Rouland. Faleceu em 14 de novembro de 1983, em sua cidade natal, aos 85 anos. Deixou como grande herança a invenção da técnica de Gram que foi o seu trabalho de maior reconhecimento. 
	Hans Christian Joachim Gram foi professor, médico, bacteriologista e farmacologista (MOREIRA; CARVALHO; FROTA, 2015, p.29 e 30).
Figura 1 - Hans Christian Joachim Gram
Fonte: Berdeville, et al., 2019.
1.2 Princípio da Técnica de Gram
	Gram foi quem conseguiu desenvolver a técnica para diferenciar as estruturas bacterianas, no qual permite determinar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir destas colorações com agentes químicos específicos (CAXIAS, 2019). A coloração de Gram é o método bacterioscópico mais importante e mais utilizado atualmente na bacteriologia. Sua finalidade é a classificação de microrganismos em suas características tintoriais, onde bactérias gram positivas coram-se de violeta e gram negativas coram-se de vermelho (FREITAS; PICOLI, 2007, p.124 e 125).
	A parede celular destes microrganismos é constituída de peptidoglicano (polímeros mistos de glicanos lineares, ligados uns aos outros por cadeias laterais de aminoácidos) e tem como principal função proteger a célula, reforçando-a externamente. É responsável por manter a forma bacteriana e serve de suporte sólido para estruturas de locomoção, como os flagelos. Por meio da composição da parede bacteriana, se faz a diferenciação dos grupos (MOREIRA; CARVALHO; FROTA, 2015, p.13-15).
	Para uma bactéria ser classificada como gram positiva (coloração violeta), a parede celular deve ser espessa, pois é composta por muitas camadas de peptidoglicano. Logo, bactérias gram negativas (coloração vermelha) a parede celular é delgada, sobre qual se dispõe de duas camadas diferentes (peptidoglicano e membrana externa) tornando-se mais complexa (CAXIAS, 2019), conformo mostrado na figura 2.
Figura 2 – Estrutura da parede celular de bactérias Gram Positiva e Gram Negativa
Fonte: Autor, “adaptado de” Baptista, 2013, p.3.
	O fundamento da coloração de Gram se baseia na diferença da composição e propriedades químicas e físicas da parede celular das bactérias. Aplicando reagentes como cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica, a técnica se torna extremamente útil para a identificação (CAXIAS, 2019).
1.3 Metodologia da Técnica de Gram
	De acordo com Trento (2018, p.6), a técnica de coloração de Gram geralmente respeita um protocolo de ações que a padroniza. Os reagentes utilizados para este procedimento são: 
· Cristal de violeta – considerado o principal reagente para a realização da técnica, pois ele cora igual todas as bactérias. Atua como corante primário.
· Lugol – sua função é aumentar a afinidade do corante pela célula o que faz com que ela se core mais intensamente.
· Etanol-acetona – age como descorante de diferenciador. A utilização deste solvente orgânico faz com que algumas células se descorem mais facilmente que as outras e isso é o que vai diferenciar as bactérias.
· Fucsina básica – sua função é de contraste e atua como corante secundário. É o corante que dá às células que foram descoradas com o etanol-acetona, a definição da cor das bactérias gram negativo.
	Portanto, segundo o Ministério da Saúde (2001, p.11 e 12) o método da coloração se baseia na capacidade das paredes celulares de bactérias gram positivas, de reterem o corante cristal de violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona, enquanto que as paredes celulares de bactérias gram negativas não o fazem. 
	É importante ressaltar que o corante primário utilizado antigamente era o violeta de genciana. Atualmente utiliza-se outro tipo de cristal de violeta onde já contém o fixador químico, devido a isso a fixação do esfregaço em chama caiu em desuso e é contra indicada. Desta maneira, de acordo com MOREIRA; CARVALHO; FROTA (2015, p.30 e 31), o preparo da coloração de Gram compreende as seguintes etapas:
	Aplicação do cristal de violeta – trata-se de um corante violeta. Antes de aplicar, é necessário fixar as bactérias na lâmina, onde o processo é realizado da seguinte forma: pingar uma gota da cultura bacteriana sobre a lâmina e espalhar com uma haste de inoculação. Esperar secar e passar a lâmina suavemente na chama do bico de Bunsen três vezes. Esperar esfriar e cobri-la com cristal de violeta, deixando agir por um minuto e desprezar o corante primário. 
