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DANIELA MARIANO JULIANY BARRETO KISBERI KAREN RODRIGUES FERREIRA MARIA JÚLIA DA SILVEIRA ALVES MOREIRA RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA 1: ESPECTROFOTOMETRIA SÃO PAULO 2020 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO EPM – ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DANIELA MARIANO JULIANY BARRETO KISBERI KAREN RODRIGUES FERREIRA MARIA JÚLIA DA SILVEIRA ALVES MOREIRA RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA 1: ESPECTROFOTOMETRIA Relatório da aula prática 1 – Espectrofotometria Universidade Federal de São Paulo Disciplina: Química Orgânica Biomedicina – turma 54 Professores: Aparecida Sadae Tanaka, Alexandre Keiji Tashima, Patricia Alessandra Bersanetti SÃO PAULO 2020 SUMÁRIO OBJETIVO................................................................................................................................ 4 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 4 PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................................... 5 METODOLOGIA ................................................................................................................... 5 MATERIAIS UTILIZADOS .................................................................................................. 5 PROCEDIMENTO ................................................................................................................. 5 DADOS OBTIDOS ................................................................................................................... 6 DISCUSSÃO DE DADOS ...................................................................................................... 10 CONCLUSÃO ......................................................................................................................... 11 ANEXO .................................................................................................................................... 12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 13 4 OBJETIVO Quantificar a concentração da amostra desconhecida e das soluções diluídas de azul de bromo- fenol por meio do espectrofotômetro de UV-Vis; determinar o máximo de absorção da solução de violeta de azul de bromofenol; verificar e consolidar os conceitos do princípio da lei de Lambert-Beer e da diluição. INTRODUÇÃO O sal de sódio do azul de bromofenol (3′,3′′,5′,5′′ - tetrabromofenolsulfonftaleína de sódio), de especificação Sigma-Aldrich e código B5525, é um corante de pH acima de 4,6; atua como indicador de pH que vira entre o pH 3,0 e 4,6 de amarelo-azul para violeta, respectivamente. Esse composto permite a visualização da corrida eletroforética de fragmentos de DNA ou proteínas, para monitorar a migração de moléculas em eletroforese em gel de algum reagente de alta densidade (como sacarose ou glicerol), uma vez que ele que migra com mais facilidade indicando a localização da frente da eletroforese. Esse corante facilita a aplicação da amostra no gel (acrescentam cor na amostra) e auxiliam no monitoramento da corrida, já que apresentam velocidade conhecida durante a migração na matriz em direção ao pólo positivo. A espectroscopia é o estudo da interação entre a matéria e a radiação eletromagnética — energia radiante que apresenta tanto as propriedades de partículas quanto as de ondas. Um grande número de diferentes técnicas espectrofotométricas é utilizado para identificar substâncias. A espectroscopia no UV/Vis fornece informação sobre as substâncias com ligações duplas conjugadas, as quais são presentes na ligação entre enxofre e oxigênio (S=O) e carbono e oxigênio (C=O), além dos anéis aromáticos do sal de sódio do azul de bromofenol. A luz ultravioleta e a luz visível possuem apenas energia suficiente para provocar uma transição