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2 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................... 5 2 A MICROBIOLOGIA .......................................................................... 6 3 ASPECTOS HISTÓRICOS DA MICROBIOLOGIA ............................ 7 3.1 História da evolução da Microbiologia ......................................... 7 3.1 Quem foi Robert Hooke? ............................................................. 7 3.2 Quem descobriu os microrganismos? ......................................... 8 3.3 Quem foi Louis Pasteur? ........................................................... 11 3.4 Félix Archimède Pouchet ........................................................... 12 3.5 A Microbiologia como ciência .................................................... 14 4 OS MICROSCÓPIOS....................................................................... 15 4.1 Quanto aumenta um microscópio óptico? ................................. 16 4.2 O limite de resolução ................................................................. 16 4.3 Os diferentes microscópios ópticos ........................................... 16 4.4 Princípios de funcionamento dos microscópios eletrônicos ...... 19 4.5 O microscópio eletrônico de transmissão .................................. 20 4.6 O microscópio eletrônico de varredura ...................................... 23 5 CLASSIFICAÇÃO DOS MICROORGANISMOS .............................. 25 5.1 Os seres vivos ........................................................................... 25 5.2 A célula ...................................................................................... 26 5.3 Citoplasma ................................................................................ 27 5.4 Organelas citoplasmáticas ........................................................ 28 5.1 Classificação dos 5 reinos ......................................................... 30 5.2 Principais características dos grupos de microrganismos ......... 31 6 BACTÉRIAS ..................................................................................... 32 6.1 Morfologia .................................................................................. 32 3 6.2 Estruturas externas da célula bacteriana .................................. 33 6.3 Estruturas internas da célula bacteriana ................................... 36 6.4 Reprodução, nutrição e crescimento das bactérias ................... 37 6.5 Divisão das bactérias ................................................................ 40 7 FUNGOS .......................................................................................... 41 7.1 Características dos fungos em relação às bactérias ................. 42 7.2 Tipos de alimentação dos Fungos ............................................. 43 7.3 Leveduras .................................................................................. 44 7.4 Reprodução, nutrição e crescimento. ........................................ 47 8 VÍRUS .............................................................................................. 50 8.1 Características dos vírus ........................................................... 51 8.2 Estrutura viral ............................................................................ 51 8.3 Classificação morfológica .......................................................... 52 8.4 Multiplicação de bacteriófagos .................................................. 52 9 METABOLISMO E CINÉTICA DOS MICRORGANISMOS .............. 53 9.1 Cinética dos processos fermentativos ....................................... 56 9.2 Crescimento microbiano-tempo de geração .............................. 56 9.3 Métodos para quantificação do crescimento ............................. 56 9.4 Fatores que regulam o crescimento dos microrganismos ......... 57 10 PROVAS BIOQUÍMICAS E CULTURA DE MICRORGANISMOS 57 11 MEIOS DE CULTIVO .................................................................... 60 11.1 Classificação dos meios de cultivo ......................................... 60 12 TÉCNICAS DE SEMEADURA ...................................................... 61 13 RELAÇÃO ENTRE AGENTE X HOSPEDEIRO............................ 62 13.1 Multiplicação nos tecidos do hospedeiro ................................ 62 14 NORMAS EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA ................. 64 4 14.1 Processo de esterilização, desinfecção e preparo do material...........................................................................................................64 15 ETAPAS DE PREPARAÇÃO DO MATERIAL............................... 65 15.1 Lavagem ................................................................................ 65 15.2 Acondicionamento .................................................................. 66 15.3 Esterilização ........................................................................... 66 15.4 Contagem total de microrganismos em placas ...................... 67 16 MICROBIOTA CORPORAL NORMAL .......................................... 67 16.1 Benefícios da microbiota humana .......................................... 69 16.2 Variação da microbiota ao longo da vida ............................... 69 16.3 Fatores que afetam a composição da microbiota humana ..... 71 17 CONSIDERAÇÕES ...................................................................... 72 18 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................. 74 19 BIBLIOGRAFIAS SUGERIDAS .................................................... 77 5 1 INTRODUÇÃO Prezado aluno! O Grupo Educacional FAVENI, esclarece que o material virtual é semelhante ao da sala de aula presencial. Em uma sala de aula, é raro – quase improvável - um aluno se levantar, interromper a exposição, dirigir-se ao professor e fazer uma pergunta , para que seja esclarecida uma dúvida sobre o tema tratado. O comum é que esse aluno faça a pergunta em voz alta para todos ouvirem e todos ouvirão a resposta. No espaço virtual, é a mesma coisa. Não hesite em perguntar, as perguntas poderão ser direcionadas ao protocolo de atendimento que serão respondidas em tempo hábil. Os cursos à distância exigem do aluno tempo e organização. No caso da nossa disciplina é preciso ter um horário destinado à leitura do texto base e à execução das avaliações propostas. A vantagem é que poderá reservar o dia da semana e a hora que lhe convier para isso. A organização é o quesito indispensável, porque há uma sequência a ser seguida e prazos definidos para as atividades. Bons estudos! 6 2 A MICROBIOLOGIA Fonte: cursodefarmacia.net A microbiologia é a ciência que estuda os organismos microscópicos e suas atividades. Preocupa-se com a forma, estrutura, reprodução, fisiologia, metabolismo e identificação dos microrganismos. Assim a microbiologia envolve o estudo de organismos procariotos (bactérias, archaeas) e eucariotos (algas, protozoários, fungos). Esta ciência teve início com o polimento de lentes, feitas a partir de peças de vidro combinadas até produzir aumentos suficientemente grandes que possibilitassem a visualização dos microrganismos. Os relatos de Robert Hooke e Antony Van Leeuwenhoek possibilitaram as primeiras observações de bactérias e outros microrganismos. Embora não tenha sido, provavelmente, o primeiro a ver as bactérias e os protozoários, o holandês Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) foi o primeiro a relatar suas observações, com descrições precisas e desenhos. Antony Van Leeuwenhoek é considerado o “pai” da microbiologia, porém os relatos de Hooke, descrevendo a estrutura de um bolor, foram publicados anteriormente aos de Leeuwenhoek. Assim, esses dois pesquisadores são considerados os pioneirosnessa ciência. 7 3 ASPECTOS HISTÓRICOS DA MICROBIOLOGIA 3.1 História da evolução da Microbiologia A Microbiologia é uma ciência que foi impulsionada com a descoberta microscópio por Leeuwenhoek (1632-1723). A partir da descoberta do microscópio e a constatação da existência dos microrganismos, os cientistas começaram a indagar sua origem, surgindo então, as teorias da abiogênese ou geração espontânea e a biogênese. Após os experimentos de Spallanzani que provaram que infusões quando aquecidas, esterilizadas e fechadas hermeticamente para evitar recontaminacao impediam o aparecimento de microrganismos, a abiogênese foi descartada. Acredita-se que os microrganismos apareceram na terra há bilhões de anos a partir de um material complexo de águas oceânicas ou de nuvens que circulavam a terra. Os microrganismos são antigos, porém a microbiologia é uma ciência jovem, uma vez que os microrganismos foram evidenciados há 300 anos e só foram estudados e compreendidos 200 anos depois. 3.1 Quem foi Robert Hooke? No século XVII, foram construídos os primeiros microscópios. Com um deles, Robert Hooke observou lâminas de cortiça, chamando de células os pequenos espaços regulares da sua estrutura. Mais tarde, tanto Hooke quanto outros pesquisadores da época observaram que as células vivas não eram ocas como a cortiça, mas o nome original permanece até hoje. Não seria injusto ou incorreto dizer que o estudo da Biologia Celular começou nessa época. O inglês Robert Hooke foi, em pleno século XVII, o que hoje chamamos de “homem dos sete instrumentos”, atuando com contribuições relevantes nos campos da Física, Astronomia, Química, Biologia, Geologia, Arquitetura e Tecnologia Naval. Foi colaborador de cientistas como Isaac Newton, seu grande rival da época, e Robert Boyle, a quem auxiliou na determinação das leis dos gases. Correspondeu-se com Antony van Leeuwenhoek confirmando suas observações ao microscópio. (ATTIAS, 2010, apud MARTINS, 2011, p. 2). 