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Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna Estudo Dirigido de Biologia celular I para AP1 Aula 1 - Microscopia óptica 1) Quando surgiu o primeiro microscópio ? No século XVII, mesma época que Robert Hook observou pela primeira vez uma célula em lâminas de cortiça. 2) Quem foi Robert Hook ? Um inglês, pioneiro na microscopia, hoje conhecido como o Homem dos 7 instrumentos. Deu sua contribuição em vários ramos da ciência, como a Física, a Astronomia, Química, Biologia, Geologia, Arquitetura, etc. Hook desenvolveu um microscópio composto que usava para examinar insetos, esponjas e finas lâminas de cortiça, onde descobriu a existência das células. 3) Qual é a importância de cada um dos itens citados a seguir pra a observação ao microscópio óptico: fonte de luz, espessura e contraste da amostra ? ♦ Fonte de luz: atravessar a amostra pra formar a imagem na retina do observador; ♦ Lente condensadora: concentrar a luz, aumentando a intensidade do feixe; ♦ Espessura e contraste da amostra: quanto mais espessa a amostra, menos a luz irá atravessa-la, maior será o contraste e menor a visibilidade dos detales. 4) Quem foi Antony Van Leeuwenhoek ? Outro pioneiro no ramo da microscopia. Ele fez descobertas fundamentais no ramo da Biologia, como as bactérias e os protozoários. Ele não era um cientista convencional como os de sua época, pois era filho de comerciantes, sem fortuna e sem educação universitária, ainda assim, com sua habilidade extraordinária para polir lentes de microscópio e sua grande curiosidade e mente aberta, livre dos dogmas científicos, foi o primeiro a descrever as hemácias, os espermatozóides e muito mais. Seus microscópios, embora com uma única lente, eram capazes de aumentar até 200 vezes o objeto. 5) Como funciona um microscópio óptico? Uma fonte de luz concentrada sobre a lente é condensada sobre a amostra. O feixe de luz vai atravessar a amostra e ser captado por uma das lentes objetivas do revolver. Essa lente objetiva irá produzir a primeira imagem ampliada, que será captada pela lente ocular que irá projetar a imagem final na retina do observador. O aumento no microscópio óptico é resultado da multiplicação dos valores da lente objetiva pelo aumento da lente ocular. 6) O que é e do que depende o poder de resolução de um microscópio? Limite de resolução é a menor diatânca em que 2 pontos podem ser distinguidos como individuais. Esse poder de resolução depende das lentes, da intensidade da luz e de outros fatores mais. 7) Uma hemácia mede 8 micrômetros. Quando observada sob um aumento total de 1.000 vezes, quanto medirá ? 8.000 micrômetros. 8) Uma célula foi fotografadacom 2.000x de aumento no microscópio óptico. Uma estrutura que tenha na realidade 2 micrômetros, aparecerá com quanto cm ? 2000 X 2 = 4000 micrômetros = 4 mm = 0,4 cm. Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna 9) Por que em geral o núcleo é a única estrutura claramente visível dentro de uma célula observada ao microscópio óptico ? Devido ao seu tamanho e localização. As outras estruturas ou são muito pequenas ou aparecem como túbulos ou vesículas dentro da célula. 10) Quando chamamos um aumento de aumento vazio ? Quando há um aumento, mas sem resolução. 11) Como é feito o preparo de amostras para o microscópio óptico de campo claro ? Para que possam ser guardadas por muito tempo, as amostras de células e tecidos precisam em geral de um tratamento químico que garanta sua preservação. Esse tratamento inclui várias etapas: a) Fixação: é o tratamento da amostra com substâncias químicas, como o formol, que preservem sua forma original. b) Desidratação: é a substituição da água presente dentro e fora das células por um solvente orgânico, como o etanol ou metanol. Esse solvente tanto pode ser removido, deixando a lâmina secar, quanto pode ser substituído por parafina ou outra resina que torne o tecido rígido, permitindo que seja fatiado. c) Microtomia: é a fatiação dos tecidos, pois alguns tecidos como fígado ou músculo são muito espessos apenas fatiados eles permitem a passagem parcial da luz. Para isso, devem ser embebidos em parafina, e quando solidificado pode ser cortado (fatiado). d) Coloração: como a maioria das células e seus componentes não são naturalmente coloridos, são usados uma série de corantes que tem afinidade química por determinados componentes celulares, assim, pode-se identificar os diferentes compartimentos celulares. O azul de metileno é um desses corantes. 