Análise de Sequências em Banco de Dados

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Renata Marques

07/10/2020

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Bioinformática

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1 
 
 
Universidade Federal de Goiás 
Instituto de Ciências Biológicas 
Curso de Biomedicina 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aula de Análise de Sequências em Banco de Dados 
Oligonucleotídeos 
 
 
 
 
Discente: 
Renata Marques De Souza 
 
 
 
 
 
 
 
 
Goiânia 
2019 
2 
 
Renata Marques De Souza 
 
 
 
 
 
 
 
Aula de Análise de Sequências em Banco de Dados 
Oligonucleotídeos 
 
 
 
 
 
 
 
Relatório requerido pela disciplina de Bioinformática 
Ministrada pelo Professor Drª Vanessa Rafaela Milhomem Cruz Leite 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Goiânia 
2019
3 
 
Sumário 
1 Introdução……………………........………………………………..04 
2 Objetivo.............................……………………….........................04 
3 Procedimentos e Resultados....................................................05 
4 Conclusão........…………............................................................17 
5 Referências bibliográficas…...……….......................................17 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
1 Introdução 
A reação de PCR é uma técnica de amplificação enzimática de 
sequências específicas de DNA. Por meio desta, consegue-se a replicação de 
milhões de cópias de um fragmento alvo, baseando-se na capacidade de 
duplicação do ácido. As tecnologias de amplificação são capazes de, 
simultaneamente, identificar um patógeno e fornecer réplicas da sequência alvo 
(SILVA-PEREIRA,2003). 
Para a amplificação, requer-se um conhecimento prévio da sequência 
alvo ou, pelo menos, parte dela, pois dois oligonucleotídeos (primers) são 
utilizados para definir de forma específica o fragmento a ser amplificado, em uma 
reação com repetitivos ciclos de temperatura previamente definidos, na presença 
de bases nitrogenadas e da enzima Taq DNA polimerase (SILVA-PEREIRA, 
2003). 
A região do DNA genômico a ser amplificada é definida pelos 
oligonucleotídeos sintéticos (primers), que funcionam como os iniciadores da 
reação de polimerização, se anelando especificamente às suas sequências 
complementares na fita molde, delimitando o fragmento de DNA que se deseja 
amplificar. 
O procedimento de PCR envolve três etapas, cada uma repetida muitas 
vezes, são elas: 
1 – DESNATURAÇÃO 
O DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado 
por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. A dupla fita é aberta 
(desnaturada), tornando-se uma fita única. 
2 – ANELAMENTO OU HIBRIDIZAÇÃO 
Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma fita de 
DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta 
da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar à 
sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à 
sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que 
se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C. 
3 – EXTENSÃO OU POLIMERIZAÇÃO 
Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases 
complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a 
duplicação da fita de DNA. Esse processo acontece a uma temperatura de 72°C. 
2 Objetivo 
Construção de primers, utilizando os programas já ministrado em aulas 
anteriores e aprendizagem referente utilização de novas ferramentas. 
 
5 
 
3 Procedimentos e Resultados 
 1º Passo escolher dois arquivos de sequência no NCBI, citados no roteiro 
e formatar o arquivo em fasta, e uma sequência conforme nossa escolha. 
 
Leptospira interrogans strain RZ11 LipL32 gene, partial cds 
>AF181553.1 Leptospira interrogans strain RZ11 LipL32 gene, partial 
cds 
TCCTAACTAAGGAGAGTCTATGAAAAAACTTTCGATTTTGGCTATCTCCGTTGCACTCTTTGCAAGCATT 
ACCGCTTGTGGTGCTTTCGGTGGTCTGCCAAGCCTAAAAAGCTCTTTTGTTCTGAGCGAGGACACAATCC 
CAGGGACAAACGAAACCGTAAAAACGTTACTTCCCTACGGATCTGTGATCAACTATTACGGATACGTAAA 
GCCAGGACAAGCGCCGGACGGTTTAGTCGATGGAAACAAAAAAGCATACTATCTCTATGTTTGGATTCCT 
GCCGTAATCGCTGAAATGGGAGTTCGTATGATTTCCCCAACAGGCGAAATCGGTGAACCAGGCGACGGAG 
ACTTAGTAAGCGACGCTTTCAAAGCGGCTACCCCAGAAGAAAAATCAATGCCACATTGGTTTGATACTTG 
GATCCGTGTAGAAAGAATGTCGGCGATTATGCCTGACCAAATCGTCAAAGCTGCGAAAGCAAAACCAGTT 
CAAAAATTGGACGATGATGATGATGGTGACGATACTTATAAAGAAGAGAGACACAACAAGTACAACTCTC 
TTACTAGAATCAAGATCCCTAATCCTCCAAAATCTTTTGACGATCTGAAAAACATCGACACTAAAAAACT 
TTTAGTAAGAGGTCTTTACAGAATTTCTTTCACTACCTACAAACCAGGTGAAGTGAAAGGATCTTTCGTT 
GCATCTGTTGGTCTGCTTTTCCCACCAGGTATTCCAGGTGTGAGCCCGCTGATCCACTCAAATCCTGAAG 
AATTGCAAAAACAAGCTATCGCTGCTGAAGAGTCTTTGAAAAAAGCTGC 
 
