Capítulo 6 - Clivagem embrionária e blastulação - Embriologia Veterinária Poul Hyttel

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Capítulo 6
Clivagem embrionária e blastulação
Morten Vejlsted
Após a fertilização, a meiose é concluída, a ciclicidade celular retorna ao padrão
mitótico. O genoma embrionário único é estabelecido por meio da mistura dos
cromossomos paternos e maternos com a dissolução dos dois pronúcleos. Este evento
provê ao zigoto a genética completa para o desenvolvimento embrionário. O
citoplasma do zigoto, herdado do ovócito, contém a composição molecular e
estrutural completa e necessária para iniciar as primeiras clivagens e,
posteriormente, ativar o genoma do embrião para a nova transcrição embrionária.
Assim, a fase inicial de desenvolvimento é guiada por informações armazenadas no
ovócito e passadas ao zigoto e ao embrião recém-formado.
Clivagens e ativação do genoma
No zigoto, a fase S é concluída durante o primeiro ciclo celular após a fertilização.
Assim, quando o zigoto cliva em um embrião de duas células na primeira mitose,
cada uma das duas células, denominadas blastômeros, contém uma cópia completa
do genoma embrionário (Figs. 2-1, 6-1). O embrião ainda é, e continuará sendo,
circundado pela zona pelúcida por alguns dias. Uma série de divisões mitóticas
continuam a ocorrer. Durante esta fase de desenvolvimento, as divisões mitóticas são
peculiares, pois ocorrem quase sem crescimento celular, as células vão se tornando
cada vez menores, pois o citoplasma original do zigoto é dividido em porções cada
vez menores. Estas divisões celulares são denominadas clivagens. Os blastômeros
podem ser de tamanhos desiguais devido a uma assincronia na clivagem. Esta
assincronia torna-se aparente desde o início, mesmo entre os estágios de duas e
quatro células, que resulta em um temporário embrião de três células. Ao menos no
camundongo, o ponto de penetração do espermatozoide pode posicionar o plano da
primeira clivagem. Além disso, no estágio duas células, o blastômero que herda o
local de entrada do espermatozoide tende a se dividir mais precocemente e tem a
maior probabilidade de originar as células posicionadas internamente no crescente
montante celular.
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Fig. 6-1 Cortes de um zigoto bovino (A) com dois pronúcleos (setas) e de um embrião de
duas células (B) com núcleos (setas).
As clivagens iniciam-se durante o transporte embrionário pelo oviduto, mas em
um estágio espécie específico do desenvolvimento, o embrião chega ao útero (Tabela
6-1). A égua é muito particular no que diz respeito ao transporte pelo oviduto, a
entrada no utero é permitida somente para embriões, enquanto ovócitos não
fertilizados, por um mecanismo ainda desconhecido, ficam retidos no oviduto.
Tabela 6-1 Momento de passagem do embrião do oviduto para o útero e de formação de
blastocistos, em diferentes espécies
Durante o crescimento ovocitário, transcritos e proteínas são armazenados nestas
células especializadas para uso futuro (Fig. 6-2). No final da fase de crescimento a
transcrição diminui. No entanto, o ovócito pode ser carregado em maior ou menor
grau com os transcritos e proteínas necessários para a condução do desenvolvimento
embrionário inicial e que governam, ao menos, a primeira clivagem. Os transcritos e
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as proteínas são gradualmente degradados após a fertilização e, em certo estágio de
desenvolvimento, a atividade do genoma embrionário é necessária. O genoma
embrionário é ativado gradualmente; a transcrição é muito limitada no início, mas
aumenta em estágios espécie-específicos e em duas fases: a ativação menor e a
ativação principal do genoma embrionário (Tabela 6-2).
Fig. 6-2 Controle materno versus embrionário do desenvolvimento inicial do embrião.
Durante a fase de crescimento ovocitário nos folículos, transcritos e proteínas são acumuladas
no ovócito. Com o desenvolvimento, esses componentes são gradualmente utilizados e
degradados. Em paralelo, o genoma embrionário passa inicialmente por uma ativação menor e
subsequentemente pela ativação principal. Este processo ocorre no estágio de quatro células
em suínos e oito células em bovinos.