12) Em que tipo de microscópio podemos observar amostras vivas e sem a adição de corantes? Nos microscópios de contraste de face e no de contraste interferencial. 13) O que vc pode entender sobre microscopia de Fluorescência? No microscópio de4 fluorescência a amostra é tratada comum corante fluorescente e iluminada com uma fonte de luz ultravioleta, capaz de fazer com que apenas as áreas onde o corante se fixou apareçam na imagem. 14) Em que tipo de amostra e em qual situação deve-se usar os seguintes microscópios ópticos: a) Microscópio de campo claro Æ (amostra morta e fina) esse microscópio não permite visualizar uma amostra viva. Requer que a amostra seja preparada com corantes e fatiada, ficando fina o suficiente para que a luz consiga ultrapassa-la; b) Microscópio de contraste de faceÆ (amostra viva e fina) esse microscópio permite a visualização de amostras vivas, pois não precisa de corante, mas se a amostra não pode ser muito espessa, senão terá que ser fatiada e morta; c) Microscópio de contraste interferencialÆ(amostra viva e espessa) tb permite observar células vivas, mas nesse, não importa se a amostra é mais espessa, ela não precisa ser fatiada. d) Microscópio de fluorescênciaÆ esse requer o uso de corantes fluorescentes. Em algumas situações a célula pode ser observada viva, outras não; e) Microscópio confocal de varredura a laserÆ fornece imagens tridimensionais na trela de um computador, podendo ser observadas as organelas intercelulares. Aula 2 – Princípios de funcionamento dos microscópioseletrônicos Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna 15) Comente sobre o microscópio eletrônico? Esse tipo de microscópio utiliza um feixe de elétrons para produzir uma imagem ampliada de um objeto. Essa família é composta por dois tipos de microscópios: os microscópios eletrônicos de transmissão e os microscópios eletrônicos de varredura. Os de transmissão se baseiam na capacidade do feixe de elétrons de atravessar a amostra, enquanto nos de varredura o feixe de elétrons percorre a superfície da amostra gerando um sinal que será visualizado num monitor. 16) Quais são as diferenças do Microscópio eletrônico de transmissão para o óptico? O microscópio eletrônico de transmissão é idêntico ao microscópio óptico na montagem de seus itens básicos apenas é maior e invertido. As principais diferenças são: a fonte: luz visível no microscópio óptico e feixe de elétrons no microscópio eletrônico de transmissão; o vácuo na coluna do microscópio eletrônico de transmissão. É necessário não apenas para impedir a combustão do filamento na presença de oxigênio como também para impedir a colisão do feixe de elétrons com moléculas do ar. as lentes: de vidro no microscópio óptico e eletromagnetos no microscópio eletrônico de transmissão. As lentes magnéticas desviam e orientam o feixe de elétrons da mesma forma que as lentes de vidro desviam e orientam o feixe de luz; a espessura da amostra: a amostra precisa ser cortada em fatias muito finas para ser atravessada pelos elétrons. 17) Como é feito o preparo de amostras para ser observadas num microscópio eletrônico ? 1– Fixação: Em geral é feita mergulhando as células ou tecidos em soluções que estabilizam as membranas e os constituintes celulares na forma o mais próxima possívelda in vivo. Os mais utilizados são o e o glutaraldeído, superior ao formol e por isso mais utilizado do que este. Essas substâncias, chamadas fixadores, são empregadas diluídas em tampões, que ajudam a manter o pH e a osmolaridade da solução fixadora o mais próximas possível das condições vitais. Dessa maneira evita-se a deformação ou o rompimento das estruturas celulares. 2– Pós-fixação e contrastação: Como os seres vivos são compostos basicamente por átomos leves que desviam pouco ou nada a passagem do feixe de elétrons, são utilizadas soluções de sais de metais pesados (Fe, Os, Ur, Pb), que, além de melhorarem a preservação das células, aumentam o contraste das amostras quando observadas ao microscópio eletrônico de transmissão. Esses sais se impregnam seletivamente nas membranas, no DNA ou em outros componentes celulares, facilitando a visualização dessas estruturas. 3– Desidratação, inclusão e microtomia: A fixação confere preservação às células; entretanto, o fato de serem em geral muito espessas e hidratadas para que o feixe de elétrons possa atravessá-las também é um obstáculo a ser superado. Para isso as amostras têm toda sua água substituída, inicialmente por um solvente orgânico como álcool etílico ou acetona, e em seguida por uma resina que, inicialmente, é líquida, mas nas condições adequadas (em geral ao ser aquecida) endurece, permitindo que as amostras sejam cortadas em fatias finas o suficiente para que os elétrons possam passar nas áreas em que não se impregnaram os metais pesados. 