Atividades de hidrolase de sais biliares_ um novo alvo para rastrear lactobacilos anti-Giardia_

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PESQUISA ORIGINAL
publicado: 08 de fevereiro de 2018
doi: 10.3389 / fmicb.2018.00089
Editado por:
Andrea Gomez-Zavaglia,
Centro de Investigación y
Desarrollo en Criotecnología
de Alimentos (CIDCA), Argentina
Revisados pela:
Siddhartha Das,
Universidade do Texas em El Paso,
Estados Unidos
Paula Carasi,
Consejo Nacional de Investigaciones
Científicas y Técnicas (CONICET),
Argentina
*Correspondência:
Luis G. Bermúdez-Humarán
luis.bermudez@inra.fr
Isabelle Florent
isabelle.florent@mnhn.fr
† Endereço atual:
Marie-Agnès Travers,
Laboratoire de Génétique et
Pathologie des Mollusques Marins,
SG2M-LGPMM, Ifremer,
La Tremblade, França
Seção de especialidades:
Este artigo foi submetido a
Microbiologia Alimentar,
uma seção do jornal
Fronteiras em Microbiologia
Recebido: 26 de setembro de 2017
Aceito: 15 de janeiro de 2018
Publicado: 08 de fevereiro de 2018
Citação:
Allain T, Chaouch S, Thomas M,
Travers MA, Valle I, Langella P,
Grellier P, Polack B, Florent I e
Bermúdez-Humarán LG (2018) Bile
Atividades de hidrolase de sal: um romance
Alvo para rastrear o Anti-Giardia
Lactobacilos? Frente. Microbiol. 9:89.
doi: 10.3389 / fmicb.2018.00089
Atividades de hidrolase de sal biliar:
Um novo alvo para triagem
Anti-Giardia Lactobacilli?
Thibault Allain 1,2 , Soraya Chaouch 2 , Myriam Thomas 3,4 , Marie-Agnès Travers 2 † ,
Isabelle Valle 3,4 , Philippe Langella 1 , Philippe Grellier 2 , Bruno Polack 3,4 , Isabelle Florent 2 *
e Luis G. Bermúdez-Humarán 1 *
1 INRA, Laboratório de Interações Comensais e Probióticos-Hospedeiro, Instituto Micalis, AgroParisTech, Paris, França,
2 UMR 7245, Muséum National d'Histoire Naturelle, Centre National de la Recherche Scientifique, Sorbonne Universités,
Paris, França, 3 INRA, Ecole Nationale Vétérinaire d'Alfort, BIPAR, ENVA, ANSES, UMR, Université Paris-Est,
Champs-sur-Marne, França, 4 INRA, Laboratoire de Santé Animale, BIPAR, ENVA, ANSES, UMR, Maisons-Alfort, França
Giardia duodenalis é um protozoário parasita responsável pela giardíase, uma doença
caracterizado por má absorção intestinal, diarreia e dor abdominal em um grande
número de espécies de mamíferos. A giardíase é um dos parasitas intestinais mais comuns
doenças no mundo e, portanto, uma grande preocupação veterinária e de saúde pública. Está bem-
estabeleceu que algumas bactérias probióticas podem conferir proteção contra este parasita
in vitro e in vivo e recentemente documentamos a implicação da hidrolase do sal biliar
(BSH) -like atividades da cepa La1 de Lactobacillus johnsonii como mediadores destes
efeitos in vitro. Mostramos que essas atividades foram capazes de gerar desconjugação
sais biliares que eram tóxicos para o parasita. No presente estudo, uma ampla coleção de
cepas de lactobacilos de diferentes origens ecológicas foram testadas para testar seu anti-
efeitos giardial. Nossos resultados revelaram que os efeitos antiparasitários de algumas das cepas
testados foram bem correlacionados com a expressão de atividades semelhantes a BSH. Os dois mais
cepas ativas in vitro, La1 e Lactobacillus gasseri CNCM I-4884, foram então testadas para
sua capacidade de influenciar a infecção por G. duodenalis em um modelo de camundongo lactente. Surpreendentemente,
apenas L. gasseri CNCM I-4884 cepa foi capaz de antagonizar significativamente o crescimento do parasita
com uma redução dramática da carga de trofozoítos no intestino delgado. Além disso,
esta cepa também reduziu significativamente a excreção fecal de cistos de Giardia após 5 dias
de tratamento, o que poderia contribuir para o bloqueio da transmissão do parasita, em
contraste de La1 onde nenhum efeito foi observado. Este estudo representa um passo em direção ao
desenvolvimento de novas estratégias profiláticas para combater a infecção por G. duodenalis em ambos
humanos e animais.