	Nesta primeira etapa, as bactérias que tiverem a parede celular mais espessa, terão uma coloração forte, já no inicio. Se a parede for delgada, essa coloração não irá fixar e sim sair na primeira lavagem. Portanto, na primeira fase a coloração já será um diferencial para identificar as bactérias gram positivas.
	Aplicação do lugol – a segunda etapa é a aplicação do mordente, o lugol. É necessário aplicar sobre as bactérias para fazer com que o corante primário se fixe na parede desses microrganismos. Deixar agir por um minuto e em água corrente descartar o lugol.
	Descoramento com álcool-acetona – nesta fase, é preciso descolorir a lâmina com álcool-acetona. Com a aplicação deste solvente orgânico, as bactérias gram positivas vão permanecer com coloração violeta e as bactérias gram negativas vão perder a coloração. Nesta etapa é preciso deixar agir por vinte minutos e depois retirar o descolorante da lâmina.
	Aplicação da fucsina básica – na última etapa, adicionar o contra-corante, a fucsina. Ela irá corar apenas a bactérias gram negativas que até o momento não estão coradas. Esse último passo se torna crucial para a identificação de gram negativas. Deixar por 20 segundos e lavar com um fio de água. Deixar secar. 
	Após seco, poderá ver no microscópio a diferenciação das bactérias, onde o tom mais violeta são gram positivas e o tom avermelhado, são as negativas.
Figura 3 – Etapas da técnica de coloração de Gram
Fonte: Autor, “adaptado de” Lima, 2016.
1.4 Observações Importantes
	Tanto bactérias gram positivas quanto bactérias gram negativas, absorvem de maneira idêntica o corante primário, seguido de tratamento com o mordente, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. 
	Com a adição do solvente orgânico, ocorre à dissolução da porção lipídica das membranas externas do microrganismo gram negativo, assim o complexo cristal violeta iodo é removido, pois os poros estão suficientemente grandes, ocasionando descoloração das células. 
	Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das gram positivas e provocaa contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo e dificultando a saída do corante primário no citoplasma. Desta maneira, o reagente não é extraído e as células permanecem coradas.
	É importante enfatizar que o processo de descoloração é crítico, pois a exposição prolongada ao solvente poderá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001, p.25 e 26).
Figura 4 – Microscopia óptica de bactérias Gram Positivas e Gram Negativas
Fonte: Autor, “adaptado de” Trento, 2018, p.5.
2 COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
2.1 Introdução
	O método de coloração de Ziehl-Neelsen foi desenvolvido pelo bacteriologista Franz Ziehl (Figura 5.a) e posteriormente melhorado pelo patologista Friedrich Neelsen (Figura 5.b), no final do século XIX (MOREIRA; CARVALHO; FROTA, 2015, p.59).
		Figura 5 – Desenvolvedores da Técnica de coloração de Ziehl-Neelsen
		 (a) Franz Ziehl 		 (b) Friedrich Neelsen
 
Fonte: Quiroga, 2014.
	A técnica consiste em identificar microrganismos resistentes ao álcool e ácido. Tem como diferencial, o uso de diferentes corantes para criar contraste entre as estruturas que deseja observar, diferenciar e identificar.
	A mancha de Ziehl-Neelsen serve para identificar certos tipos de microrganismos, que deles são micobactérias (por exemplo, Mycobacterium tuberculosis), nocardias (por exemplo, Nocardia sp) e alguns parasitas unicelulares (por exemplo, Cryptosporidium parvum) (LABORCLIN, 2018, p.1). É importante ressaltar que segundo o Ministério da Saúde (2012, p.3), as micobactérias têm formatos de bastonetes, e por este motivo, todas as espécies são classificadas morfologicamente como bacilos (Figura 6).