8 Entre outras criações, inventou e melhorou instrumentos como o barômetro e o anemômetro e um mecanismo que tornou os relógios mais precisos. A Lei de Hooke, equação que descreve a elasticidade, é empregada até hoje. Suas contribuições nos campos da Biologia e Paleontologia não foram menos importantes. A reputação de Hooke na história da Biologia se deve em grande parte a sua obra Micrographia, publicada em 1665. Hooke desenvolveu o microscópio composto e o sistema de iluminação, utilizando-o para descrever detalhadamente uma grande variedade de organismos como insetos, esponjas, penas e aquela que parece ser sua maior contribuição, finas lâminas de cortiça. Em desenhos detalhados, Hooke descreveu a estrutura como pequenos poros, semelhantes a favos de mel, dando-lhes o nome de células. Embora estas estruturas observadas correspondessem apenas às paredes celulares de células vegetais já mortas, o nome prevaleceu e dele derivaram os termos Citologia e, mais modernamente, a Biologia Celular. Sua obra permanece até hoje, embora não exista nenhum registro de sua própria aparência. 3.2 Quem descobriu os microrganismos? Fonte: thefamouspeople.com 9 Antony Van Leeuwenhoek (1632-1723) era um homem comum que possuía um armazém, era zelador da prefeitura e servia como provador oficial de vinhos para a cidade de Delft na Holanda. Tinha como hobby polir lentes de vidro, as montava entre finas placas de bronze ou prata para inspecionar fibras e tecelagem de roupas, flores, folhas e pingos d’água. Na época, era comum o interesse pelo mundo natural, mas Leeuwenhoek tinha o cuidado de descrever, detalhadamente, tudo o que fazia e o que observava com suas lentes. Usando seu precário microscópio, observava águas de rios, infusões de pimenta, saliva, fezes e outros materiais; até que verificou nestes, a presença de um grande número de pequeníssimos objetos móveis e de formas diferentes, que não poderiam ser vistos sem a ajuda das lentes, e os chamou de animaculos por acreditar que seriam pequenos animais vivos. A invenção do microscópio, atribuída a Galileu, foi na verdade fruto do aperfeiçoamento realizado pelo naturalista holandês Antony van Leeuwenhoek, que o utilizou na observação de seres vivos. Dotado de apenas uma lente de vidro, o microscópio primitivo inventado pelo pesquisador permitia aumento de percepção visual de até 300 vezes e com razoável nitidez. E tudo aquilo que se encontrava invisível aos olhos tornou-se visível o suficiente para que fosse pesquisado. Este primitivo microscópio foi construído em 1674 e com ele conseguiu-se observar bactérias de 1 a 2 micra (medida equivalente a um milésimo de milímetro). (LEAL, 2000 apud VIEIRA, 2008, p. 12). Leeuwenhoek fez observações magníficas sobre a estrutura microscópica das sementes e embriões de vegetais, animais invertebrados, espermatozoides, sangue e células sanguíneas, dentre outras. Todos os tipos principais de microrganismos que hoje conhecemos (protozoários, algas, fungos e bactérias) foram primeiramente descritos por Leeuwenhoek. Embora tenha feito descobertas fundamentais em Biologia, como as bactérias e os protozoários (parasitas e de vida livre), Leeuwenhoek não era um cientista convencional para seu tempo. Ser filho de comerciantes, sem fortuna, sem educação universitária e sem dominar outros idiomas senão o holandês já seria o bastante para excluí-lo do ambiente acadêmico da época. Ainda assim, com habilidade extraordinária para polir lentes, uma grande curiosidade e uma mente aberta e livre dos dogmas científicos de sua época, Leeuwenhoek foi o primeiro a descrever as hemácias, os espermatozoides e outros microrganismos. 10 Acredita-se que, inspirado pelo livro de Hooke, Micrographia, Leeuwenhoek começou a polir lentes e a fabricar seus microscópios, tendo montado mais de 500 deles. Seus microscópios, embora dotados de uma única lente, eram capazes de aumentar até em 200 vezes os objetos. Por outro lado, a iluminação era deficiente e sua manipulação bastante desconfortável para o observador. Em 1673, Leeuwenhoek começou a enviar cartas com suas observações à recém-criada Royal Society of London. Em 1680 foi eleito Membro Titular da mesma, juntando-se a Robert Hooke, Isaac Newton, Henry Boyle e outros cientistas de renome marcantes até nossos dias. Biogênese e Abiogênese Após a revelação ao mundo da presença dos microrganismos, os cientistas começaram a indagar a origem desses seres e se dividiram em duas correntes de pensamento: Biogênese: Alguns cientistas acreditavam inclusive Leeuwenhoek, que as sementes destas criaturas microscópicas estavam sempre presentes no ar, de onde ganhavam acesso aos materiais e ali cresciam desde que as condições fossem adequadas ao seu desenvolvimento. Abiogênese: Outros cientistas acreditavam que os microrganismos se formavam espontaneamente a partir da matéria orgânica em decomposição ou putrefação. A abiogênese também ficou conhecida como geração espontânea. A ideia da geração espontânea teve origem na Grécia Antiga, que acreditava que rãs e minhocas surgiam, espontaneamente, de um pequeno lago ou lama. Outros acreditavam que larvas de insetos e moscas eram produzidas a partir de carne em decomposição. Pouco a pouco, essas ideias foram perdendo força, por demonstrações científicas como a do médico italiano Francesco Redi (1626-1697), que demonstrou que as larvas encontradas na carne em putrefação eram larvas de ovos de insetos e não um produto da geração espontânea. Essa era uma questão muito importante, no século XIX. Recordemos que foi ao longo do século XIX que surgiram as primeiras teorias sobre evolução dos seres vivos - a proposta de Lamarck foi apresentada no início do século, e a primeira versão da teoria de Charles Darwin foi publicada em 1858. Jean-Baptiste Lamarck defendeu que todos os fenômenosbiológicos são puramente naturais e que a vida deve ter surgido a partir de forças físicas e químicas, sem processos 11 sobrenaturais. Darwin preferiu não tocar nesse assunto, ou seja, nem afirmou que os primeiros seres vivos surgiram naturalmente, nem que foram criados diretamente por Deus. (ALLCHIN, 2007 apud MARTINS, 2009, p. 67). Convencer os que apoiavam a abiogênese de que um ser não poderia surgir apenas da matéria orgânica, tornou-se bem mais difícil, principalmente, a partir do experimento de Heedham em 1749, que demonstrou que, de muitos tipos diferentes de infusões, invariavelmente, emergiam criaturas microscópicas, independentemente do tratamento que recebiam, protegidas ou não, fervidas ou não. Hoje, sabe-se que os experimentos de Heedham foram falhos, pois este não tomava precauções higiênicas para proteger seus experimentos do ar circundante, permitindo dessa forma a contaminação de suas infusões. Cinquenta anos após os experimentos de Heedham, Spallanzani evidenciou em centenas de experiências, que o aquecimento das infusões até esterilização, podia impedir a contaminação por microrganismos. Posteriormente, Spallazani concluiu que poderia haver recontaminacao das infusões por condução dos microrganismos pelo ar, desde que o frasco que a continha não estivesse hermeticamente fechada ou apresentasse rachaduras, propiciando na infusão, o aparecimento de colônias de microrganismos. 3.3 Quem foi Louis Pasteur? Louis Pasteur (1822-1895) foi um químico francês respeitado na época por seus inúmeros trabalhos científicos, o qual dedicou seus consideráveis talentos ao estudo dos microrganismos. Interessou-se pela indústria de vinhos franceses e pela função dos microrganismos na produção de álcool. Este interesse incentivou-o a continuar o debate sobre a origem dos microrganismos, uma vez que ainda persistiam alguns defensores da geração espontâneas ou abiogênese, a exemplo do naturalista francês Felix Archimede Pouchet (1800-1872). Pasteur fez uma série de experimentos definitivos. Um dos principais processos foi o uso de frascos de colo longo e curvado, semelhante ao pescoço de cisnes, que foram preenchidos com caldo nutritivo e aquecidos. O ar podia passar livremente através dos frascos abertos, mas nenhum microrganismo surgiu na solução. 12 A poeira e os microrganismos depositavam-se na área sinuosa em forma de V do tubo e, portanto, não atingiam o caldo. Seus resultados foram comunicados com entusiasmo na Universidade de Sorbonna, em Paris, em 7 de abril de 1864. Pasteur deu um grande impulso na tecnologia de alimentos. O processo de preservação dos alimentos pela pasteurização foi criado por esse ilustre cientista, e o nome do processo de pasteurização foi dado em sua homenagem. Fonte: livescience.com 3.4 Félix Archimède Pouchet Em 1856 o médico e naturalista francês Félix Archimède Pouchet (1800- 1876), diretor do Museu de História Natural de Rouen, iniciou a publicação de uma série de pesquisas favoráveis à geração espontânea de organismos microscópicos. Realizou vários experimentos nos quais procurava primeiramente destruir todos os organismos existentes no material estudado, e depois de algum tempo notava o aparecimento de novos microrganismos. Como exemplo, ele fervia água, a fechava hermeticamente em um recipiente, deixando esfriar; então introduzia oxigênio puro (produzido quimicamente) e feno que havia sido aquecido em um forno a uma temperatura de 100º durante meia hora. Depois de uma semana, observando o líquido ao microscópio, Pouchet constatou a presença de uma grande quantidade de 13 seres vivos microscópicos e concluiu que estes haviam sido gerados espontaneamente. Os experimentos de Pouchet produziram forte repercussão na Academia de Ciências de Paris. Pareciam ter sido bem