Tabela 6-2 Momento da ativação menor e ativação principal do genoma embrionário em
diferentes espécies
Espécies Ativação menor do genoma Ativação principal do genoma
Camundongo Fase G2 do primeiro ciclo celular (zigoto) Segundo ciclo celular (embrião de duas células)
Suíno Desconhecido Terceiro ciclo celular (embrião de quatro células)
Bovino Primeiro ciclo celular (zigoto) Quarto ciclo celular (embrião de oito células)
Canino Desconhecido Quarto ciclo celular (embrião de oito células)
Equino Desconhecido Do quarto para o quinto ciclo celular (embrião de oito a 16 células)
Ovino Desconhecido Do quarto para o quinto ciclo celular (embrião de oito a 16 células)
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Após poucas divisões celulares, o embrião adquire a forma de uma pequena
massa de células denominada mórula, nome em latim para amora.
Compactação
Todas as células individuais da mórula são idênticas às iniciais, suas formas esféricas
dão à mórula a aparência típica de uma amora. Mais tarde, porém, as células
exteriores diferenciam-se em um epitélio firmemente unido atribuindo ao embrião
uma superfície mais lisa. Este processo é conhecido como compactação (Fig. 6-3). As
células externas constituem o trofectoderma ou trofoblasto. Neste livro, o termo
trofectoderma será utilizado quando se referir a um período anterior à placentação e
trofoblasto quando estas células já estiverem comprometidas com a formação da
placenta. A firme união entre as células vizinhas do trofectoderma resultam em
junções intercelulares especializadas, incluindo junções do tipo oclusivas e
desmossomos. Assim, um típico epitélio com compartimentos celulares apicais e
basolaterais é formado. Existem algumas diferenças entre as espécies para o período
de compactação: no suíno ocorre muito cedo no desenvolvimento, ao redor do estágio
de oito células, enquanto que em bovinos acontece mais tarde, por volta do estágio
de 16 a 32 células.
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Fig. 6-3 Cortes de embriões de suínos. A: embrião de quatro células apresentando três
blastômeros e um núcleo (seta). 1: Zona pelúcida. B: Mórula no processo de compactação.
Observe a estreita ligação (seta) entre as células externas. 1: Zona pelúcida. C: Blastocisto. 1:
Zona pelúcida; 2: Trofectoderma; 3: MCI. D: Blastocisto expandido. 1: Zona pelúcida; 2:
Trofectoderma; 3: MCI.
Do ponto de vista molecular, a diferenciação dos blastômeros mais externos, ao
menos em camundongos, parece ser dependente da diminuição na expressão do fator
de transcrição Oct4, seguido do aumento na expressão de outros fatores de
transcrição como Cdx2 e Eomesodermina (Fig. 6-4). Concomitantemente, as células
internas conservam a expressão de Oct4.
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Fig. 6-4 Ação sequencial dos fatores de transcrição Oct4, Nanog, Cdx2 e GATA-6 durante a
diferenciação celular inicial no embrião de camundongo. Na compactação celular duas
linhagens são derivadas de blastômeros totipotentes: a massa celular interna pluripotente
(MCI) e o trofectoderma. O epiblasto mais tarde se diferencia em hipoblasto e epiblasto.
Blastulação
A compactação da mórula é um pré-requisito para posterior blastulação – formação
de uma cavidade repleta de líquido no centro do embrião, a blastocele. A blastulação
ocorre geralmente dentro do lúmen uterino durante a primeira semana de
desenvolvimento e transforma o embrião em um blastocisto (Fig. 6-5).
Fig. 6-5 Blastocisto suíno no dia seis de desenvolvimento, observado em estereomicroscópio.
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1: Zona pelúcida; 2: Trofectoderma; 3: Blastocele; 4: Massa celular interna (MCI).
A blastulação é provocada principalmente pelo controle do trofectoderma sobre
o transporte de fluidos para a cavidade. Ao final, os blastômeros internos
posicionam-se em um polo do embrião formando a massa celular interna (MCI).
Células derivadas da MCI formarão o embrião propriamente dito, enquanto que as
células do trofectoderma originarão a parte embrionária da placenta (Cap. 9). A
proporção entre as células MCI e trofectoderma é de cerca de 1:3. A porção do
trofectoderma que recobre a MCI é conhecidacomo trofectoderma polar enquanto
que o restante é conhecido como trofectoderma mural (Fig. 6-6).
Fig. 6-6 Blastocisto bovino no dia seis de desenvolvimento. O quadro (B) refere-se à figura
observada na ultraestrutura em “B”. A: Corte em microscopia de luz. Observa-se que as células
planas do hipoblasto (setas) começam a formar-se da MCI. 1: MCI; 2: Trofectoderma mural; 3:
Trofectoderma polar; 4: Zona pelúcida. B: Microscopia eletrônica de transmissão de duas
células adjacentes do trofectoderma. 5: Junção oclusiva; 6: Desmossoma; 7: Microvilos; 8: Zona
pelúcida.