eletrônica — a promoção de um elétron de um orbital para outro de maior energia. Dependendo da energia necessária para a transição eletrônica, a molécula absorverá a luz ultravioleta ou a luz visível. Se ela absorve a luz ultravioleta, um espectro de UV é obtido; se ela absorve luz visível, um espectro visível é obtido. A luz ultravioleta é a radiação eletromagnética com comprimentos de onda entre 180 e 400 nm (nanômetros); a luz visível possui comprimentos de onda entre 400 e 780 nm. A análise espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis, usando reagentes cromogênicos, como o sal de sódio do azul de bromofenol, é tradicionalmente realizada utilizando-se um reagente específico (DNA ou proteínas), separando-se o elemento de interesse de seus interferentes. O aparelho espectrofotômetro UV-Vis determina a absorbância da amostra: sal de sódio do azul de bromofenol. Neste experimento, tal dado tem o intuito de ser utilizado para identificação e determinação quantitativa do sal por meio de uma curva entre concentração (mol/L) e absorbância, a qual também gera a estimação da absorvidade molar (uma propriedade intrínseca das substâncias, como o sal de sódio do azul de bromofenol). Usa-se o princípio da lei de Lambert-Beer fundamentando-se no resultado da absorvidade de cada das soluções de diluição 5 seriada a partir de uma concentração conhecida (10,0 mM) para calcular a concentração molar do sal. PARTE EXPERIMENTAL 1. METODOLOGIA Espectrofotometria. 2. MATERIAIS UTILIZADOS ▪ Azul de bromofenol (na forma de sal de sódio) – concentração de 10 mM; ▪ Balança analítica; ▪ Micropipetas automáticas; ▪ Cubetas de plástico; ▪ Agitador vortex; ▪ Água ultrapura; ▪ Espectrofotômetro. 3. PROCEDIMENTO Antes de dar início ao experimento, é necessário zerar a balança com o tubo que será utilizado na pesagem e somente em seguida pesar o azul de bromofenol na balança analítica. Após tal pesagem, conclui-se que a amostra tem um peso equivalente a 0,0107 g de azul de bromofenol. Para obter uma amostra de 10 mM, utiliza-se uma micropipeta, para coletar 1 mL de azul de bromofenol - a pipetagem é feita em duas etapas, primeiro a quantidade desejada é pipetada e em seguida a gota em excesso é dispensada -, para isso só a ponta deve entrar em contato com o líquido, enquanto o êmbolo é elevado vagarosamente. Em seguida, é adicionada ao conteúdo pipetado água até atingir a concentração de 10 mM desejada - solução padrão. O tubo com a solução é então levado ao vortex para ser agitado e misturar-se. Em prol de obter uma solução de 200 M, a amostra é diluída 50 vezes e é novamente levada para o vortex. Essa solução obtida será utilizada para obter outras 6 soluções, de 20 M, 15 M, 10 M, 5 M, 2,5 M e X M (concentração desconhecida, a ser calculada no decorrer do relatório). As soluções diluídas são então levadas para o espectrofotômetro - em cubetas de plástico - , que fará a medição das respectivas absorbâncias, nesse processo é utilizada uma cubeta com água - solução referência ou “branco” - e uma cubeta com a solução que deseja saber a absorbância, que serão colocadas em diferentes compartimentos do espectrofotômetro. 6 Por fim, é utilizado um scanner de comprimento de ondas, para estabelecer um gráfico da absorbância do azul de bromofenol em função do comprimento de onda desse e suas melhores faixas de absorção e reflexão. DADOS OBTIDOS Cálculo da concentração da solução X: I. A partir dos dados fornecidos na aula prática acerca da absorbância da solução de água e de soluções de diferentes concentrações de azul de bromofenol (2,5 M, 5,0 M, 10 M, 15 M e 20 M), foi possível obter um gráfico de absorbância em função daconcentração (Gráfico 1) . Esse gráfico tem uma linha de tendência equivalente à uma reta, levando à conclusão que a equação aproximada de absorbância por concentração