realizados, e o naturalista, que tinha então 56 anos de idade, era uma pessoa bem conhecida e respeitada na época; mas a crença na geração espontânea, nesse momento, estava já enfraquecida. Alguns pesquisadores franceses importantes, como Henri Milne Edwards, Armand de Quatrefages e Claude Bernard, criticaram os experimentos, alegando que os microrganismos observados poderiam ter vindo do ar, ou então no próprio feno, apesar de seu aquecimento no forno. No entanto, esses autores não procuraram repetir os experimentos. Pouchet refez suas observações, tomando novas precauções, e os microrganismos continuavam a aparecer. Um fisiólogo italiano, Paolo Mantegazza, confirmou pouco depois as observações de Pouchet. Depois de três anos de pesquisas, Pouchet publicou um livro sobre o assunto, denominado Hétérogénie ou traité de la génération spontanée. Essa obra tem um longo histórico da questão, seguido por uma discussão filosófica sobre o tema. Depois discute a questão da origem da vida na Terra, defendendo que os primeiros organismos se formaram espontaneamente, mas esclarecendo que isso não era uma concepção antirreligiosa. Por fim, o livro apresenta um grande número de experimentos nos quais parecia estar ocorrendo geração espontânea de microrganismos. (FARLEY 2007, apud MARTINS 2009, p. 70). Pouchet concluiu que sempre nasceriam “pequenos animais” microscópicos (animaculos) quando houvesse água, ar e alguma substância orgânica em decomposição, mesmo quando fossem tomados cuidados aquecendo fortemente essas substâncias e evitando a entrada de microrganismos do exterior. As pessoas que criticavam a geração espontânea afirmavam que, nesses experimentos, deveriam ter permanecido alguns microrganismos no material aquecido, ou então eles teriam entrado pelo ar, reproduzindo-se na infusão e produzindo todos os seres microscópicos observados. Afirmava-se, por exemplo, que a poeira do ar estaria cheia de germes capazes de produzir os microrganismos observados. Pouchet analisou também a poeira coletada de diversas formas, e não encontrou microrganismos ou esporos que justificassem a grande quantidade de microrganismos que apareciam nas infusões. Em 1860, dois químicos de 14 Toulouse, Nicolas Joly e Charles Musset, também fizeram análises microscópicas do ar e da poeira, sem achar os microrganismos ou esporos que se esperava encontrar. Assim, as pesquisas de Pouchet, confirmadas por outros investigadores, pareciam trazer fortes evidências a favor da geração espontânea dos pequenos seres presentes nessas infusões. Fonte: alchetron.com 3.5 A Microbiologia como ciência Muitos curiosos e cientistas contribuíram para o estudo da Microbiologia como ciência. Seu início se deu na segunda metade do século XIX, quando os cientistas provaram que os microrganismos se originaram de pais iguais a eles próprios e não de causas sobrenaturais ou de plantas e animais em putrefação, como na teoria de geração espontânea. A Microbiologia preocupa-se com o estudo dos microrganismos e de suas atividades, estuda a forma, a estrutura, a reprodução, a fisiologia, o metabolismo e a identificação dos seres microscópicos. Estuda também sua distribuição natural, relações recíprocas e com outros seres vivos, efeitos benéficos e prejudiciais sobre os homens e as alterações físicas e químicas que provocam em seu meio ambiente. Em sua maior parte, a Microbiologia trata com organismos microscópicos unicelulares. Nos indivíduos unicelulares todos os processos vitais são 15 realizados numa única célula. Independentemente da complexidade de um organismo, a célula é, na verdade, a unidade básica da vida. No processo de reprodução, os organismos vivos mantem uma identidade de espécie, possuindo potencialidades de alterações, buscando encontrar um modo especial de sobreviver. A tarefa dos microrganismos na natureza é algo sensacional, especialmente, quando se lembra de seu papel como regulador do equilíbrio entre seres vivos e mortos. 4 OS MICROSCÓPIOS Fonte: mundoeducacao.bol.uol.com.brEm todos os microscópios ópticos, atuais e antigos, teremos uma fonte de luz que é concentrada por um sistema de lentes condensadoras em uma amostra montada sobre uma lâmina. O feixe luminoso atravessa a amostra e é captado por uma lente objetiva que produz uma primeira imagem ampliada do objeto, que será em seguida captada pela lente ocular que projetará a imagem final na retina do observador. 16 4.1 Quanto aumenta um microscópio óptico? O aumento final é o resultado da multiplicação do aumento dado pela lente objetiva pelo aumento da lente ocular. Como existem várias lentes objetivas num mesmo microscópio, uma grande variedade de aumentos pode ser facilmente atingida, bastando girar o revólver. Assim, se utilizamos uma objetiva de 20x e uma ocular de 10x, o aumento final será de 200x (10x20=200). Hoje em dia não é mais necessário desenhar as imagens observadas (como Hooke e seus contemporâneos faziam). A imagem final pode ser capturada por uma câmara fotográfica, de vídeo ou ainda por um sistema de computação. Uma ampliação suplementar pode ser obtida ampliando uma fotografia da imagem observada. Entretanto, de nada adiantaria ampliar a imagem além de determinado ponto, pois nenhuma informação suplementar será obtida. Este é o princípio do limite de resolução. 4.2 O limite de resolução Se dependesse apenas dos olhos, não se conseguiria enxergar nada que medisse menos de 0,2mm. Este é o limite de resolução de nossos olhos. Graças aos microscópios ópticos, pôde-se distinguir objetos que medem até 1 milésimo desse valor, isto é, o limite de resolução dos microscópios ópticos é de 0,2µm. Naturalmente, isso depende da qualidade das lentes, mas também principalmente, do comprimento de onda da luz utilizada. Aumento e resolução são coisas distintas, e o aumento que não traz informações adicionais sobre a amostra é chamado aumento vazio. Por que será que isso acontece? Tudo é consequência da luz. 4.3 Os diferentes microscópios ópticos Além de pequenas, as células possuem outras características que tornam difícil sua observação. Em geral, são transparentes, muito hidratadas e frágeis e quando em órgãos ou tecidos, precisam ser cortadas em lâminas finas que permitam a passagem do feixe luminoso. 17 Por conta disso, foram sendo desenvolvidas ao longo dos anos tanto novas técnicas de preparo das amostras, que lhes conferissem maior resistência e contraste, quanto novas tecnologias na construção de microscópios que permitissem a observação de células vivas. A microscopia envolve conceitos tais como magnificação, resolução e foco, e o domínio desses conceitos é de fundamental importância para o microscopista. A magnificação de um microscópio é o grau de aumento da imagem obtida em comparação com o objeto analisado, enquanto seu poder de resolução é definido como a menor distância entre dois pontos, os quais podem ser diferenciados na amostra em análise. Por fim, o conceito de foco diz respeito à distância da lente (ou espelho) onde os raios de luz convergem. O foco é importante, pois é necessário colocar a amostra nessa distância para que a sua imagem ampliada se apresente de forma definida. (SOUZA 2010, apud TELES, 2017, p.1). O preparo de amostras para o microscópio óptico de campo claro, para que possam ser guardadas por muito tempo, precisam em geral de um tratamento químico que garanta sua preservação. Esse tratamento inclui várias etapas: Fixação: É o tratamento da amostra com substâncias químicas, como o formol, que preservam sua forma original. Desidratação: É a substituição da água presente dentro e fora das células por um solvente orgânico, como o etanol ou metanol. Esse solvente tanto pode ser removido deixando a lâmina secar quanto pode ser substituído por parafina ou outra resina que torne o tecido rígido, permitindo que seja fatiado. Microtomia: Tecidos como fígado ou músculo são muito espessos e precisam ser cortados em fatias mais finas, que permitam a passagem parcial da luz. Uma vez embebidos em parafina, deixa-se solidificar, e o tecido pode ser cortado (fatiado). Coloração: Como a maioria das células e seus componentes não são naturalmente coloridos, uma série de corantes foram testados e, devido a sua afinidade química por determinados componentes celulares, são empregados, ajudando na identificação dos diferentes compartimentos celulares. O azul de metileno é um desses corantes. O resultado disso é que existe hoje uma grande família de microscópios ópticos, cada um com suas vantagens e limitações sobre os demais. Dentre os de uso mais corriqueiro, destacam-se: 18 Microscópio de campo claro ou microscópio simples: É o microscópio “padrão”. Em geral, requer que a amostra seja fixada e corada antes da observação. Entretanto, desde que a iluminação seja ajustada fechando-se um pouco mais a passagem de luz pela condensadora, é possível observar células a fresco, isto é, sem coloração prévia. Microscópio de contraste de fase: Dispensa o uso de corantes, permitindo a observação de células vivas. Um sistema de filtros (anéis de fase) interfere no trajeto da luz, criando um contorno claro/escuro em torno das estruturas celulares. Esse contraste permite a observação de células vivas, mas se elas estiverem muito aglomeradas, a imagem se torna confusa, requerendo um sistema óptico mais elaborado. Microscópio de contraste interferencial: Também utiliza filtros para criar contraste a partir de diferenças no trajeto da luz. A imagem final é mais agradável para o observador, mas o sistema é menos comum, pois é mais caro que o contraste de fase; também permite observar células vivas. Quando essas células estão dispostas em camadas, pode-se focalizar