Figura 6 – Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da Tuberculose 
Fonte: Mega, 2016.
2.2 Princípio da Técnica de Ziehl-Neelsen
	O método de coloração de Ziehl-Neelsen permite a visualização de bactérias que apresentam grande quantidade de lipídeos (cerca de 60%), como ácido micólicos (Figura 7), fortemente ligados à parede celular. Isto é, são bactérias que tem uma parede celular bastante hidrofóbica, consequentemente, dificulta a entrada de corantes aquosos. 
	As bactérias observadas por este método são do gênero Mycobacterium, Nocardia e alguns parasitas. São microrganismos que não foram corados com a coloração de gram e por este motivo, a técnica de Ziehl-Neelsen se torna mais agressiva. Uma característica importante deste método é o fato de ele ser uma coloração à quente (MOREIRA; CARVALHO; FROTA, 2015, p.59)
	De acordo com o Ministério da Saúde (2012, p.18 e 19), o principio deste método, tecnicamente se baseia na resistência à descoloração da fucsina fenicada na parede celular do bacilo, depois da lavagem com soluções álcool-ácido.
	Após a coloração inicial, é utilizado uma solução de álcool-ácido onde não consegue penetrar na parede hidrofóbica das bactérias desses gêneros, as quais são, por esta razão chamadas de Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR). Em contrapartida, os microrganismos que não resistem a esta solução são descorados, tomando a cor do corante, que tem o objetivo apenas de contraste. Esse corante, normalmente é o azul de metileno e no método é considerado o contra-corante.
Figura 7 – Parede celular de uma micobactéria
Fonte: Autor, “adaptado de” Souto, 2011, p.15.
2.3 Metodologia da Técnica de Ziehl-Neelsen
	Para a técnica de Ziehl-Neelsen, os microrganismos são tratados pelo corante fucsina fenicada e coram-se de vermelho, persistem ao descoramento subsequente por uma solução de álcool-ácido forte que tem a função de diferenciador. Por este motivo, elas são conhecidas por Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR). Por outro lado, as bactérias que não possuem paredes celulares ricas em lipídeos, têm sua coloração pela fucsina descorada com a solução de álcool-ácido e coram-se em azul, pela coloração de fundo, azul de metileno (contra-corante) (CÂMARA, 2010).
	Assim como a coloração de Gram, a coloração de Ziehl-Neelsen também respeita um protocolo para sua padronização, e apresenta as seguintes etapas (Figura 8) descritas: 
Figura 8 – Etapas da técnica de coloração de Ziehl-Neelsen
Fonte: Autor, “adaptado de” Lima, 2016.
	Antes de iniciar o procedimento técnico de coloração, ocorre a etapa nomeada de esfregaço, onde na lâmina já está a amostra no qual irá analisar (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012, p.16 e 17).
	Aplicação da fucsina de Ziehl – inicialmente, utiliza-se o corante fucsina fenicada (corante fucsina de Ziehl) que tem o tom avermelhado. Cobrir o esfregaço (homogêneo, delgado e fixado) contido na lâmina, com este mordente. 
	Em seguida, aquecer a lâmina até a emissão de vapores (importante esta etapa, pois o líquido não pode entrar em ebulição), e iniciar a contagem de cinco minutos. Lavar a lâmina com água, suavemente. 
	Descoramento com álcool-ácido – nesta etapa, é preciso descorar a lâmina com álcool-ácido. Com a aplicação desta solução, os microrganismos Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR) vão permanecer com coloração vermelha, devido à impermeabilidade da parede celular. Aplicar por dois minutos e desprezá-lo. Lave a lâmina com água, sob baixa pressão.
	Aplicação do azul de metileno – e por último, adicionar o contra-corante, o azul de Metileno, por cerca de um minuto. Ele irá corar apenas microrganismos que não são morfologicamente considerados BAAR. 