é A = 0,0614 c - 0,0042 – onde A é absorbância e c equivale à concentração da amostra, em M; Gráfico 1: absorbância da solução de azul de bromofenol em função de sua concentração Fonte: acervo pessoal 0 0,117 0,322 0,627 0,922 1,211 A = 0,0614c - 0,0042 R² = 0,9983 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 5 10 15 20 25 A B SO R B Â N C IA CONCENTRAÇÃO (M) 7 II. Sabendo que a absorbância da amostra X vale 0,779, temos que: 0,779 = 0,0614 c – 0,0042 c = 12,756 M Cálculo do volume de água a ser adicionada na amostra de 1 mL de bromofenol puro, para formar uma solução de 10 mM: 0,0107 g --- x mol azul de bromofenol 691,94 g --- 1 mol azul de bromofenol x = 1,546.10-5 mol 10.10−3 mol --- 1 L solução 1,546.10-5 mol --- V L de solução V = 1,546 mL Vágua = V – Vbromofenol puro Vágua = 546 L Cálculo do volume da solução de 10 mM necessário para fazer uma solução de 200 M de azul de bromofenol: 10 mM F = 200M F = 50 VSI = VSF F = 1,5 mL 50 VSI= 30 L VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 30 L + VÁGUA VÁGUA = 1,47 mL Cálculo do volume da solução de 200 M de azul de bromofenol necessário para fazer uma solução de 20 M de azul de bromofenol: 200 M F = 20M F = 10 VSI = VSF F = 1,5 mL 10 VSI= 150 L VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 150 L + VÁGUA VÁGUA = 1,35 mL 8 Cálculo do volume da solução de 200 M de azul de bromofenol necessário para fazer uma solução de 15 M de azul de bromofenol: 200 M F = 15M F = 40 3 VSI = VSF F = 1,5 mL 40 3⁄ VSI= 112,5 L VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 112,5 L + VÁGUA VÁGUA = 1,387 mL Cálculo do volume da solução de 200 M de azul de bromofenol necessário para fazer uma solução de 10 M de azul de bromofenol: 200 M F = 10M F = 20 VSI = VSF F = 1,5 mL 20 VSI= 75 L VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 75 L + VÁGUA VÁGUA = 1,425 mL Cálculo do volume da solução de 200 M de azul de bromofenol necessário para fazer uma solução de 5 M de azul de bromofenol: 200 M F = 5M F = 40 VSI = VSF F = 1,5 mL 40 VSI= 37,5 L VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 37,5 L + VÁGUA VÁGUA = 1,462 mL 9 Cálculo do volume da solução de 200 M de azul de bromofenol necessário para fazer uma solução de 2,5 M de azul de bromofenol: 200 M F = 2,5M F = 80 VSI = VSF F = 1,5 mL 80 VSI= 18,75 L VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 18,75 L + VÁGUA VÁGUA = 1,481 mL Cálculo do volume da solução de 200 M de azul de bromofenol necessário para fazer uma solução de 12,756 M de azul de bromofenol: 200 M F = 12,756M F = 15,679 VSI = VSF F = 1,5 mL 15,679 VSI= 95,67 L VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 95,67 L + VÁGUA VÁGUA = 1,404 mL OBSERVAÇÃO: ▪ F: fator de diluição; ▪ VSF: volume da solução final; ▪ VSI: volume necessário da solução inicial; ▪ VÁGUA: volume de água que deve ser adicionado. Obtenção do gráfico de absorbância em função do comprimento de onda do azul de bromofenol, que seria obtido em uma experimentação presencial e que faz parte dos objetivos do relatório da aula prática – maior absorbância para comprimentos de onda de 590 nm, melhor absorção do amarelo e reflexão da faixa do violeta e azul: 10 Gráfico 2: varredura de comprimento de onda (Wavelength scan) COMPRIMENTO DE ONDA (nm) Fonte: Online Lab DISCUSSÃO DOS DADOS O 3′,3′′,5′,5′′ - tetrabromofenolsulfonftaleína de sódio pode ser utilizado no experimento, pois as características do anel aromático do composto (figura 1) possibilitam o efeito de absorção de radiação eletromagnética da faixa do visível - emitida pelo equipamento espectrofotômetro -, graças aos orbitais p da ligação dupla conjugada. Nesse contexto, os elétrons transitam do orbital de menor energia (ligação π) para o de maior energia (ligação π não ligante). Partindo de uma solução padrão de 10 mM - solução padrão, ou