apenas um plano, obtendo-se assim cortes ópticos sem que o tecido seja cortado. Microscópio de fluorescência: Utiliza uma fonte de luz ultravioleta e requer o uso de corantes fluorescentes que se ligam a componentes específicos das células. Esses corantes são capazes de absorver luz de um determinado comprimento de onda (ultravioleta, por exemplo) e emitir num outro, dentro do espectro visível. Em algumas situações, as células podem ser observadas vivas; em outras, não. O mais comum é que um modelo possa ter seus jogos de lentes e fontes de luz alternada (intercambiados) para que se possam observar amostras pelos três métodos. Os microscópios de fluorescência permitem ver estruturas normalmente muito finas para serem observadas com os comprimentos de onda da luz visível. Microscópio confocal de varredura a laser: A conjugação da ciência da computação aos microscópios de fluorescência trouxe uma nova dimensão à microscopia óptica. O microscópio confocal possui, além de uma fonte de luz visível, uma fonte de luz ultravioleta e uma fonte de raio laser. O feixe de laser incide sobre a amostra; um sistema de filtros e aberturas especiais captura sucessivamente a fluorescência emitida de vários planos focais. Este conjunto 19 de imagens é capturado digitalmente e são geradas em programas específicos de computador. Os microscópios ópticos começaram a ser construídos no século XVII, e com eles foram observadas e batizadas as primeiras células. O aperfeiçoamento na construção de lentes, filtros e sistemas de iluminação deu origem a uma grande variedade de microscópios ópticos. O microscópio confocal a laser inaugurou uma nova era na microscopia óptica, mas a observação da maior parte das estruturas que compõem a célula só é possível com um instrumento de maior poder de resolução: o microscópio eletrônico. 4.4 Princípios de funcionamento dos microscópios eletrônicos Os microscópios eletrônicos são instrumentos fundamentais no estudo da célula. Foram desenvolvidos na primeira metade do século XX, sendo contemporâneos da televisão e dos aparelhos de raios-X. O século XX evidenciou uma verdadeira"febre" a partir da descoberta dos elétrons, feita por Thompson, em 1897. Tanto os cálculos feitos pelos físicos teóricos, quanto os experimentos feitos nos "tubos de raios catódicos" vieram a provar a natureza ondulatória dos elétrons. Esses pioneiros provavelmente não faziam a menor ideia de onde aquelas observações iriam levar, mas o estudo do comportamento ondulatório dos elétrons resultou tanto na invenção dos aparelhos de televisão quanto na de um dos instrumentos fundamentais no estudo da Biologia Celular: o microscópio eletrônico. No ano de 1926, Bush provou que era possível focalizar um feixe de elétrons utilizando uma lente eletromagnética circular, estabelecendo assim os fundamentos da óptica eletrônica. Com base nesses princípios, foi iniciada em 1931 a construção do primeiro microscópio eletrônico por um grupo liderado por Ruska. Pelo enorme avanço que a microscopia eletrônica trouxe para as ciências, Ernst Ruska recebeu o Prêmio Nobel na década de 80. Em 1939, a Siemens construía o primeiro modelo comercial de microscópio eletrônico. Por volta de 1939, iniciou-se a produção em escala comercial do microscópio eletrônico de transmissão pela empresa Siemens e 20 Halske, em Berlin. Os pesquisadores da Siemens que iniciaram os trabalhos, principalmente na área biológica, foram Ernst Ruska e Bodo Von Borries. Nessa época, já atingia uma resolução em torno de 2nm, representando uma qualidade de resolução 100 vezes superior ao microscópio óptico. O microscópio eletrônico de transmissão, além de seu grande poder de resolução, oferece outras duas vantagens positivas em relação ao microscópio ótico: a possibilidade de observar o interior de amostras biológicas ou inorgânicas e a facilidade de observação dos detalhes da microestrutura. (KESTENBACH 1989, apud RAMOS 2013, p.11). O microscópio eletrônico, na verdade se refere a uma família de instrumentos que utiliza um feixe de elétrons para produzir uma imagem ampliada de um objeto. Essa família é composta por dois tipos de microscópios: Os microscópios eletrônicos de transmissão e os de varredura. Os primeiros se baseiam na capacidade do feixe de elétrons de atravessar a amostra, enquanto nos segundos o feixe de elétrons percorre a superfície da amostra gerando um sinal que será visualizado num monitor. Três séculos de microscopia óptica serviram para acelerar os progressos na interpretação das imagens da microscopia eletrônica. Ao microscópio óptico não é difícil determinar o formato geral da célula e a localização do núcleo, mas não é muito fácil identificar estruturas dentro da célula. Mesmo assim, grande parte das estruturas intracelulares, as organelas, já haviam sido descritas ao microscópio óptico. Naturalmente, as funções e a estrutura detalhada dessas organelas só foram esclarecidas mais tarde. O grande salto conferido à Biologia Celular depois da invenção desse instrumento reside no poder de resolução que suas imagens possuem. Isto é, não é apenas uma questão de aumentar mais as células e sim de permitir que sejam observadas estruturas menores dentro delas. 4.5 O microscópio eletrônico de transmissão O microscópio eletrônico de transmissão é idêntico ao microscópio óptico na montagem de seus itens básicos, apenas é maior e invertido. O que os diferencia fundamentalmente é: A fonte: Luz visível no microscópio óptico e feixe de elétrons no microscópio eletrônico de transmissão. O vácuo na coluna do microscópio eletrônico de transmissão. 21 As lentes: De vidro no microscópio óptico e eletromagnetos no microscópio eletrônico de transmissão. A espessura da amostra: da ordem de micrômetros (µm) no microscópio óptico e de nanômetros (nm) no microscópio eletrônico. O feixe de elétrons é gerado por um filamento de tungstênio que é aquecido; podemos comparar ao que observamos numa lâmpada em que o filamento aquecido emite o feixe luminoso. O vácuo, que também existe dentro do bulbo da lâmpada, é necessário não apenas para impedir a combustão do filamento na presença de oxigênio como também para impedir a colisão do feixe de elétrons com moléculas do ar. Por outro lado, esse é um dos fatores que impossibilita a observação de células vivas no microscópio eletrônico de transmissão. As lentes magnéticas desviam e orientam o feixe de elétrons da mesma forma que as lentes de vidro desviam e orientam o feixe de luz; lembre-se de que elétrons são uma radiação de carga negativa, sendo, portanto, atraídos por cargas opostas e repelidos por cargas semelhantes. Já a amostra precisa ser cortada em fatias muito finas para ser atravessada pelos elétrons. Mesmo a lâmina de vidro mais fina barraria o feixe de elétrons. Por esse motivo são usadas telas de cobre para servir de suporte para os cortes ultrafinos. Como se forma a imagem num microscópio eletrônico de transmissão? Ao interagir com a amostra, os elétrons do feixe podem passar entre os átomos sem colidir com eles, barrados por um átomo desviando-se num grande ângulo (desvio elástico) e serem levemente desviados de sua rota por outro átomo (desvio inelástico). Destas possibilidades de interação resultará a imagem no microscópio eletrônico de transmissão: Os elétrons barrados ou desviados serão excluídos da imagem final, resultando em pontos escuros, enquanto os elétrons que atravessarem a amostra irão colidir com uma tela fluorescente, dando origem a pontos claros. Preparo de amostras para observação ao MET 22 O ambiente no interior da coluna do microscópio eletrônico – vácuo feixe de elétrons – não é nem um pouco favorável à preservação da estrutura celular. Além disso, a composição química das células, basicamente átomos leves, também não é propícia à formação de imagens no MET. Por esses motivos, assim como o microscópio foi se aperfeiçoando desde sua invenção, paralelamente toda uma metodologia de preparação de amostras para observação ao microscópio eletrônico de transmissão foi sendo desenvolvida. As etapas desse processo são as seguintes: Fixação: Em geral é feita mergulhando as células ou tecidos em soluções que estabilizam as membranas e os constituintes celulares na forma a mais próxima possível da in vivo. Os mais utilizados são o formaldeído e o Glutaraldeido, superior ao formol e por isso mais utilizado. Essas substâncias, chamadas fixadores, são empregadas diluídas em tampões, que ajudam a manter o pH e a osmolaridade da solução fixadora o mais próximo possível das condições vitais. Dessa maneira evita-se a deformação ou o rompimento das estruturas celulares. Pós-fixação e contrastação: Como os seres vivos são compostos basicamente por átomos leves que desviam pouco ou nada a passagem do feixe de elétrons, são utilizadas soluções de sais de metais pesados, que, além de melhorarem a preservação das células, aumentam o contraste das amostras quando observadas ao microscópio eletrônico de transmissão. Esses sais se impregnam seletivamente nas membranas (caso do ósmio e do chumbo), no DNA (caso do urânio) ou em outros componentes celulares, facilitando a visualização dessas estruturas. O tetróxido de ósmio impregna-se nas membranas funcionando como um fixador e conferindo simultaneamente maior contraste às mesmas. Por ser utilizado depois do Glutaraldeido, é um pós-fixador. Já os sais de chumbo e urânio geralmente são utilizados na última etapa de preparação da amostra, logo antes da observação ao microscópio eletrônico. Desidratação, inclusão e Microtomia: A fixação confere preservação às células; entretanto, o fato de serem em geral muito espessas e hidratadas para que o feixe de elétrons possa atravessá-las também é um obstáculo a ser superado. Para isso as amostras têm toda sua água substituída, inicialmente por um solvente orgânico como álcool etílico ou acetona, e em seguida por uma resina que, inicialmente, é líquida,mas nas condições adequadas que 23 geralmente ao ser aquecida endurece, permitindo que as amostras sejam cortadas em fatias finas o suficiente para que os elétrons possam passar nas áreas em que não se impregnaram os metais pesados. A microscopia eletrônica de transmissão permite a observação do interior da célula e de suas estruturas e organelas. Infelizmente, como a observação é feita em fatias muito finas das células, tem-se sempre imagens bidimensionais de objetos que, na realidade, são tridimensionais. Essa dificuldade foi, ao menos parcialmente contornada pela microscopia eletrônica de varredura, onde a resolução de detalhes da célula se combina à observação da sua estrutura tridimensional. 