18) Qual a principal diferença do microscópio eletrônico de transmissão par o de varredura? A imagem do MET é bidimensional devido aos cortes finos feitos nas amostras, já o de varredura as imagens são tridimensionais. O de transmissão se baseia na capacidade Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna do feixe de elétrons de atravessar a amostra, enquanto no de varredura o feixe de elétrons percorre a superfície da amostra gerando um sinal que será visualizado num monitor. 19) Quando deve ser usado o microscopia eletrônica de transmissão ? Quando se deseja obter informações das organelas intercelulares. Nesse microscópio é impossível a observação de células vivas, pois as células passam por vários processos de preparação e são cortadas em fatias muito finas. 20) Quando deve ser usado a microscopia de varredura? Quando se quizer obter informações sobre a forma externa das amostras (sejam elas células, folhas, insetos, dentes, pêlos etc.), estas não são cortadas em fatias. È impossível a observação de uma célula viva, pois a célula vai sofrer vários processos de preparação, como tratamento com soluções fixadoras, a secagem do material (para remover toda a água, já que esse microscópio também opera sob vácuo) e seu revestimento com ouro ou outro elemento condutor, para geração do sinal 21) Comente sobre o microscópio eletrônico de alta voltagem. Enquanto no microscópio eletrônico de transmissão convencional o feixe de elétrons é acelerado de 50 a 80 KV, permitindo a observação de amostras até 100-150 nm de espessura, no microscópio eletrônico de transmissão de alta voltagem a aceleração do feixe é de até 1.000 KV. Isso permite a observação de amostras bem mais espessas (até 2 µm!). 22) Quando se deve usar o microscópio de varredura de alta resolução? Quando o objetivo é observar detalhes que passam despercebidos na varredura convencional. Organelas e filamentos do citoesqueleto que normalmente não são visíveis ao microscópio eletrônico de varredura podem ser vistas aqui. 23) Quando se deve usar o Microscópio de varredura de pressão variável? Qual é sua desvantagem? Quando o objetivo é observar amostras vivas e frescas sem nenhum tratamento químico e sem o processo de secagem e obter uma maior resolução que a microscopia óptica. 24) Faça uma tabela comparando o poder de resolução, a natureza das lentes e o tipo de emissão do filamento do microscópio eletrônico de transmissão em relação ao microscópio óptico. Microscópio óptico Microscópio Eletrônico Poder de resolução 2 micrômetros 2 nanômetros Lentes De vidro Eletromagnéticas Emissão de filamentos Luz visível Elétrons (radiação não visível) 25) Se a área de observação na tela de um microscópio eletrônico mede 9 X 9cm e uma célula mede cerca de 30 micrômetros, qual é o maior aumento com o qual poderemos observar toda sua circunferência ? 30 micrômetros = 30 x 10 –4 cm 9/30 x 10 –4 = 3 x 10 –3 = 3000 26) As células são hidratadas e, mesmo sendo formadas de elementos leves, são muito espessas para permitir a passagem de um feixe de elétrons. Quais os principais Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna processos a que precisam ser submetidas antes da observação no microscópio de transmissão? Fixação, para estabilizar a estrutura química. 27) Por que é necessário que a coluna do microscópio eletrônico permaneça sob o vácuo ? Para que os elétrons não sejam barrados ou desviados por moléculas de ar (Oxigênio, gás carbônico e vapor de água) na coluna. O oxigênio também causaria combustão do filamento. Aula 3 – Criofatura 28) Quais são os procedimentos básicos para criofatura? • Fixação: manter a estrutura geral da célula; • Infiltração com glicerol: o glicerol impede a formação de cristais de gelo durante o congelamento. Os cristais perfurariam e destruiriam a célula; • Fratura: feita a baixa temperatura e sob vácuo, expõe as superfície das membranas plasmática e das organelas intracelulares. • Evaporação com platina: feita em ângulo de 45 o visa criar áreas sombreadas segundo o relevo das proteínas de membrana e estruturas celulares. • Evaporação com Carbono: feita homogeneamente por toda a réplica cria uma “base”, sendo o carbono transparente ao feixe de elétrons. • Limpeza da réplica: feita com ácidos ou bases fortes. Remove restos celulares que estejam grudados na réplica. • Lavagem: feita com água. Depois dela a réplica é recolhida sobre uma grade e levada ao microscópio eletrônico de transmissão. 