seja, uma solução de concentração conhecida e muito utilizada para análises volumétricas -, obtida a partir de 1 mL de azul de bromofenol puro e 546 L de água (o cálculo do volume de água foi estabelecido por duas regras de três sequenciais), foi feita a diluição para chegar à concentração de 200 M e, a partir dessa, é realizada a diluição seriada para chegar nas soluções de concentração: 20 μM, 15 μM, 10μM, 5 μM, 2,5 μM e a solução X (c=12,756 M – concentração encontrada por meio da equação da linha de tendência do gráfico 1, montado com base nos dados fornecidos na aula prática). A diluição seriada é um importante método pois permite fazer diversas diluições usando uma pequena quantidade de água quando comparada a uma diluição direta que usaria uma quantidade muito maior e obter soluções extremamente diluídas com muita precisão. Para descobrir o volume necessário de água para se obter tais concentrações foi encontrado o fator de diluição (F), referente à cada solução desejada, e, por meio desse, calculou-se quanto da solução de concentração 200 M e quanto de água seriam necessárias para formar soluções de 1,5 mL das concentrações supracitadas - para isso foi usada a fórmula Vsf/Vsi = F. Em tal equipamento fotométrico, além das cubetas de plástico contendo a amostra diluída, também é adicionado em outro compartimento uma solução referente (ou “branco”) de água destilada, pois é essencial para a construção gráfica da absorbância vs concentração utilizando A B S O R B Â N C IA 11 a os princípios da lei de Lambert-Beer, uma vez que essa referência demonstra a comprovação entre uma solução com ou sem a amostra. Ao traçar a linha de tendência no gráfico (Gráfico 1) e calcular a equação da reta e o seu coeficiente de determinação resultando desse princípio, descobrimos que o coeficiente de determinação (R2) foi próximo de 1, isso demonstra que o experimento teve uma boa aproximação, sem grandes desvios, como esperado. Devido às propriedades físico-químicas do corante analisado, nessa prática também foi estabelecida a relação entre a absorbância em decorrência do comprimento de onda do azul de bromofenol (Gráfico 2), que mostrou-se máxima para 590 nm (coloração amarelada), e transmitância de 450 nm (coloração azulada). CONCLUSÃO Utilizando o espectrofotômetro foi possível determinar que a absorbância da solução AB-X é igual a 0,779 e, a partir da equação resultante do gráfico de absorbância pela concentração (Gráfio 1), gerado com base nos dados fornecidos durante a prática, foi possível determinar que a concentração dessa da amostra do sal de sódio do azul de bromofenol é igual a 12,756 M. A partir dos valores obtidos da diluição seriada, do espectrofotômetro e da construção do gráfico com os resultados pode-se concluir que o objetivo do experimento foi alcançado, pois foi possível calcular a concentração da amostra AB-X, o volume necessário de água necessáriopara formar uma solução padrão de 10 mM a partir de 1 mL de azul de bromofenol puro, os volumes empregados para resultar em uma solução de 200 M a partir da solução padrão de 10 mM e quantidade volumétricas precisas para originar soluções de 20 M, 15 M, 12,756 M, 10 M, 5 M e 2,5 M, tendo como base a solução de 200 M. Ao analisar os dados fornecidos em conjunto com os dados obtidos, pode-se concluir que conforme a concentração da solução de azul de bromofenol aumenta maior é a absorbância, o que mostra que a Lei de Lambert-Beer é válida na prática. Além do que já foi apontado, tal experimento ainda mostrou que a absorbância máxima do azul de bromofenol se dá quando seu comprimento de onda é 590 nm (Gráfico 2). 