4.6 O microscópio eletrônico de varredura No microscópio de varredura um filamento de tungstênio aquecido gera um feixe de elétrons, que também incide sobre a amostra, mas ao invés de atravessá-la varre a superfície ponto a ponto; porém, interage com a amostra, extraindo da superfície destes outros elétrons, chamados elétrons secundários, que geram um sinal luminoso que é convertido numa imagem O feixe de elétrons passeia sobre a amostra, como o feixe de laser sobre o CD que você ouve. Assim como de cada ponto do CD é extraído um sinal sonoro diferente, cada ponto da amostra interage de modo diferente com o feixe de elétrons e dessas diferenças são gerados pontos mais ou menos brilhantes que formarão a imagem. Essa imagem é observada num monitor de TV e pode ser registrada em fotografia ou num computador. O MEV é uma ferramenta bastante utilizada, tanto por pesquisadores das áreas biológicas, quanto das áreas de materiais. Ele pode fornecer rapidamente informações sobre a morfologia e identificação de elementos químicos de uma amostra sólida, portanto, sua utilização é comum em biologia, odontologia, farmácia, engenharia, química, metalurgia, física, medicina e geologia [...]. Paralelamente com o desenvolvimento do microscópio eletrônico, o desenvolvimento dos computadores, softwares e imagens digitais facilitou bastante a análise e publicação de resultados. (MACHADO, 2007 apud RAMOS 2013, p. 18). Preparo da amostra para microscopia de varredura 24 Como, em geral, o objetivo do pesquisador ao utilizar o microscópio eletrônico de varredura é obter informações sobre a forma externa das amostras não cortadas em fatias, seu processamento envolve, após o tratamento com soluções fixadoras, a secagem do material e seu revestimento com ouro ou outro elemento condutor, para geração do sinal. Outros microscópios eletrônicos Os microscópios eletrônicos formam uma verdadeira família. De acordo com os acessórios de que são dotados ou ainda conforme as amostras sejam preparadas, diferentes tipos de imagem e de informação são obtidos. O microscópio eletrônico de alta voltagem: Enquanto no microscópio eletrônico de transmissão convencional o feixe de elétrons é acelerado de 50 a 80 KV, permitindo a observação de amostras até 100-150 nm de espessura, no microscópio eletrônico de transmissão de alta voltagem a aceleração do feixe é de até 1.000 KV. Isso permite a observação de amostras bem mais espessas (até 2 µm). A maioria das células é mais espessa do que isso (5-20 µm), mas mesmo assim aspectos importantes das células foram observados nesse microscópio eletrônico de transmissão. Microanálise: De acordo com a natureza dos átomos presentes na amostra, a colisão com os elétrons do feixe gera raios-X e outras radiações que podem ser captadas por detectores especiais, dando informações sobre a composição química da amostra. Esses detectores são acessórios que podem ser adaptados ao microscópio eletrônico de transmissão ou ao microscópio eletrônico de varredura. Varredura de alta resolução: Nesse microscópio o feixe emitido é muito fino, varrendo áreas muito menores da amostra. Assim, detalhes que passam despercebidos na varredura convencional podem ser resolvidos. Organelas e filamentos do citoesqueleto, que normalmente não são visíveis ao microscópio eletrônico de varredura, podem ser vistas a partir desta tecnologia. Varredura de pressão variável (ambiental): Nesse modelo de microscópio eletrônico de varredura, a pressão na coluna é variável, sendo possível observar amostra frescas, isto é, sem nenhum tratamento químico e sem o processo de secagem. Potencialmente, podem ser observadas amostras vivas nesse microscópio, mas o poder de resolução é ainda bastante limitado. 25 5 CLASSIFICAÇÃO DOS MICROORGANISMOS 5.1 Os seres vivos Fonte: tecnico.ulisboa.pt Os seres vivos são constituídos de unidades microscópicas chamadas de células que formam, em conjunto, estruturas organizadas. As células são compostas de núcleo e citoplasma. Quando o núcleo celular é circundado por uma membrana nuclear ou carioteca, os organismos que as possuem são chamados de eucarióticos, os que não possuem células com carioteca são os procarióticos a exemplo das bactérias. Baseado na maneira pela qual os organismos obtêm alimentos, Robert H. Whittaker classificou os organismos vivos em Cinco reinos: reino Monera, reino Protista, reino Plantae, reino Animalia e reino Fungi. Os microrganismos pertencem a três dos cinco reinos: As bactérias são do reino Monera, os protozoários e algas microscópicas são Protistas e os fungos microscópicos como leveduras e bolores pertencem ao reino Fungi. 26 5.2 A célula Fonte: engenhariae.com.br A célula e uma estrutura típica microscópica comum a todos os seres vivos. Com os avanços da microscopia eletrônica na década de 1940, foi possível a visualização de muitas estruturas da célula que seria impossível no microscópio ótico. Todas as células se compõem de duas regiões internas principais conhecidas como núcleo e citoplasma. O núcleo, que é circundado pelo citoplasma, contém todas as informações genéticas do organismo, sendo responsável pela hereditariedade. O citoplasma é a sede primária dos processos de síntese e o centro das atividades funcionais em geral. Em contraste, as bactérias e o pequeno grupo de algas azul-verdes se caracterizam por células menores procarióticas por não apresentarem membrana nuclear. Nas plantas e microrganismos, a parede celular é a única estrutura limitante. Seu único papel parece ser o de proteção contra injurias mecânicas e impedem, principalmente, a ruptura osmótica quando a célula e colocada em ambiente com alto teor de agua. A célula é a unidade estrutural e funcional dos organismos vivos, ou seja, todos os seres vivos são formados por células. Os menores são constituídos por uma única célula, os maiores por bilhões. A percepção de que todos os organismos são compostos por células foi um dos mais importantes avanços 27 científicos. A palavra célula no sentido biológico foi usada, pela primeira vez, pelo cientista inglês Robert Hooke no século XVII. As células surgem de outras células preexistentes. As formas mais simples de vida são células solitárias (organismos unicelulares), enquanto as formas superiores contêm associações de células, constituindo colônias de organismos unicelulares ou constituindo organismos pluricelulares mais complexos, podendo apresentar estruturas e formas variadas. Todas as células compartilham dois aspectos essenciais. O primeiro é uma membrana externa, a membrana plasmática. O outro é o material genético que regula a atividade da célula, possibilitando a sua reprodução e a passagem das suas características para a sua descendência. A organização do material genético é uma das características que separa as células procariontes das células eucariontes. Nas células procariontes, o material genético (DNA) está na forma de uma grande molécula circular, conhecida como cromossomo. Em células eucariontes, o DNA é linear e fortemente ligado a proteínas especiais, conhecidas comohistonas, formando certo número de cromossomos complexos. As células dos microrganismos podem ser divididas em duas categorias: Células Eucarióticas apresentam um núcleo separado do citoplasma por uma membrana nuclear (carioteca); Células Procarióticas apresentam material nuclear sem membrana. Células eucarióticas, em geral, são maiores e mais elaboradas do que as Bactérias e Archaea. Algumas vivem vidas independentes, como organismos unicelulares, como as amebas e as leveduras; outras vivem em agrupamentos multicelulares. Todos os organismos multicelulares mais complexos – incluindo plantas, animais e fungos – são formados a partir de células eucarióticas. Por definição, todas as células eucarióticas possuem um núcleo. Mas a posse de um núcleo significa possuir também uma variedade de outras organelas, estruturas subcelulares que realizam funções especializadas. A maioria dessas é igualmente comum a todos os organismos eucarióticos. (ALBERTS 2011 apud TREVISAN 2013 p.5). 5.3 Citoplasma O citoplasma é o espaço intracelular preenchido por uma matriz semifluida que tem a consistência de gel, denominada hialoplasma, na qual está “mergulhado” tudo o que se encontra dentro da célula, tal como moléculas e 28 organelas. O citoplasma é constituído principalmente de água (80%), mas também contém íons, sais minerais e moléculas, tais como proteínas, carboidratos e o RNA, que correspondem aos 20% restantes. 