Técnicas Básicas de Biologia Molecular - exames genéticos

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TÉCNICAS BÁSICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 
CONCEITOS BÁSICOS 
 
• Interação Genótipo (único) x Fenótipo (pode sofrer de variação) 
• DNA é uma molécula susceptível a alterações, está em contínua modificação, as quais podem ou não 
levar a alterações fenotípicas. 
• Classificação dos distúrbios genéticos: 
1. Distúrbios Monogênicos 
2. Distúrbios Cromossômicos 
3. Distúrbios Multifatoriais 
 
• Sintomas x Variantes Gênicos relevantes 
MUTAÇÕES 
 
 
 
 
 
 
 
EXAMES GENÉTICOS 
VIDA ÚTIL DE UM EXAME GENÉTICO: 
1. Avaliação clínica acurada 
2. Amostra do paciente 
3. TCLE preenchido 
4. Técnicas moleculares 
5. Análise dos dados 
6. Classificação da variante 
A INTERPRETAÇÃO DO SIGNIFICADO DA VARIANTE DEVE SER CRITERIOSA, POIS: 
1. Passará pela interpretação do médico solicitante; 
2. Passará pela interpretação do paciente; 
3. Pode interferir na vida/conduta do paciente; 
4. Pode interferir na vida/conduta de familiares do paciente; 
5. Pode interferir no tratamento/profilaxia do paciente. 
• Antes de solicitar um novo exame genético, leve em consideração o conhecimento acerca da variante 
em questão. 
 
• Após solicitação do exame genético dever ser feito: 
1. Extração de DNA e RNA 
2. Metodologia/Técnica escolhida (direto ou indireto) 
3. Interpretação dos resultados 
EXTRAÇÃO DO DNA 
• DNA – molécula altamente estável 
• Fontes de DNA: sangue periférico, sêmen, saliva (células da mucosa), cabelo, tecidos de biópsias, 
tecidos mumificados, ossos, dentes, urina, blocos de parafina. 
• Método de coleta: swab bucal, punção venosa, coleta de material forense. 
• Método de extração de DNA: 
1. Proteinase K (10-15 ml) 
2. Solventes orgânicos: fenol e clorofórmio 
3. FTA Card com solução de lise (SDS) 
4. Sais (salting-out) 
• Etapas de extração de DNA: 
1. Ruptura física e química dos componentes celulares (maceração do tecido, alta temperatura e 
SDS) 
2. Desmembramento dos cromossomos dos seus componentes básicos (DNA e proteínas) – 
Proteinase e RNAse 
3. Separação do DNA dos componentes celulares (fenol clorofórmio) 
4. Precipitação alcóolica para isolamento do DNA 
5. Armazenamento do DNA 
Obs: DNA precipitado (>20 anos a -20°C e tempo indete rminado a -80°C) 
6. Análise da qualidade e quantidade do DNA 
Obs: pode ser realizado em: gel de agarose 1% ou poliacrilamida; corado com brometo de etídio ou prata; 
espectrofotometria (razão A260/A280). 
 
 
 
EXTRAÇÃO DE RNA 
• RNA – molécula instável 
• Fontes de RNA: células e tecidos frescos, células 
• Ação de RNAses: 
1. “DEDAses” 
2. Tubos, ponteiras, vidrarias 
3. Água e tampões 
4. Superfícies laboratoriais 
5. RNAses Endógenas 
6. Armazenamento do RNA 
• Etapas da extração do RNA: 
1. Homogeneização de células e tecidos 
2. Dissociação dos complexos núcleo-protéicos 
Obs: é utilizado TRIzol – isotiocianato de guanidina, fenol e clorofórmio 
3. Separação – Fases orgânica e aquosa 
Obs: Fase aquosa – RNA (superior) e Fase orgânica – vermelha (fenol e clorofórmio) DNA e proteína 
(inferior). 
4. Precipitação do RNA com álcool isopropílico 
5. Lavagem do RNA etanol 70% 
6. Dissolver o RNA 
(i) Secar o RNA 
(ii) Água ultra-pura (DNAase e RNAse free) 
(iii) Água DEPC (dietilpirocarbonato) 
(iv) Aquecer a 55-60°C por 10 min 
7. Armazenamento do RNA 
Obs: pode ser utilizado TRIzol- 80°C (1 mês) ou RNA precipitado/etanol 70% (1 semana a 4°C ou 1 ano a -
20°C). 
8. Análise da qualidade e quantidade do RNA 
Obs: pode ser realizado em: gel de agarose 1% ou poliacrilamida; corado com brometo de etídio ou prata; 
espectrofotometria (razão A260/A280). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TÉCNICAS MOLECULARES 
ELETROFORESE 
• Movimentação de moléculas submetidas a um campo elétrico 
• Necessita de um substrato: papel, agarose (DNA e RNA) ou poliacrilamida (DNA e proteínas) 
• Separa ácidos nucléicos por peso molecular 
• Separa proteínas por carga (pl) ou peso molecular 
 
• Análise dos resultados: 
1. Qualidade 
2. Quantidade – padrão de peso molecular 
3. Quantidade – espectrofotômetro (automarizado) 
 
SOUTHERN BLOT 
• Técnica: 
1. Fragmentos de DNA separados em gel de agarose 
2. Transferidos para membrana por ação capilar 
3. DNA é desnaturado antes ou durante a transferência 
4. Sonda radioativa híbrida com DNA na membrana 
 
• Aplicações: 
1. Alteração de um único nucleotídeo – mutação 
2. Detecção de inserções, deleções e rearranjos 
3. Polimorfismos do DNA 
4. Ordenamento de fragmentos de DNA em um mapa físico. 
NORTHERN BLOTTING 
• Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de agarose 
• RNAs devem ser desnaturados 
• Sensibilidade a RNAses 
• Transferência para membrana por ação capilar 
• Sondas de RNA ou DNA para hibridar 
• Úteis em estudo de expressão gênica 
• Estudos em diferentes tecidos 
• Estuda o padrão temporal de expressão de genes durante o crescimento do indivíduo 
 
 
 
 
WESTERN BLOT 
• Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida 
• Separação e caracterização de proteínas 
• Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para desnaturação 
• Transferência para membrana por força elétrica 
• A proteína alvo é identificada por anticorpo monoclonal e policlonal 
• Revelação do sistema com anticorpo secundário fluorescente ou radioativo 
• Informa o tamanho e a quantidade das proteínas 
 
 
 
 
MICROARRAY (CHIP DE DNA OU MICROARRANJOS DE DNA) 
• Southern blotting em lâmina 
• Chips de genes 
• Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídeos 
• Microdisposição de oligo ou sondas 
• Hibridização com mRNA ou cDNA fluorescentes 
• Leitura por scanners 
] 
• Utilização: 
1. Detecção de mutações gênicas e polimorfismos 
2. Detecção de expressão gênica em diferentes tecidos sob condições normais e anormais 
3. Sequenciamento do DNA e genotipagem