Com a pressão osmótica no interior da cavidade do blastocisto subindo, o
embrião gradualmente se expande. No lavado uterino para a coleta e transferência
de embriões é comum encontrar blastocistos em colapso com capacidade de
reexpandir. No entanto, não é conhecido se tratar de um artefato in vitro ou de um
fenômeno fisiológico intrauterino. Ao final, a expansão do blastocisto leva à ruptura
da zona pelúcida (Fig. 6-7) e permite que o embrião escape pela abertura. Em
algumas espécies, este processo, conhecido como eclosão, é auxiliado por enzimas
proteolíticas liberadas pelo endométrio e que agem nas glicoproteínas que compõem
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a zona pelúcida. Em equinos, forma-se uma cápsula “compensatória” entre o
trofectoderma e a zona pelúcida antes que esta seja rompida. A cápsula desempenha
um importante papel na manutenção da prenhez precoce para esta espécie (Cap. 9).
Fig. 6-7 Eclosão do blastocisto suíno. Os núcleos estão marcados com o corante fluorescente
Hoechst 33342 e espermatozoides supranumerários são visualizados aderidos à zona pelúcida
(seta).
(Foto: Wouter Hazeleger.)
Próximo ao período da eclosão, a MCI diferencia-se em duas populações de
células: aquelas voltadas a blastocele formando uma camada achatada denominada
hipoblasto (Fig. 6-8); e aquelas remanescentes formam uma camada multicelular
chamada epiblasto. Pequenas cavidades intercelulares podem surgir no epiblasto. O
hipoblasto, como o trofectoderma, tem característica epitelial. Gradualmente, ele
forma um completo revestimento interno abaixo não apenas do epiblasto, como
também do trofectoderma. Nos equinos, o hipoblasto inicialmente forma “colônias”
separadas que posteriormente unem-se em um fechado compartimento interno. Em
ambos os casos, uma cavidade denominada saco vitelino primitivo é formada. Do
ponto de vista molecular, ao menos em camundongos, a expressão do fator de
transcrição Nanog é essencial para a formação do epiblasto (Fig. 6-4), enquanto o
fator de transcrição GATA-6 é um regulador-chave na formação hipoblasto. O
epiblasto mais tarde formará o embrião propriamente dito enquanto o hipoblasto vai
formar o epitélio interno do saco vitelino, que dependendo da espécie, pode estar
envolvido com a placentação (Cap. 9). No camundongo e no coelho, entretanto, o
hipoblasto também tem demonstrado desempenhar um papel importante na
regulação da proliferação, sobrevivência e diferenciação do epiblasto sobrejacente.
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Esta regulação é, em parte, mediada pela formação de uma membrana basal entre o
hipoblasto e o epiblasto.
Fig. 6-8 Blastocistos bovinos aos dias 10 (A) e 12 (B) de desenvolvimento. 1: Epiblasto; 2:
Trofectoderma; 3: Hipoblasto. Observa-se a camada Rauber em processo de degeneração em B
(seta).
Nas espécies domésticas, o trofectoderma polar que recobre o epiblasto
(conhecido como camada de Rauber) gradualmente se desintegra e é perdido,
expondo o epiblasto para o ambiente uterino. No entanto, antes do desprendimento
da camada de Rauber, junções do tipo oclusivas são formadas entre as células mais
periféricas do epiblasto com o objetivo de selar o embrião, apesar da perda do
trofectoderma polar. Após a perda da camada de Rauber, o epiblasto é claramente
perceptível como uma estrutura brilhante, inicialmente circular tornando-se oval.
Junto com hipoblasto subjacente é conhecido como disco embrionário (Figs. 6-9, 6-
10).
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Fig. 6-9 Blastocisto suíno no dia 10 de desenvolvimento. O disco embrionário no quadro (B)
observado em uma maior ampliação em B.
Fig. 6-10 Disco embrionário em embrião bovino. A: Embrião ovoide no dia 14 de
desenvolvimento com pouca visualização do disco embrionário (seta). A linha (B) indica o corte
exibido em B. B: Corte através do disco embrionário (1). 2: Epiblasto; 3: Trofectoderma com
microvilos; 4: Hipoblasto; 5: Saco vitelino primitivo.