29) Explique detalhadamente as etapas da criofatura. Fixação Æ Antes do congelamento, a célula deve ser fixada para preservar suas estruturas como. Se congelarmos uma célula ela iria formar cristais de gelo que poderiam perfura-las. Para que isso não ocorra, antes de congelar a célula, as amostras devem ser fixadas em Glicerol (substância que dificulta a formação de cristais de gelo, ele se liga a moléculas como DNA, proteínas, lipídios com a função de unir essas moléculas como se a célula ainda estivesse viva). Congelamento Æ um fator que impede a formação desses cristais é um congelamento ultra-rápido feito no Nitrogênio líquido; Fratura Æcom a amostra já congelada, vamos fazer a fratura do bloco de gelo formado. Essa fratura é feita numa câmara a vácuo, a baixa temperatura e a pressão constante. O bloco de gelo pode quebrar em 3 lugares diferentes: em cima da célula, em baixo da célula e no meio da célula, o lugar que nos interessa. A probabilidade de uma fratura perfeita é muito pequena, por isso vaias amostras devem ser preparadas. Replicação Æ ainda sob vácuo, alta temperatura, a superfície de gelo que foi quebrado ao meio, vai receber um bombardeamento de carbono, num ângulo de 90°, atingindo assim, os vales das células. Logo após, irá receber um bombardeamento de platina (metal pesado), num ângulo de 45° para contornar as laterais da célula e melhorar o contraste. Depois disso, já se tem uma réplica da superfície da célula, é feita a limpeza dessa réplica com ácidos ou bases fortes. Isso, irá remover os restos celulares que estejam grudados na réplica. Depois de remover os restos celulares, é feita a lavagem, onde a réplica é colocada em água sanitária para extrair toda água e ficar apenas a película de platina e carbono. Depoisda réplica pronta, ela é recolhida em uma grade e levada ao microscópio de transmissão. 30) Qual é a parte da membrana que é exposta na fratura? Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna O plano médio, isto é, aquele para onde convergem as caudas hidrofóbicas dos fosfolipídeos. 31) A que correspondem as partícula intramembranosas observadas nas réplicas? Às proteínas integrais da membrana. 32) Qual é a contribuição da criofatura na elaboração do modelo do mosaico fluído? Mostrou que as proteínas se inserem na bicamada lipídica, podendo ser de diferentes tamanhos e estar distribuídas aleatoriamente (ao acaso) ou formando arranjos como linhas paralelas, círculos, aglomerados, etc. Daí a comparação a um mosaico. Aula 4 – Cultura de células 33) O que significa cultivar células? Manter vivas as células retiradas de um organismo. 34) Como se faz uma cultura? As culturas podem ser preparadas diretamente de tecidos retirados de um animal. Nesse caso, são chamadas de culturas primárias. Grupos de células que são retirados das culturas primárias e continuam a crescer in-vitro, dão origem a culturas secundárias. Esse processo pode ser repetido várias vezes, mantendo as células por semanas ou meses. 35) Do que precisa uma célula em cultura? Para que uma célula sobreviva in-vitro devem ser garantidas condições de temperatura e umidade semelhante a do organismo onde ela se originou. Além disso, o ambiente precisa ser mantido livre de bactérias, fungos e outros microorganismos que podem contaminar a cultura de células. As células também precisam nutrir-se, por tanto o meio de cultura deve conter todos os nutrientes necessários para o metabolismo de cada tipo celular em cultivo. As células em cultura também produzem excreções que modificam a acidez do meio e podem intoxicar e matar as células em cultivo. Tais substâncias precisam ser removidas, seja pela substituição do meio de cultura, seja pela transferência de grupos de células para placas ou garrafas com meio novo. 36) O que é um meio de cultura e como ele deve ser para que a cultura de certo? É uma mistura de moléculas necessárias à nutrição da célula. Originalmente era utilizado o soro de animais como cavalo e boi. Também foi muito empregado o extrato de embriões de galinha. Atualmente existem muitas formas quimicamente definidas, em que se pode avaliar o efeito da omissão ou adição de determinado componente sobre o comportamento das células. Além de aas. , açúcares, vitaminas e sais minerais, geralmente entram na composição dos meios de cultura proteínas do soro, antibióticos e fungicidas, estes dois últimos para diminuir o risco de contaminação. O meio de cultura deve ter osmolaridade e pH adequados para o tipo celular em estudo. 