5.4 Organelas citoplasmáticas Os organismos procariontes não possuem núcleo organizado e geralmente são pequenos. Caracterizam-se por não possuírem organelas envoltas por membranas, tais como o retículo endoplasmático, o complexo de Golgi, as mitocôndrias e os plastos. As células eucariontes são mais complexas e são típicas de protozoários, fungos, animais e vegetais. Uma organela citoplasmática pode ser definida como uma determinada parte do citoplasma responsável por uma ou mais funções especiais. As organelas mais importantes são: Ribossomos: Responsáveis pela síntese de proteínas, não são limitados por membranas e, portanto, ocorrem tanto em procariontes quanto em eucariontes. Os ribossomos de eucariontes são ligeiramente maiores que os de procariontes. Eles são compostos por duas subunidades de tamanhos diferentes. Bioquimicamente, o ribossomo consiste em RNA ribossômico (RNAr) e aproximadamente 50 proteínas estruturais. Mitocôndrias: São formadas por duas membranas, uma externa e outra interna. A membrana externa é lisa, e a interna possui inúmeras pregas, chamadas cristas mitocondriais. A cavidade interna das mitocôndrias é preenchida por um fluido, denominado matriz mitocondrial, que contém grande quantidade de enzimas dissolvidas, necessárias para a extração de energia dos nutrientes. As mitocôndrias são de fundamental importância no processo de respiração celular e no fornecimento de energia a partir da quebra da glicose. Junior Realce 29 Fonte: emforma.net Complexo de Golgi: São estruturas membranosas, formadas por bolsas achatadas e empilhadas cuja função é elaborar e armazenar proteínas advindas do retículo endoplasmático. É abundante em células secretoras. Centríolo: É formado por um par de cilindros cuja parede é constituída por nove conjuntos de três microtúbulos cada, e, geralmente, ocorrem aos pares nas células. Os centríolos são desprovidos de membrana, sua constituição é de natureza proteica. Dos centríolos originam estruturas locomotoras, denominadas cílios e flagelos, que diferem entre si quanto ao comprimento e número por célula. Lisossomo: São pequenas bolsas portadoras de enzimas digestivas. Elas são liberadas pelo complexo de Golgi, com a finalidade de promover a digestão de substâncias englobadas pelas células. Pode também digerir componentes da própria célula, promovendo a morte celular para uma contínua renovação. Retículo endoplasmático liso: É uma rede de estruturas tubulares e vesiculares achatadas e interligadas formada por uma membrana dupla, amplamente distribuída pela célula e em comunicação com a membrana plasmática ou com a carioteca. Não apresenta ribossomos aderidos à membrana externa. É responsável pela síntese de todos os lipídios que constituem a membrana plasmática, incluindo fosfolipídios e colesterol. Retículo endoplasmático rugoso: Estrutura de formato achatado e com ribossomos aderidos, está presente em maior número nas células especializadas na secreção de proteínas. Junior Realce Junior Realce Junior Realce 30 Cloroplastos: São delimitadas por duas membranas lipoprotéicas, uma externa lisa e outra interna que forma dobras para o interior da organela. Esse conjunto bem organizado de membranas formam pilhas unidas entre si, chamadas de grana. Cada elemento da pilha, que tem o formato de moeda, é o tilacóides. Todo esse conjunto de membranas encontra-se mergulhado em um fluído gelatinoso que preenche o cloroplasto, o estroma, onde há enzimas, DNA, pequenos ribossomos e amido. As moléculas de clorofila localizam-se nas membranas dos tilacóides, tal sistema é, portanto, a sede das reações fotoquímicas responsáveis pela captação e transformação da energia luminosa em energia química. Flagelos: Os flagelos das bactérias (procariontes) são compostos por uma proteína chamada flagelina, e dos eucariontes, são extensões filamentosas citoplasmática, frequentes em protozoários, esponjas e gametas móveis. O flagelo tem a mesma função em todas as células que é criar movimentos. 5.1 Classificação dos 5 reinos A classificação dos organismos, mais recente, proposta por Robert H. Whittaker em 1969 foi baseada a partir da maneira pela qual o organismo obtém nutrientes de sua alimentação. Sendo estes: Fotossíntese: Processo pelo qual a luz fornece energia para converter o dióxido de carbono em água e açúcares. Absorção: A captação de nutrientes químicos dissolvidos em água. Ingestão: Entrada de partículas de alimentos não dissolvidas. Nesse esquema de classificação, os procariotos que normalmente obtém alimentos só por absorção constituem o reino Monera. O reino Protista inclui os microrganismos eucarióticos unicelulares, que representam os três tipos nutricionais: as algas são fotossintéticas, os protozoários podem ingerir seu alimento e os fungos limosos somente absorvem os nutrientes. Os organismos eucarióticos superiores são colocados no reino Plantae (plantas verdes fotossintéticas e algas superiores), Animalia (animais que ingerem alimentos) e Fungi, organismos que tem parede celular, mas não apresentam o pigmento clorofila encontrado em outras plantas para promover a Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce 31 fotossíntese, portanto eles absorvem os nutrientes. Como pode se observar, os microrganismos pertencem a três dos cinco reinos. 5.2 Principais características dos grupos de microrganismos Protozoários: São microrganismos eucarióticos unicelulares. Como os animais ingerem partículas alimentares, não apresentam parede celular rígida e não contem clorofila. Movem-se através de cílios, flagelos ou pseudopode. Estes microrganismos são estudados na ciência da Parasitologia. O termo protozoário não tem valor taxonômico, mas ele é frequentemente utilizado quando se quer referir a um organismo unicelular eucarioto heterotrófico que pode ocorrer em diversos habitats onde há água. Os protozoários são encontrados sob a forma livre ou em associação com outros organismos e, neste último caso, são denominados de epibiontes, comensais, simbiontes ou parasitas. (ESTEBAN 1998, apud REGALI-SELEGHIM, 2011, p. 390). São amplamente distribuídos na natureza, principalmente, em ambientes aquáticos. Muitos são nocivosao homem como a ameba e a giárdia. Algas: São semelhantes as plantas por possuírem clorofila que participa do processo de fotossíntese e apresentam uma parede celular rígida. São eucariotos e pode ser unicelular ou multicelular com vários metros de comprimento, podendo ser nocivas por produzirem toxinas, obstruir caixas d’agua ou crescerem em piscinas. Entretanto, algumas espécies são usadas nas indústrias de alimentos, farmacêuticas, cosméticos e para o uso em laboratório. Fungos: Podem ser unicelulares ou multicelulares. São eucariotos e possuem parede celular rígida. Os fungos não ingerem alimentos e obtêm os nutrientes do ambiente através de absorção. Bactérias: São seres unicelulares aclorofilados, microscópicos, que se produzem por divisão binária. São chamadas de procarióticas porque não possuem um núcleo organizado e são morfologicamente mais simples que as células dos organismos “superiores”. Compreende os domínios: Bacteria e Archae. Vírus: Representam o limite entre as formas vivas e as sem vida. Não são células como as descritas anteriormente, contém somente um tipo de ácido nucleico, RNA ou DNA que é circundado por um envelope proteico ou capa. Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Sublinhado Junior Sublinhado Junior Sublinhado 32 Devido à ausência de componentes celulares necessários para o metabolismo ou reprodução independente, o vírus pode multiplicar-se somente dentro de células vivas, por isso não são considerados seres vivos por não possuírem vida própria. 6 BACTÉRIAS Fonte: quantamagazine.org São organismos unicelulares que podem ser encontrados de forma isolada ou em colônias; são constituídos por uma célula (unicelulares), não possuem núcleo celular definido (procariontes) e não possuem organelas membranosas. As bactérias, como representantes dos seres procarióticos, foram selecionadas na natureza pela sua elevada capacidade de adaptar-se ao ambiente que as cerca, em virtude de sua grande taxa de multiplicação, bem como por sua elevada taxa metabólica. Desta forma, estes seres peculiares foram e ainda são utilizados no estudo de técnicas genético-moleculares e análises bioquímicas, que vêm sendo empregadas nos diferentes campos da microbiologia. (BECK 2000, apud MOREIRA, 2015, p. 13). 6.1 Morfologia As bactérias são variáveis quanto ao tamanho e quanto às formas que apresentam. Invisíveis a olho nu, só podendo ser visualizada com o auxílio do Junior Realce Junior Realce 33 microscópio, as bactérias são normalmente medidas em micrometros (µm), que são equivalentes a 1/1000mm (10-3mm). A grande maioria tem aproximadamente de 0,5 a 1µm de diâmetro ou largura. Embora existam milhares de espécies bacterianas, elas podem ser agrupadas em três tipos morfológicos gerais: cocos, bacilos e espiralados. Formas de cocos (esféricas): É o grupo de bactérias mais homogêneo em relação ao tamanho. Os cocos tomam denominações diferentes de acordo com o seu arranjo. • Micrococos – cocos. • Diplococos – cocos agrupados aos pares. • Tétrades – agrupamentos de quatro cocos. • Sarcina – agrupamentos de oito cocos em forma cúbica. • Estreptococos – cocos agrupados em cadeias. • Estafilococos – cocos agrupados em grupos irregulares, lembrando cachos de uva. Forma de bacilos: São células cilíndricas em forma de bastonete; apresentam grande variação na forma e no tamanho entre gêneros e espécies. Formas espiraladas: Caracterizadas por células em espiral; dividem-se em: Espirilos: Possuem corpo rígido e movem-se à custa de flagelos externos. Ex.: Gênero Aquaspirillium. Espiroquetas: São flexíveis e locomovem-se geralmente por contrações do citoplasma, podendo dar várias voltas completas em torno do próprio eixo. Ex.: Gênero Treponema Além desses três tipos morfológicos, existem algumas formas de transição. • Bacilos muito curtos: cocobacilo. • Unidades celulares que se assemelham a uma vírgula: vibrião. 