Alongamento do blastocisto
Durante a formação do disco embrionário, o blastocisto ainda está em expansão. Uma
vez que o disco é formado, o trofectoderma com o hipoblasto subjacente remodelam-
se e o embrião torna-se ovoide (Fig. 6-10). Em ruminantes e suínos, o processo de
alongamento continua, e o embrião se torna primeiro tubular e posteriormente
filamentoso (Fig. 6-11). A massa embrionária total não aumenta na mesma
proporção que o comprimento, assim o embrião torna-se filiforme e tremendamente
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longo. Este fenômeno é particularmente marcante no suíno no qual o embrião
desenvolve-se de uma esfera de cerca de um centímetro de diâmetro no dia 10 para
uma estrutura filamentosa de aproximadamente um metro de comprimento no dia
13. O alongamento ocorre de modo intenso particularmente nos dias 12 e 13 (30-45
milímetros por hora!). Este aumento não pode ser explicado somente por mitoses, e
envolve também a reestruturação do citoesqueleto e da forma celular. Em
ruminantes, o alongamento do embrião é menos evidente; em bovinos o
comprimento aumenta até 35 cm entre os dias 12 e 21 (Fig. 6-12).
Fig. 6-11 Alongamento do embrião suíno. A: Embrião esférico (1) e tubular (2) no dia 11 de
desenvolvimento. O embrião tubular é um pouco enovelado. B: Entremeado de embriões
filamentosos no dia 13 de desenvolvimento. Observa-se o disco embrionário (3) e as
extremidades terminais dilatadas do embrião (4).
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Fig. 6-12 Alongamento de embriões bovinos ao redor de 16 (A), 18 (B), 22 (C), e 27 (D) dias
de desenvolvimento.
Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998).
Em contraste com os ruminantes e os suínos, nos equinos o embrião não se
alonga e permanece esférico durante esta fase do desenvolvimento.
Resumo
No zigoto, a meiose é finalizada e o genoma embrionário único é formado.
Completada a fase S do primeiro ciclo celular pós-fertilização, o zigoto entra no ciclo
celular mitótico e cliva em duas células. Esta clivagem, e as várias subsequentes,
ocorrem sem o crescimento celular, assim as células ficam cada vez menores. Em
um estágio de desenvolvimento variável entre as espécies, ocorre a ativação
principal do genoma embrionário. Após um determinado número de divisões, o
embrião chega ao útero na forma de um aglomerado celular semelhante a uma amora
e denominado mórula. Durante o processo de compactação, os blastômeros mais
externos da mórula unem-se uns aos outros para desenvolver o trofectoderma. Uma
cavidade cheia de fluido, a blastocele, desenvolve-se no interior do trofectoderma
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enquanto as células internas reunem-se em um polo do embrião para formar a massa
celular interna (MCI) e o embrião passa a receber o nome de blastocisto. Em uma
fase do desenvolvimento variávels entre as espécies, o blastocisto sai da zona
pelúcida com a eclosão. Próximo ao período de eclosão, as celulas internas da MCI
delaminam e formam um epitélio, o hipoblasto, no interior do blastocisto. A
cavidade delimitada pelo hipoblasto é denominada saco vitelino primitivo. As
células externas da MCI formam o epiblasto, que mais tarde originará o embrião
propriamente dito. O trofectoderma que recobre o epiblasto, a camada de Rauber, é
subsequentemente perdido, assim, o epiblasto é exposto ao ambiente uterino e torna-
se confluente com o trofectoderma. Nesta fase, o epiblasto e o hipoblasto formam o
disco embrionário. Após a eclosão, o blastocisto mantém inicialmente a forma
esférica, mas em suínos e ruminantes (não em equinos), torna-se ovoide, e alongam-
se, tornando-se sucessivamente tubular e filamentoso.
Quadro 6-1 Regulação molecular da blastulação
Próximo ao estágio de mórula, os blastômerosperdem a totipotência e duas linhagens
celulares distintas tornam-se evidentes: células internas, formando a MCI e células externas
formando o trofectoderma. A formação da MCI e do trofectoderma constitui o primeiro
processo de diferenciação durante o desenvolvimento embrionário. Em termos moleculares,
no entanto, recentes descobertas em camundongos demonstram que o padrão molecular para
essa diferenciação é estabelecido tão cedo quanto na fase de quatro células. Como
mencionado no Capítulo 2, a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário são
epigeneticamente controlados, uma vez que todas as células (com algumas exceções, p. ex., a
linhagem de linfócitos) descendem do zigoto e compartilham as mesmas sequências de DNA.