	Lavar com um fio de água e após seco, poderá visualizar no microscópio a diferenciação. De acordo com a figura 9, os Bacilos Álcool-Ácido Resistentes aparecem sob forma de bastonetes em fundo azul. Já a coloração azul, afirma que são microrganismos não BAAR (MOREIRA; CARVALHO; FROTA, 2015, p.59 e 60).
Figura 9 – Microscopia óptica da coloração de Ziehl-Neelsen, presença de BAAR em vermelho
Fonte: Autor, “adaptado de” Fujimoto, 2010, p.5.
2.4 Observações Importantes
	O método de Ziehl-Neelsen é tradicionalmente usado em laboratórios para diagnostico de micobacterioses devido à sua simplicidade e rapidez (COELHO, et al., 2008). Este implica na atuação da fucsina fenicada à quente, corando todas as células microbianas e outras estruturas presentes no esfregaço de vermelho. Com o calor, os lipídios presentes na membrana tornam-se permeável. O ácido diluído em álcool, aplicado vão descorar todas as bactérias, exceto aquelas ácido-álcool resistentes que permanecem coradas de vermelho devido à fucsina. Antes de iniciar este procedimento, é importante filtrar a solução de fucsina fenicada, pois existe nela a formação de cristais que podem confundir com micobactérias (CÂMARA, 2010).
	O método de Ziehl-Neelsen se executado corretamente, desde a coleta e processamento da amostra até a leitura microscópica, permite uma eficácia garantida. Usa-se a característica de álcool-ácido resistentes para a identificação de organismos patológicos. 
	As amostras utilizadas para detectar o tipo de microrganismos, são coletadas de escarros, urinas, fezes, entre outros (LABORCLIN, 2018, p.1)
3 ANTIBIOGRAMA
3.1 Introdução
	Nem toda bactéria é sensível a um mesmo antibiótico, algumas não respondem ou são resistentes a um determinado produto. Diante disto, é necessário o uso de um antibiótico específico, baseando-se no conhecimento que tem da prevalência de determinados agentes patogênicos em cada tipo de tecido ou infecção (ABCMED, 2017).
	Os antibióticos constituem um grupo de fármacos que combatem infecções bacterianas e podem ser classificados como bactericidas ou bacteriostáticos. No entanto, o Antibiograma, também conhecido por Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA), é um ensaio capaz determinar o perfil de sensibilidade e resistência de bactérias e fungos aos antibióticos. É por definição, um teste de sensibilidade in vitro. 
	Este ensaio é uma das principais tarefas executadas pelo laboratório de microbiologia. E por meio deste, orienta a escolha da terapia antimicrobiana mais adequada (HORTA, 2016).
3.2 Princípio do Antibiograma
	Como já mencionado, o Antibiograma é o resultadode um teste laboratorial para a sensibilidade de uma bactéria isolada a diferentes antibióticos. Para realizar este exame, é necessário que os microrganismos tenham se desenvolvido previamente num meio de cultura. 
	Em geral, o meio de cultura é colocado na placa de petri (placa de acrílico de formato redondo), onde deve conter nutrientes fundamentais para que microrganismos existentes em determinada amostra biológica cresçam e se multipliquem (Figura 10).
	Os principais componentes de um meio de cultura são fontes de carbono, açúcares, nitrogênio, fosforo e sais minerais. Além desses, diversos outros componentes podem ser usados para a feitura dos meios de cultura específicos para determinados organismos.
Figura 10 – Placa de petri com diversos meio de cultura
Fonte: SPLabor, 2018.
	Os principais componentes de um meio de cultura são fontes de carbono, açúcares, nitrogênio, fosforo e sais minerais. Além desses, diversos outros componentes podem ser usados para a feitura dos meios de cultura específicos para determinados organismos. 
	Alguns meios de cultura são geralmente indicados para nutrir e estimular o crescimento, enquanto que outros visam inibir determinado microrganismo. Além de meios seletivos, existem também outros meios que permitem diferenciar os microrganismos entre si.