6.2 Estruturas externas da célula bacteriana O tamanho, a forma e o arranjo das bactérias constituem sua morfologia, sua aparência externa. A observação interna das estruturas celulares permite conhecer um pouco o funcionamento da bactéria no ambiente. Junior Realce Junior Sublinhado Junior Realce Junior Realce Junior Realce Treponema Palidum (Sifilis) 34 Parede celular A parede celular é uma estrutura rígida que está presente em quase todas as bactérias e localiza-se acima da membrana citoplasmática. Ela contém polímeros complexos conhecidos como peptideoglicano, que são responsáveis pela sua rigidez. Esta impede que a célula estoure em decorrência do grande turgor e atua como uma barreira de proteção contra determinados agentes químicos e físicos externos e funciona como suporte de antígenos somáticos bacterianos. As bactérias podem ser divididas em dois grandes grupos, com base na capacidade de suas paredes celulares fixarem o corante violeta cristal: as Gram- positivas (que coram em roxo) e as Gram-negativas (que coram em vermelho). A parede bacteriana é a principal implicada na diferenciação da coloração de Gram, e este comportamento reflete a diferença na composição química da parede das bactérias Gram-positivas e Gram- negativas. A parede das bactérias Gram-positivas caracteriza-se por uma espessa camada de peptideoglicano, também conhecido como mureína ou mucopeptídeo, enquanto nas bactérias Gram-negativas a camada de peptidoglicano é muito delgada; entretanto, a estrutura da parede das Gram negativas é bem mais complexa do ponto de vista químico. (DAUR 2004, apud MOREIRA 2015, p.15). A parede celular de bactérias Gram-positivas é composta basicamente por peptideoglicano, que constitui uma espessa camada ao redor da célula. Outros polímeros, tais como ácidos lipoteicóicos e polissacarídeos, também podem estar presentes nessa camada. Nas bactérias Gram-negativas o peptideoglicano constitui uma camada basal delgada, sobre a qual se encontra outra camada, denominada membrana externa que é composta por lipoproteínas, fosfolipídios, proteínas e lipopolissacarídeos. O processo de coloração de Gram consiste basicamente em tratar bactérias sucessivamente com cristal violeta, lugol, álcool e fucsina. O cristal violeta e o lugol penetram tanto nas bactérias Gram-positivas quanto nas Gram- negativas, formando um complexo de cor roxa. O tratamento com álcool é a etapa diferencial; nas Gram-positivas, o álcool não retira o complexo cristal violeta+lugol, pois a sua ação desidratante faz com que a espessa camada de peptideoglicano torne-se menos permeável, retendo o corante. Nas Gram- negativas, devido à pequena espessura da camada de peptideoglicano, o Junior Realce O peptidoglicano é um polímero constituído por açúcares e aminoácidos que originam uma espécie de malha na região exterior à membrana celular das bactérias (excepto Archaea) – a parede celular. O polissacárido que constitui o peptidoglicano consiste em resíduos alternados de N-acetilglucosamina (NAG) e ácido N-acetilmurâmico (NAMA), unidos por ligações β-(1,4). Associada ao ácido N-acetilmurâmico está uma cadeia peptídicos de 4 a 5 resíduos de aminoácido. O péptido estabelece ligações cruzadas com outra cadeia peptídica, formando uma malha tridimensional. Algumas Archaea possuem estruturas similares de pseudopeptidoglicano, onde existem ligações β-(1,3) entre N-acetilglucosamina e ácido N-acetilalosaminurónico (daí as Archaea serem insensíveis à lizosima). Junior Realce Junior Realce Junior Realce exceto archeas Junior Realce distenção da camada Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Fina Junior Realce Os peptídios, peptídeos ou péptidos são biomoléculasformadas pela ligação de dois ou mais aminoácidos atrávés de ligações peptídicas, estabelecidas entre um grupo amina de um aminoácido, e um grupo carboxilo do outro aminoácido. Os peptídios são resultantes do processamento de proteínas e podem possuir na sua constituição 2 ou mais aminoácidos. 35 complexo corado é extraído pelo álcool, deixando as células descoradas. O tratamento com fucsina não altera a cor roxa das Gram-positivas, ao passo que as Gram-negativas descoradas pelo álcool se tornam avermelhada. A coloração de Gram é amplamente utilizada para identificar e classificar bactérias. Essa classificação é importante, pois as bactérias Gram-positivas são mais sensíveis à penicilina e à sulfa. Este processo de coloração é um dos mais importantes métodos realizados em laboratório de microbiologia. Flagelos De acordo com o número e distribuição dos flagelos, as bactérias podem ser classificadas como: atríquias (sem flagelos), monotríquias (um único flagelo), anfitríquias (um flagelo em cada extremidade), lofotríquias (um tufo de flagelos em uma, ou ambas as extremidades) e peritríquias (apresentando flagelos ao longo de todo o corpo bacteriano). Algumas bactérias movimentam-se por outros meios, diversos da atividade flagelar, tais como o deslizamento provocado pelo fluxo protoplasmático ou pela resposta táxica (fototaxia, quimiotaxia). Pelos (fímbrias) São apêndices finos, retos e curtos que estão presentes em muitas bactérias Gram-negativas. São encontrados tanto nas espécies móveis como nas espécies imóveis e, portanto, não desempenham papel relativo à mobilidade. Os pelos originam-se de corpúsculos basais na membrana citoplasmática e sua função parece estar relacionada com a troca de material genético durante a conjugação bacteriana (fímbria sexual) com a aderência às superfícies mucosas. As fímbrias podem ser removidas sem comprometimento da viabilidade celular e regeneram-se rapidamente. Glicocálice É formado por uma substância mucilaginosa ou gelatinosa e fica ligada à parede celular como um revestimento externo. Se o Glicocálice estiver organizado de maneira definida e acoplado firmemente à parede celular, recebe o nome de cápsula, se estiver desorganizado e sem qualquer forma frouxamente acoplada à parede celular, recebe o nome de camada limosa. Junior Realce familia de farmaco sulfanilamida combate infecções bacterianas Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce 36 O Glicocálice pode ser de natureza polissacarídica (um ou vários tipos de açúcares) ou polipeptídica (ácido glutâmico). Desempenha papel importante na infecção, permitindo que a bactéria patogênica se ligue a tecidos específicos do hospedeiro. Acredita-se que o Glicocálice possa proteger as bactérias da dessecação. Membrana plasmática (modelo mosaico fluido) É uma membrana que separa a parede celular do citoplasma. Sua espessura é da ordem de 7,5 nanômetros e é composta principalmente por uma bicamada de fosfolipídios e proteínas, desempenha importante papel na permeabilidade seletiva da célula. A membrana é o sítio da atividade enzimática específica e do transporte de moléculas para dentro e para fora da célula. Ela difere da membrana plasmática das células eucarióticas por não apresentar esteroides em sua composição; ser sede de numerosas enzimas do metabolismo respiratório das bactérias e controlar a divisão bacteriana através dos mesossomos. Os mesossomos são invaginações da membrana plasmática que podem ser simples dobras ou estruturas tubulares ou vesiculares. Alguns autores associam ainda aos mesossomos o valor funcional das mitocôndrias, atribuindo a eles o papel na respiração bacteriana. 6.3 Estruturas internas da célula bacteriana Citoplasma É composto pela porção fluida e contém substâncias dissolvidas e partículas, tais como ribossomos, e material nuclear ou nucleóide, rico em DNA. Inclusões citoplasmáticas As inclusões são formações não vivas existentes no citoplasma, como grãos de amido, gotas de óleo, chamadas de grânulos, e podem servir como fonte de material de reserva ou energia. Nucleóide e plasmídeos Junior Realce Junior Realce Junior Realce 37 As células bacterianas não contêm o núcleo típico das células animais e vegetais. O cromossomo bacteriano consiste de um cromossomo único e circular e ocupa uma posição próxima ao centro da célula. Pode ser chamado de nucleóide. Várias bactérias apresentam também moléculas de DNA extracromossomal, denominadas plasmídeos, as quais são geralmente circulares, contendo muitas vezes genes que conferem características adaptativas vantajosas ao microrganismo. As bactérias são importantes nos processos biotecnológicos, na indústria, agricultura e na medicina. 