Homo sapiens chorionic gonadotropin, beta polypeptide 5, mRNA (cDNA clone 
MGC:59699 IMAGE:3956670), complete cds 
>BC051378.1 Homo sapiens chorionic gonadotropin, beta polypeptide 5, 
mRNA (cDNA clone MGC:59699 IMAGE:3956670), complete cds 
CAGGACCCCACCATAGGCAGAGGCAGGCCTTCCTACACCCTACTCCCTGTGCCTCCAGGCTCGACTAGTC 
CCTAGCACTCGACGACTGAGTCTCTGAGATCACTTCACCGTGGTCTCCGCCTCACCCTTGGCGCTGGACC 
AGTGAGAGGAGAGGGCTGGGGCGCTCCGCTGAGCCACTCCTGCGCCCCCCTGGCCTTGTCTACCTCTTGC 
CCCCCGAAGGGTTAGTGTCGAGCTCACCCCAGCATCCTACAACCTCCTGGTGGCCTTGCCGCCCCCACAA 
CCCCGAGGTATAAAGCCAGGTACACGAGGCAGGGGACGCACCAAGGATGGAGATGTTCCAGGGGCTGCTG 
CTGTTGCTGCTGCTGAGCATGGGCGGGACATGGGCATCCAAGGAGCCGCTTCGGCCACGGTGCCGCCCCA 
TCAATGCCACCCTGGCTGTGGAGAAGGAGGGCTGCCCCGTGTGCATCACCGTCAACACCACCATCTGTGC 
CGGCTACTGCCCCACCATGACCCGCGTGCTGCAGGGGGTCCTGCCGGCCCTGCCTCAGGTGGTGTGCAAC 
TACCGCGATGTGCGCTTCGAGTCCATCCGGCTCCCTGGCTGCCCGCGCGGCGTGAACCCCGTGGTCTCCT 
ACGCCGTGGCTCTCAGCTGTCAATGTGCACTCTGCCGCCGCAGCACCACTGACTGCGGGGGTCCCAAGGA 
CCACCCCTTGACCTGTGATGACCCCCGCTTCCAGGACTCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTT 
CCAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAATAAAGGCTTCTCAATCCGC 
AAAAAAAAAAAAAAAAAA 
 
GCG – glucagon 
>NM_002054.5 Homo sapiens glucagon (GCG), mRNA 
ACAGAGCTTAGGACACAGAGCACATCAAAAGTTCCCAAAGAGGGCTTGCTCTCTCTTCACCTGCTCTGTT 
CTACAGCACACTACCAGAAGACAGCAGAAATGAAAAGCATTTACTTTGTGGCTGGATTATTTGTAATGCT 
GGTACAAGGCAGCTGGCAACGTTCCCTTCAAGACACAGAGGAGAAATCCAGATCATTCTCAGCTTCCCAG 
GCAGACCCACTCAGTGATCCTGATCAGATGAACGAGGACAAGCGCCATTCACAGGGCACATTCACCAGTG 
ACTACAGCAAGTATCTGGACTCCAGGCGTGCCCAAGATTTTGTGCAGTGGTTGATGAATACCAAGAGGAA 
CAGGAATAACATTGCCAAACGTCACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTA 
AGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGGCCGAGGAAGGCGAG 
ATTTCCCAGAAGAGGTCGCCATTGTTGAAGAACTTGGCCGCAGACATGCTGATGGTTCTTTCTCTGATGA 
GATGAACACCATTCTTGATAATCTTGCCGCCAGGGACTTTATAAACTGGTTGATTCAGACCAAAATCACT 
GACAGGAAATAACTATATCACTATTCAAGATCATCTTCACAACATCACCTGCTAGCCACGTGGGATGTTT 
GAAATGTTAAGTCCTGTAAATTTAAGAGGTGTATTCTGAGGCCACATTGCTTTGCATGCCAATAAATAAA 
TTTTCTTTTAGTGTTGTGTAGCCAAAAATTACAAATGGAATAAAGTTTTATCAAAATATTGCTAAAATAT 
CAGCTTTAAAATATGAAAGTGCTAGATTCTGTTATTTTCTTCTTATTTTGGATGAAGTACCCCAACCTGT 
TTACATTTAGCGATAAAATTATTTTTCTATGATATAATTTGTAAATGTAAATTATTCCGATCTGACATAT 
CTGCATTATAATAATAGGAGAATAGAAGAACTGGTAGCCACAGTGGTGAAATTGGAAAGAGAACTTTCTT 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BC051378.1/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BC051378.1/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2641
6 
 