	Portanto, esta técnica é destinada à determinação da sensibilidade bacteriana in vitro frente a agentes antimicrobianos, sendo também conhecida por Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA) (ABCMED, 2017).
3.3 Metodologia do Antibiograma
	Para a realização do TSA, necessariamente a bactéria em questão, deverá ter sido isolada e realizado os testes de gram, catalase, DNAse e coagulasse, a fim de fazer uma previa identificação da bactéria para a escolha dos discos de antibióticos apropriados. Os discos de antibióticos são impregnados com uma concentração determinada de agente antimicrobiano, onde são colocados na superfície de um meio adequado (LABORCLIN, 2019, p.1).
	Os microrganismos poderão ser coletados por meio do material biológico do paciente como sangue, urina, saliva, catarro, fezes ou células do órgão contaminado. Este material é encaminhado para laboratório microbiológico para a análise adequada seguindo o procedimento técnico: 
1.	Com uma alça bacteriológica em platina, devidamente flambada e resfriada (Figura 11.a), tocar na colônia de bactérias recente (ter de 18 a 24 horas de idade de cultura), conforme a figura 11.b.
Figura 11 – Suspensão da bactéria no meio
Fonte: Autor, “adaptado de” Santos, 2012.
2.	Suspender as colônias em solução salina estéril (NaCl a 0,85%) (Figura 11.c) até se obter uma turvação compatível com o grau 0,5 da escala Mac Farland (comparar visualmente ou também, em espectrofotômetro).
3.	Mergulhar um swab estéril na suspensão bacteriana (Figura 12.a), comprimindo-o contra as paredes do tubo para tirar o excesso da suspensão, e semear em seguida de forma suave em todas as direções na placa de petri (cinco direções), procurando abranger toda a superfície (Figura 12.b).
4.	Aguardar, em torno de 15 minutos, para a superfície do ágar secar. Automaticamente a suspensão bacteriana será parcialmente absorvida pelo meio de cultura.
5.	Com o auxílio de uma pinça flambada e resfriada, colocar os discos de antibióticos, sobre a superfície do meio inoculado, exercendo uma leve pressão com a ponta da pinça para uma boa adesão dos discos (Figura 12.c).
6.	Incubar a placa com os discos em estufa bacteriológica a 36 graus por 18 a 24 horas (Figura 12.d). 
7.	Após 24 horas, é necessário fazer a leitura do antibiograma (Figura 12.e), onde com o auxílio de uma régua, paquímetro ou dispositivo semelhante, é preciso medir o diâmetro dos halos inibitórios de cada disco, e consultar uma tabela apropriada para a determinação da bactéria em análise, sendo ela sensível, intermediária ou resistente ao antimicrobiano testado (LABORCLIN, 2011, p.3 e 4).
Figura 12 – Etapas do método de Antibiograma
Fonte: Autor, “adaptado de” Diniz, 2018.
3.3.1 Leitura do Antibiograma
	Depois de algumas horas de incubação, examina-se a placa, onde foi satisfatoriamente semeada. 
	Os discos de papel de filtro impregnado com uma concentração de um determinado antibiótico são distribuídos e levemente pressionados sobre a superfície do ágar para verificar a resistência em relação ao microrganismo ali aplicado. O antibiótico teste começa a difundir para fora a partir dos pequenos discos. Criando um gradiente de concentração do antibiótico no ágar. Após a incubação, o crescimento bacteriano em volta de cada disco é observado. 
	A área clara que rodeia o disco (denominada de halo) revela o local na qual as bactérias não conseguem se desenvolver (Figura 13) (ANVISA, 2008, p.2-4).
Figura 13 – Teste de sensibilidade aos antimicrobianos, com diversos tamanhos de halos
Fonte: Anvisa, 2008, p.1.
	Os diâmetros dos halos de inibição (julgados visualmente) são avaliados, incluindo o diâmetro do disco de antibiótico. Os halos são medidos em milímetros usando um paquímetro ou uma régua, que é encostado na parte de trás da placa de petri invertida. Portanto, é necessário, segurar a placa de petri poucas polegadas acima de um fundo não refletor, iluminando-a com luz refletida (emprega-se luz no antibiograma para verificar se há crescimento discreto de colônias resistentes).