6.4 Reprodução, nutrição e crescimento das bactérias. Geralmente reproduzem-se assexuadamente por fissão binária ou cissiparidade. Nesse processo reprodutivo ocorre à replicação do cromossomo e uma única célula divide-se em duas; em seguida ocorre a divisão do cromossomo bacteriano replicado e o desenvolvimento de uma parede celular transversal. A fissão binária não é o único método reprodutivo assexuado entre as bactérias. Também pode ocorrer esporulação e brotamento. Embora não ocorra reprodução sexuada, pode ocorrer troca de material genético entre as bactérias. Tal recombinação genética pode ocorrer por transformação, conjugação ou transdução. Transformação: Incorporação de fragmentos de DNA perdidos por outra bactéria que se rompeu. Esse mecanismo demonstra formalmente que o DNA é a base química da hereditariedade. Conjugação: Duas células bacterianas geneticamente diferentes trocam DNA através de pelo sexual. Transdução: Moléculas de DNA são transferidas de uma bactéria para outra usando os vírus como vetores (bacteriófagos). Quando o bacteriófago entra numa célula bacteriana, o DNA do vírus mistura-se com uma parte do DNA bacteriano, de modo que o vírus passa a carregar essa parte do DNA. Se o vírus infecta uma segunda bactéria, o DNA da primeira pode misturar-se com o DNA da segunda. Essa nova informação genética é então replicada a cada nova divisão Junior Realce Junior Realce Fímbrias Junior Realce Junior Realce 38 Tempo de geração É o tempo necessário para que uma célula bacteriana se divida ou para que a população duplique. Esse tempo pode variar de 15 a 20 minutos ou até algumas horas. O tempo de geração depende da espécie bacteriana e das condições ambientais, ou seja, as bactérias são capazes de crescer numa ampla faixa de condições físicas, podendo utilizar alimentos muito diferentes. Contudo, seu crescimento requer condições específicas para uma dada espécie. Endósporos (esporos) Formas dormentes de células bacterianas são produzidas por certas espécies de bactérias em situações de escassez de nutrientes. Os esporos representam uma fase latente (repouso) da célula: são extremamente resistentes aos agentes físicos e químicos adversos, demonstrando uma estratégia de sobrevivência. O endósporo resiste até que as condições melhorem e muitos resistem até mesmo à água fervente. A indústria de alimentos preocupa-se em tomar providências para que os endósporos não estejam presentes durante o processo de acondicionamento dos alimentos. Todas as bactérias dos gêneros Bacillus e Clostridium produzem endósporos, por isso são mais resistentes. Alguns gêneros bacterianos, como por exemplo, Bacillus e Clostridium (bacilos Gram-positivos), podem passar por um processo de diferenciação celular chamado esporulação que resulta na transformação da célula vegetativa em esporo, o qual é química e morfologicamente diferente da célula mãe. Este processo geralmente ocorre quando a bactéria está submetida a “stress” físico (calor) ou químico (carência de nutrientes).É um processo geneticamente coordenado que se inicia com a desrepressão do gene que leva à síntese de RNAm e que vai dar início à produção do esporo. (PICOLI 2007, apud MOREIRA 2015, p.24). Nutrição das bactérias Do ponto de vista nutricional, as bactérias podem ser divididas em classes fisiológicas dependendo da forma de obtenção de fontes de energia e carbono para a realização de suas atividades vitais: Fototróficos: São organismos que utilizam a energia radiante (luz) como fonte. Quimiotróficos: São organismos incapazes de utilizar a energia radiante; dependem da oxidação de compostos químicos para a obtenção de energia. Junior Realce Junior Realce Junior Realce Junior Realce 39 Crescimento das bactérias É um somatório dos processos metabólicos progressivos, que normalmente conduz à divisão (reprodução – divisão binária ou brotamento) com produção de duas células-filhas a partir de uma bactéria. Dessa forma, o crescimento é exponencial (crescimento logarítmico). Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e não ao aumento das dimensões celulares. Fatores limitantes do crescimento bacteriano A oferta de nutrientes é o principal fator que limita o crescimento bacteriano. Outros fatores importantes no crescimento bacteriano são: Temperatura: Algumas bactérias crescem melhor em temperaturas baixas, outras em temperaturas intermediárias e outras em temperaturas altas. A temperatura ótima de crescimento é aquela em que o microrganismo cresce mais rapidamente. Em temperaturas mais favoráveis para o crescimento, o número de divisões celulares por hora, chamada de taxa de crescimento, dobra para cada aumento de temperatura de 10ºC. Há três temperaturas importantes a conhecer: mínima, ótima e máxima (nessa última as enzimas são danificadas pelo calor e a célula para de crescer). De acordo com a temperatura de crescimento, é possível distinguir, pelo menos, três grupos fisiológicos de bactérias: as psicrófilas têm temperatura ótima de crescimento entre 15 - 25ºC; as mesófilas têm temperatura ótima de crescimento entre 25 - 45ºC; e as termófilas têm temperatura ótima de crescimento entre 45 - 80ºC. pH: Quanto à tolerância ao pH, as bactérias podem ser acidófilas, neutrofílicas e alcalófilas. Normalmente, o pH ótimo é bem definido para cada espécie e a maioria das bactérias não cresce em valores de pH acima ou abaixo de seu pH ótimo. Oxigênio: Quanto à respiração, as bactérias podem ser: aeróbias estritas (necessitam de O2 para crescer), anaeróbias estritas (só crescem na ausência de O2), microaerofílicas (precisam de O2, mas em pressão inferior à atmosférica) e anaeróbias facultativas ou aerotolerantes (crescem na presença ou ausência de O2). Junior Realce 40 Água: Essencial a qualquer microrganismo; embora a necessidade seja variada, somente endósporos bacterianos podem sobreviver sem água. 6.5 Divisão das bactérias Fonte: brasilescola.uol.com.br As bactérias são divididas em dois grandes grupos: As eubactérias apresentam composição da parede celular diferente das arqueobactérias, que frequentemente aparecem aos pares, em cadeias, formando tétrades ou agrupadas. Algumas apresentam flagelos, favorecendo seu deslocamento rapidamente em líquidos. São de grande importância na natureza e na indústria, sendo essenciais na reciclagem de lixo orgânico e na produção de antibiótico como a streptomicina. As infecções causadas pelas eubactérias incluem as streptococica de garganta, tétano, peste, cólera e tuberculose. As arqueobactérias assemelham-se as eubactérias quando observadas por meio de um microscópio, mas existem diferenças importantes quanto a sua composição química, a atividade e ao meio ambiente em que se desenvolvem tais como em elevada concentração de salina ou acidez elevada e altas temperaturas a exemplo de piscinas térmicas e lagoas salinas. 41 7 FUNGOS Fonte: melhorcomsaude.com.br Os fungos são organismos eucariontes, aclorofilados, heterotróficos e absorve componentes orgânicos como fonte de energia. São aeróbicos em sua grande maioria, mas alguns são anaeróbicos estritos e facultativos. Podem ser unicelulares ou multicelulares e reproduzem-se sexuada ou assexuadamente. Possuem parede celular rígida que pode ser composta de celulose, glicanas, mananas ou quitina e membrana celular com esteróis presentes. Seu principal material de reserva é o glicogênio. O glicogênio tem função preponderante de armazenamento energético nas células animais. Possui cadeia nas quais as unidades de glicose se unem mediante ligações (α1→ 4). Amido e glicogênio são altamente hidratados devido à quantidade de hidroxilas que formam ligações de hidrogênio com a água. A estrutura do glicogênio é similar à amilopectina. A diferença é a frequência de ramificações, as quais aparecem de 8 a 12 unidades de glicose. (MARCONDES 2003, apud FRANCISCO 2008, p. 2). Os fungos, em sua maioria, são constituídos por filamentos microscópicos e ramificados, as hifas. O conjunto de hifas de um fungo constitui o micélio. Os fungos têm nutrição heterotrófica porque necessitam de matéria orgânica, provenientes dos alimentos, para obtenção de seus nutrientes. Os mais conhecidos são os bolores, os cogumelos, as orelhas-de-pau e as leveduras (fermentos). 42 A maioria vive no solo, alimentando-se de cadáveres de animais, de plantas e de outros seres vivos. Esse modo de vida dos fungos causa o apodrecimento de diversos materiais e por isso são chamados de saprofágicos. Certas espécies de fungos são parasitas e outras vivem em associações harmoniosas com outros organismos, trocando benefícios. Os fungos estudados em microbiologia compreendem as leveduras e os bolores. As leveduras são unicelulares, não filamentosas, apresentam em média de 1 a 5 µm de diâmetro e de 5 a 30 µm de comprimento. Elas são geralmente ovais, podendo apresentar morfologia alongada ou esférica. As leveduras não possuem flagelos, são imóveis. Os bolores são organismos pluricelulares, que se apresentam filamentosos ao microscópio óptico a fresco com baixa ampliação. Ao exame macroscópico apresentam crescimento característico com aspecto aveludado ou cotonoso (algodão) ou como borra de café (Aspergillus niger). 7.1 Características dos fungos em relação às bactérias Os fungos são geralmente adaptados a ambientes que poderiam ser hostis às bactérias. São encontrados na superfície de alimentos formando colônias algodonosas e coloridas. Todavia, diferem das bactérias em determinadas necessidades ambientais e nas características estruturais e nutricionais apresentadas a seguir: • Apresentam a parede celular com presença de substâncias quitinosa e células com organelas membranosas (mitocôndrias, complexo de golgi, vacúolo). • Não possuem células móveis em todos os estágios do ciclo de vida. • Reserva de energia na forma de glicogênio. • Os fungos normalmente crescem melhores em ambientes em que o pH é muito ácido, o qual são desfavoráveis para o crescimento da maioria das bactérias comuns. • Quase todos possuem forma aeróbica. Algumas leveduras são anaeróbicas facultativas. • A maioria dos fungos é mais resistente à pressão osmótica que as bactérias; muitos, consequentemente, podem crescer em altas concentrações de açúcar ou sal. 43 • Podem crescer sobre substâncias com baixo grau de umidade, geralmente tão baixo que impede o crescimento de bactérias. • Necessitam de menos nitrogênio para um crescimento equivalente ao das bactérias. • São capazes de metabolizar carboidratos complexos, tais como lignina (madeira), que as bactérias não podem utilizar como nutriente. As características citadas, anteriormente, mostram que os fungos se desenvolvem em substratos diversos como paredes de banheiro, couro de sapatos e jornais velhos. 7.2 Tipos de alimentação
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