CCTGAAACCTTTGTCTTAAAAATACTCAGCTTTCAATGTATCAAAGATACAATTAAATAAAATTTTCAAG 
CTTC 
 
2º passo desenhar 2 opções de oligonucleotídeos para cada gene selecionado: 
 Leptospira interrogans strain RZ11 LipL32 gene, partial cds 
 
Figura 1: sequencia AF181553.1 
 
 
Figura 2 construção do prime no sistema IDA 
 
7 
 
 
FIGURA 3; Avaliação da formação Harpin de sequencias GCTATCTCCGTTGCACTCTT 
(Sense) 
 
 
 
8 
 
 
FIGURA 4; Avaliação da formação Harpin de sequencias GACCAACAGATGCAACGAAAG 
(AntiSense) 
 
 
 
 
O delta G é calculado levando-se em conta o maior trecho de bases 
complementares. Esses pares de bases complementares são representados por 
uma linha sólida. Linhas pontilhadas representam bases complementares 
adicionais para essa estrutura de dímeros, mas sua presença não afeta os 
valores calculados de delta G. Os valores reais de delta G podem variar com 
base na presença de bases complementares adicionais. O valor de Delta 
Máximo G refere-se à energia livre da sequência dooligo que se liga ao seu 
complemento perfeito. 
Fragmentos que flanqueam toda a sequência (primer sense e primer antisense): 
9 
 
Primer Sense 
 
 
Primer antisense 
 
Conforme avaliação a Tm precisa estar entre 55 C° a 65C° não podendo 
estar maior que essa temperatura , e não possuir quantidade de G e C maior 
que 50% sendo assim este é considerado um bom Primer. 
 
 Homo sapiens chorionic gonadotropin, beta polypeptide 5, 
mRNA (cDNA clone MGC:59699 IMAGE:3956670), complete cds 
 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BC051378.1/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BC051378.1/
10 
 
 
Figura 1: sequencia BC051378.1 
 
 
 
 
 
 
11 
 
 
Figura 2 construção do prime no sistema IDA 
 
 
FIGURA 3; Avaliação da formação Harpin de sequencias CGAGGTATAAAGCCAGGTACAC 
(Sense) 
 
 
 
 
 
12 
 
 
FIGURA 4; Avaliação da formação Harpin de sequencias GCGGATTGAGAAGCCTTTATTG 
(AntiSense) 
 
 
Ele hibridiza e se liga nele mesmo, formação de estrutura entre eles. Quando o 
valor delta G é negativo, reação espontânea. Uma reação exergônica. 
Fragmentos que flanqueam toda a sequência (primer sense e primer antisense): 
 
 
 
13 
 
Primer sense 
 
Primer antisense 
 
Conforme avaliação a Tm precisa estar entre 55 C° a 65C° não podendo 
estar maior que essa temperatura , e não possuir quantidade de G e C maior 
que 50% sendo assim este é considerado um bom Primer. 
 
 GCG – glucagon 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2641
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Figura 1: sequencia NM_002054.5 
 
 
 
Figura 2 construção do prime no sistema IDA 
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FIGURA 3; Avaliação da formação Harpin de sequencias CTCTTCACCTGCTCTGTTCTAC 
(Sense) 
 
 
FIGURA 4; Avaliação da formação Harpin de sequencias TGTGGCTACCAGTTCTTCTATTC 
(AntiSense). 
 
 
 
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Fragmentos que flanqueam toda a sequência (primer sense e primer antisense): 
 
Primer sense 
 
 
Primer antisense 
 
17 
 
Conforme avaliação a Tm precisa estar entre 55 C° a 65C° não podendo 
estar maior que essa temperatura , e não possuir quantidade de G e C maior 
que 50% sendo assim este é considerado um bom Primer. 
4 Conclusão 
Concluímos que a construção de um par de primers para reação espécie 
específica e outro para a amplificação gênero-específica. Onde este 
procedimento é simples e fácil utilizando os programas corretos, seu acesso é 
gratuito. A análise pelo BLASTn (basic local alignment search tool nucleotide – 
GenBank) indicou a especificidade para cada primer, podemos também avaliar 
a formação de substruturas como por exemplo: Helix Hairpin loop, Bulge Loop, 
Interior loop, Multi Branched Loop. 
 
5 Referências bibliográficas 
Acesso ao NCBI pelo site: (www.ncbi.nlm.nih.gov) realizado em 4 de Junho de 
2019. 
Acesso ao Bioinformatics (http://www.bioinformatics.nl/cgi 
bin/primer3plus/primer3plus.cgi), realizado em 4 de Junho de 2019. 
Acesso ao IDTDNA ( https://www.idtdna.com/calc/analyzer) realizado em 4 de 
Junho de 2019. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.bioinformatics.nl/cgi