	Após a medição dos halos, é feita a sua interpretação, utilizando os critérios estabelecidos pelo CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) específicos para a bactéria. Desta maneira, as amostras bacterianas são categorizadas em sensíveis, resistentes e intermediárias (ANVISA, 2008, p.2-4).
Figura 14 – Ilustração de amostra bacteriana classificada em resistente e sensível
 Fonte: Autor, “adaptado de” CÂMARA, 2011.
	Os matérias e equipamentos necessários nesta técnica são: estufa bacteriológica, alças bacteriológicas em platina ou descartáveis estéreis, agar em placas, tubo com escala 0,5 Mac Farland, solução salina estéril a 0,85%, termômetro de máxima e mínima para controle da estufa, swabs estéreis para espalhamento da suspensão, tabelas com os valores esperados de halos inibitórios e bico de Bunsen (LABORCLIN, 2011, p.3).
3.4 Observações Importantes
	Antes de iniciar o procedimento antibiograma, é necessário retirar as placas e os frascos com os discos da geladeira, por cerca de 20 a 30 minutos para que adquiram a temperatura ambiente antes da execução da prova (LABORCLIN, 2011).
 	
	Outro ponto importante é a utilização de materiais estéreis no processo para evitar contaminação cruzada que poderá acarretar em uma identificação errônea e provavelmente um diagnóstico errado (ABCMED, 2017).
	Os discos de antibióticos são escolhidos de acordo com a classificação da bactéria a ser analisada (ANVISA, 2008, p.2).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
ABCMED. Meios de cultura e antibiograma, AbcMed – Informações sobre a sua Saúde, 2017. Disponível em: <https://www.abc.med.br/p/exames-e-procedimentos
/1301998/meios+de+cultura+e+antibiograma.htm>. Acesso em: 14 jul. 2020.
ANVISA. Interpretação de dados microbiológicos, Anvisa, 2008, p. 1-4. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/atm_racional
/modulo2/metodos5.1.htm>. Acesso em: 06 jul. 2020.
BAPTISTA, M. G. de F. M. Mecanismos de Resistência aos Antibióticos. 2013. 42 f. Tese (Curso de Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Ciências e Tecnologias da Saúde, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologia, Lisboa, 2013. Disponível em: <http://recil.grupolusofona.pt/bitstream/
handle/10437/3264/Mecanismos%20de%20Resist%C3%AAncia%20aos%20Antibi%C3%B3ticos%20%20Maria%20Galv%C3%A3o%20Ba.pdf?sequence=1>. Acesso em: 05 jul. 2020.
BERDEVILLE, C. H. de S. F.; BENEDITO, M. L. P.; WYLLIE, M. H. B.; OLIVEIRA, J. da S. P de; SANTOS, S. C. F. A biografia de Hans Christian Gram. Microbiologia IFRJ – Campus Rio de Janeiro, 2019. Disponível em: <http://micro-ifrj.blogspot.com
/2019/05/a-biografia-de-hans-christian-gram.html>.Acesso em: 04 jul. 2020.
CÂMARA, B. Ágar Mueller Hinton. Biomedicina Padrão – O blog da biomedicina, 2011. Disponível em: <https://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/05/agar
-mueller-hinton.html>. Acesso em: 15 jul. 2020.
CÂMARA, B. Pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR). Biomedicina Padrão – O blog da biomedicina, 2010. Disponível em: <https://www.
biomedicinapadrao.com.br/2010/10/pesquisa-de-bacilos-alcool-acido.html#
:~:text=O%20diagn%C3%B3stico%20das%20Micobact%C3%A9rias%20patog%C3%AAnicas,cerca%20de%2060%25%2C%20principalmente%20de>. Acesso em: 14 jul. 2020.
CAXIAS, M. Coloração de Gram. IBAP – Instituto Biomédico de Aprimoramento Profissional, 2019. Disponível em: <https://ibapcursos.com.br/coloracao-de-gram/>. Acesso em: 04 jul. 2020.