37) Quais os requisitos básicos para manutenção de células em cultura? As células, para serem mantidas em cultura, devem estar em ambiente estéril, a temperatura, pressão e pH dentro de uma faixa que permita sua sobrevivência e multiplicação. O meio de cultura deve conter ainda todos os nutrientes necessários (proteínas, açúcares, lipídeos, sais minerais) e fatores de crescimento, como vitaminas e hormônios. 38) O que você entende por células in vitro? E in vivo? Cultivar in vitro consiste em retirar células de um organismo e fazê-las sobreviver em um recipiente como uma placa de Petri, tubo de ensaio ou outros. Algumas células se Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna multiplicam in vitro, outras apenas sobrevivem e se diferenciam, geralmente aderindo às paredes do vidro ou plástico do recipiente. In vivo consiste em manter células dentro de um organismo, que será seu hospedeiro. Alguns protozoários parasitas, como o Toxoplasma gondii, são normalmente mantidos em camundongos, já que morrem rapidamente se não penetrarem em outras células. Alguns heterocárions formam tumores que secretam anticorpos de interesse para os pesquisadores. Esses tumores também são mantidos por passagem entre animais. 39) Por quanto tempo uma cultura deve ser mantida? Num organismo, cada tipo celular é programado para um determinado número de divisões e tempo de vida. Por Exemplo, as células da nossa pele estão constantemente sendo renovadas, graças as as divisões das células das camadas mais profundas. Essas culturas matem in-vitro as mesmas características dos tecidos de onde se originaram. 40) O que é uma cultura primária? É uma cultura inicial, obtida a partir de células extraídas de um animal. 41) O que são linhagens celulares estabelecidas? Quando tiramos uma amostra de um tecido e se coloca in-vitro, temos uma cultura primária. Para que a células não morram, o meio de cultura deve ser trocado, pois estão cheios dos restos metabólicos celulares. Para que isso não ocorra, deve-se trocar o meio de cultura (repique). Esse repique é feito várias vezes. Depois desses repiques, chamamos as células dessa cultura, de células estabelecidas. Nesse meio, as células se dividem ilimitadamente, pois ela “gosta” desse meio. As células estabelecidas conseguem manter-se iguais às do tecido original por anos. 42) Diferencie uma célula transformada para uma célula cancerosa. Tanto a célula tumoral quanto a transformada podem se multiplicar indefinidamente; entretanto, a célula transformada guarda as características do tipo celular que lhe deu origem (e.g., a cultura de células epiteliais transformadas forma uma camada com as células unindo-se entre si, como num epitélio normal), enquanto a célula cancerosa cresce desorganizadamente, formando grumos ou massas. 43) Uma linhagem é um clone? Não, um clone só é formado quando a cultura é derivada da multiplicação de uma única célula e não de várias células diferentes. 44) O que é um heterocáriom? É a fusão induzida entre duas células de origens diferentes formando apenas uma célula. A célula resultante dessa fusão contém dois núcleos com material genético das duas células. Por essa célula ter dois núcleos, ela é chamada de heterocariom. 45) O que é um hibridoma? ♦ Quando se induz a fusão de duas células e o núcleo dessas duas se fundem. ♦ É uma célula formada pela fusão de dois tipos celulares diferentes. Seu núcleo reúne o DNA das duas células originais e ela se comporta combinando características das duas células originais. 46) Da fusão de uma célula tumoral com uma célula secretora forma obtidos heterocárions com as seguintes características: a) Células com baixa capacidade de divisão, mas alta atividade secretora; b) Células com alta capacidade de divisão e baixa atividade secretora; c) Células com alta capacidade de divisão e alta atividade secretora; d) Células com baixa capacidade de divisão e baixa atividade secretora. Qual desses heterocárions será mais interessante? Justifique sua resposta. Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna C, pois com a alta taxa de multiplicação, será mais rápida a obtenção de grandes quantidades da proteína secretada. 47) O que são células-Tronco? São células pluripotentes, que ao se multiplicar podem dar origem a todos os tipos celulares que constituem um organismo.
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