A modificação nas histonas é um desses mecanismos de controle epigenético. Em
camundongos, a dependência do arranjo espacial de cada dos quatro blastômeros e a ordem
em que são gerados, faz com que alguns blastômeros aparentemente fiquem com mais
metilações de resíduos de arginina em histona H3 do que outros. Os blastômeros mais
metilados tendem a formar as células internas e, consequentemente, a MCI; os menos
metilados tendem a formar células externas, e, portanto, o trofectoderma.
Em termos morfológicos, a diferenciação da MCI e do trofectoderma é inicialmente
evidenciada por alterações na superfície celular que aumentam a adesão entre blastômeros.
Isso é mediado pela expressão de moléculas de adesão celular transmembrana dependentes de
cálcio, ovomorulina, também conhecida como E-caderina. Quando a adesão mediada pela
E-caderina ocorre, todos os blastômeros têm a superfície coberta com microvilos voltados
para o exterior e a superfície mais lisa voltada para o centro do embrião. Subsequentemente
às adesões mediadas pela E-caderina, junções oclusivas desenvolvem-se entre as células
externas, definindo claramente os domínios de membrana plasmática apical e basolateral.
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Assim, as células exteriores tornam-se polarizadas e epiteliais. Mais tarde, bombas de Na+,
K+ são estabelecidas na região basolateral do trofectoderma para conduzir a formação da
blastocele durante a blastulação.
Leituras adicionais
Betteridge K.J. Equine embryology: An inventory of unanswered questions. Theriogenology. 2007;68S:S9–S21.
Betteridge K.J., Fléchon J.–E. The anatomy and physiology of pre-attachment bovine embryos.
Theriogenology. 1988;29:155–187.
Degrelle A.A., Campion E., Cabau C., Piumi F., Reinaud P., Richard C., Renard J.–P., Hue I. Molecular
evidence for a critical period in mural trophoblast development in bovine blastocysts. Dev. Biol.
2005;288:448–460.
Denker H.–W., Eng L.A., Mootz U., Hammer C.E. Studies on the early development and implantation in the
cat. I. Cleavage and blastocyst formation. Anatomischer Anzeiger. 1978;144:457–468.
Heuser, C.H. and Streeter, G.L. (1927): Early stages in the development of pig embryos, from the period of
initial cleavage to the time of the appearance of limb-buds. Contributions to Embryology, 20, Carnegie
Institution of Washington, Publication number 109:1-19.
Holst P.A., Phemister R.D. The prenatal development of the dog: preimplantation events. Biol. Reprod.
1971;5:194–206.
Hunter R.H.F. Chronological and cytological details of fertilization and early embryonic development in the
domestic pig, Sus scrofa. Anat. Rec. 1974;178:169–186.
Maddox-Hyttel P, Bjerregaard B., Laurincik J. Meiosis and embryo technology: renaissance of the nucleolus.
Reprod. Fertil. Dev. 2005;17:3–14.
Patten B.M. Embryology of the pig, edn. New York: Blakiston; 1948.
Reynaud K., Fontbonne A., Marseloo N., Viaris de Lesegno C., Saint-Dizier M., Chastant-Maillard S. In vivo
canine oocyte maturation, fertilization and early embryogenesis: a review. Theriogenology. 2006;66:1685–
1693.
Rüsse I., Sinowatz F. Lehrbuch der Embryologie der Haustiere, 2nd edn. Berlin: Parey Buchverlag; 1998.
Schier A.F. The maternal-zygotic transition: death and birth of RNAs. Science. 2007;316:406–407.
Sharp D.C. The early fetal life of the equine conceptus. Anim. Reprod. Sci. 2000;60–61:679–689.
Stroband H.W.J., van der Lende T. Embryonic and uterine development during early pregnancy in pigs. J.
Reprod. Fert. Suppl. 1990;40:261–277.
Vejlsted M., Du Y., Vajta G., Maddox-Hyttel P. Post-hatching development of the porcine and bovine embryo
– defi ning criteria for expected development in vivo and in vitro. Theriogenology. 2006;65:153–165.
Watson A.J. Trophectoderm differentiation in the bovine embryo: characterization of a polarized epithelium.
J. Reprod. Fert. 1998;114:327–339.
Watson A.J., Barcroft L. Regulation of blastocyst formation. Frontiers in Bioscience. 2001;6:D708–730.
128