12 ANEXO Figura 1: composição molecular do azul de bromofenol (sal de sódio) Fonte: MERCK 13 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS • CORRÊA, E. A ANÁLISE DE DNA POR ELETROFORESE. Disponível em:<http://www.ciencianews.com.br/index.php/ciencia/biologia-molecular/biologia- molecular-tecnicas-moleculares/>. Acesso em 15 de agosto de 2020 às 17h51min; • Sigma-Aldrich. FICHA DE DADOS DE SEGURANÇA. Disponível em:<https://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=B R&language=pt&productNumber=B5525&brand=SIGMA&PageToGoToURL=https %3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fsearch%3Fterm%3Dbromophe nol%2Bblue%26interface%3DAll%26N%3D0%26mode%3Dpartialmax%26lang%3D pt%26region%3DBR%26focus%3Dproduct>. Acesso em 15 de agosto de 2020 às 18h43min; • MERCK. Bromophenol Blue sodium salt. Disponível em:<https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/114405?lang=pt®ion=BR >. Acesso em 15 de agosto de 2020 às 19h39min; • SALDANHA, T. Análise multicomponente simultânea por espectrofotometria de absorção molecular UV-VIS. Disponível em:<https://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100- 40421999000600012&script=sci_arttext&tlng=pt>. Acesso em 15 de agosto de 2020 às 18h52min; ▪ BRUICE, P. Química Orgânica - 4ª Edição - Volume 1. Disponível em:<https://docero.com.br/doc/10s05>. Acesso em 15 de agosto de 2020 às 19h01min; ▪ ONLINE LAB. The Fading of Bromophenol Blue. Disponível em: <https://sites.google.com/a/wellesley.edu/chem-105-online-lab-manual/labs/12-the- fading-of-bromophenol-blue>. Acesso em 24 de agosto de 2020 às 12h59min. http://www.ciencianews.com.br/index.php/ciencia/biologia-molecular/biologia-molecular-tecnicas-moleculares/ http://www.ciencianews.com.br/index.php/ciencia/biologia-molecular/biologia-molecular-tecnicas-moleculares/ https://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=BR&language=pt&productNumber=B5525&brand=SIGMA&PageToGoToURL=https%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fsearch%3Fterm%3Dbromophenol%2Bblue%26interface%3DAll%26N%3D0%26mode%3Dpartialmax%26lang%3Dpt%26region%3DBR%26focus%3Dproduct https://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=BR&language=pt&productNumber=B5525&brand=SIGMA&PageToGoToURL=https%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fsearch%3Fterm%3Dbromophenol%2Bblue%26interface%3DAll%26N%3D0%26mode%3Dpartialmax%26lang%3Dpt%26region%3DBR%26focus%3Dproduct https://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=BR&language=pt&productNumber=B5525&brand=SIGMA&PageToGoToURL=https%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fsearch%3Fterm%3Dbromophenol%2Bblue%26interface%3DAll%26N%3D0%26mode%3Dpartialmax%26lang%3Dpt%26region%3DBR%26focus%3Dproduct https://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=BR&language=pt&productNumber=B5525&brand=SIGMA&PageToGoToURL=https%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fsearch%3Fterm%3Dbromophenol%2Bblue%26interface%3DAll%26N%3D0%26mode%3Dpartialmax%26lang%3Dpt%26region%3DBR%26focus%3Dproduct https://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=BR&language=pt&productNumber=B5525&brand=SIGMA&PageToGoToURL=https%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fsearch%3Fterm%3Dbromophenol%2Bblue%26interface%3DAll%26N%3D0%26mode%3Dpartialmax%26lang%3Dpt%26region%3DBR%26focus%3Dproduct https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/114405?lang=pt®ion=BR https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/114405?lang=pt®ion=BR https://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40421999000600012&script=sci_arttext&tlng=pt https://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40421999000600012&script=sci_arttext&tlng=pt https://docero.com.br/doc/10s05 https://sites.google.com/a/wellesley.edu/chem-105-online-lab-manual/labs/12-the-fading-of-bromophenol-blue https://sites.google.com/a/wellesley.edu/chem-105-online-lab-manual/labs/12-the-fading-of-bromophenol-blue
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