COELHO, A. C.; PINTO, M. L.; COELHO, A. M; RODRIGUES, J. Coloração de Ziehl-Neelsen como método rápido de diagnóstico de paratuberculose ovina. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Vila Real, v.60, n. 5, p.1097-1102, 2008. Disponível em: <https://www.scielo.br/pdf/abmvz/v60n5/09.pdf>. Acesso em: 12 jul. 2020.
DINIZ, C. G. Roteiro de Aulas Práticas – Bacteriologia – Farmácia. Universitário UFJF (Departamento de Parasitologia, Microbiologia e Imunologia – Setor de Microbiologia), Juiz de Fora, 2018. Disponível em: <https://www.ufjf.br/
microbiologia/files/2013/05/ROTEIRO-PARA-AULAS-PR%c3%81TICAS-bacteriologia-2018-vers%c3%a3o-02-2018.pdf>. Acesso em: 11 jul. 2020.
FREITAS, V. da R.; PICOLI, S. U. A Coloração de Gram e as Variações na sua Execução. NewsLab, São Paulo, 2007, ed. 82, p. 124-125. Disponível em: <https://docs.ufpr.br/~microgeral/arquivos/pdf/pdf/Gram.pdf>. Acesso em: 05 jul. 2020.
FUJIMOTO, L. B. M. CORANTES ALTERNATIVOS PARA USO NO DIAGNÓSTICO BACILOSCÓPICO DE TUBERCULOSE. 2010. 88 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia, área de concentração em Saúde) – Programa Multi-Institucional de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2010. Disponível em: <https://tede.ufam.edu.br/bitstream/tede/3110/1/Tese%
20Final%20Luciana%20Botinelly.pdf>. Acesso em: 10 jul. 2020.
HORTA, V. Os antibióticos, as bactérias e as doenças, Atlas da Saúde, 2016. Disponível em: <https://www.atlasdasaude.pt/publico/content/os-antibioticos-bacterias-e-doencas>. Acesso em: 11 jul. 2020.
LABORCLIN. Antibiograma. Laborclin Produtos para Laboratórios Ltda, Pinhais, 2011, rev. 5, p. 3 e 4. Disponível em: <https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/05/discos_de_antibioticos_.pdf>. Acesso em: 06 jul. 2020.
LABORCLIN. Coloração de Ziehl-Neelsen. Laborclin Produtos para Laboratórios Ltda, Pinhais, 2018, rev. 10, p. 1. Disponível em: <https://www.laborclin.com.br/
wpcontent/uploads/2019/05/COLARACAO_ZIEHL_NEELSEN_19122018.pdf>. Acesso em: 06 jul. 2020.
LABORCLIN. Discos de Antibióticos. Laborclin Produtos para Laboratórios Ltda, Pinhais, 2019, rev. 11, p. 1. Disponível em: <https://www.laborclin.com.br/wp
-content/uploads/2019/05/discos_de_antibioticos_.pdf>. Acesso em: 06 jul. 2020.
LIMA, Z. N. Coloração de Gram. Detalhes Microbiológicos, Paraíba, 2016. Disponível em: <https://microimunoliga.blogspot.com/2016/08/pratica-7_3.html>. Acesso em: 06 jul. 2020.
MEGA, H. C. Técnica de biologia molecular realiza diagnóstico rápido de tuberculose. A UN Usp 50 anos (Ciência e Tecnologia - Faculdade de Medicina), São Paulo, ed. 38, 2016. Disponível em: <http://www.usp.br/aunantigo/exibir?id
=7613&ed=1321&f=7>. Acesso em: 07 jul. 2020.
MINISTÉRIO DA SAÚDE. Manual de Baciloscopia da Tuberculose. Maputo, 2012, p. 3-19. Disponível em: <https://www.fhi360.org/sites/default/files/media/documents/
TB%20Basiloscopy%20Manual.pdf>. Acesso em: 06 jul. 2020.