Palavras-chave: Giardia duodenalis, lactobacilli, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus gasseri, probióticos, sal biliar
hidrolases
INTRODUÇÃO
Giardia duodenalis (também conhecida como G. lamblia ou G. intestinalis) é o agente etiológico da
doença zoonótica giardíase, uma das infecções parasitárias transmitidas pela água mais comuns em todo o mundo.
G. duodenalis é um protozoário flagelado (Excavata, Diplomonad) que infecta uma ampla diversidade
de animais como humanos, mamíferos, répteis e pássaros ( Thompson e Monis, 2004, 2012 ).
A transmissão pode ocorrer pela ingestão de cistos viáveis de água e solo contaminados, ou
diretamente pelo contato com as fezes de um animal infectado ( Gardner e Hill, 2001 ). Após a ingestão,
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Allain et al. Papel da BSH no Efeito Antigiardial dos Lactobacilos
a exposição ao ácido gástrico e proteases no estômago leva a
excistação e liberação de estágios de trofozoíto replicativos que
aderir transitoriamente ao intestino delgado proximal e persistir
por vários dias (por até vários meses em alguns casos)
( Reiner et al., 2003 ). Após este estágio replicativo e patogênico,
trofozoítos são transportados para o cólon e encistam progressivamente.
Os cistos, liberados pelas fezes do hospedeiro, podem então sobreviver no
ambiente por vários meses e permanecer infeccioso em baixa
doses ( Thompson et al., 1993 ).
Os principais sintomas clínicos da giardíase são agudos ou crônicos
diarreia, dor abdominal, má absorção intestinal, esteatorreia,
e perda de peso ( Farthing, 1996 ; Buret, 2007 ). Considerado como
uma ameaça à saúde pública e uma preocupação veterinária em todo o mundo,
a giardíase é responsável por muitos surtos de diarreia transmitida pela água
em países desenvolvidos ( Roxstrom-Lindquist et al., 2006 ;
Buret, 2007 ). Em humanos, afeta principalmente crianças e
indivíduos subnutridos ou imunossuprimidos. Apesar de
a giardíase pode ser autolimitada, terapias antibióticas padrão
incluindo drogas 5-nitroimidazol e benzimidazol são necessárias
para tratar infecções de longo prazo ( Savioli et al., 2006 ). Em mamíferos,
As infecções por G. duodenalis são comuns em animais de companhia,
pequenos ruminantes e gado, para os quais os tratamentos alternativos são
muito limitado ( Harris et al., 2001 ).
O número crescente de falhas em ensaios clínicos e o
emergência de cepas resistentes de Giardia tanto na área médica quanto
aplicações veterinárias têm incentivado o desenvolvimento de novos
estratégias terapêuticas ( Harris et al., 2001 ; Upcroft e Upcroft,
2001 ). Neste contexto, foi estabelecido que a microbiota intestinal
desempenha um papel fundamental na proteção contra enteropatógenos
através da produção de compostos antimicrobianos e por
competição por nutrientes e fixação à superfície da mucosa
( Travers et al., 2011 ; Bengmark, 2013 ). Em particular, probiótico
bactérias, como algumas cepas de lactobacilos, foram mostradas
para conferir benefícios à saúde do hospedeiro, melhorando o inato e o adaptativo
respostas imunes ( Sanders, 2008 ; Martin et al., 2013 ; Sokol,
2014 ). Além disso, estudos pré-clínicos sugerem que a colonização
do intestino delgado por trofozoítos de G. duodenalis depende
sobre a composição da microbiota intestinal do hospedeiro ( Singer e Nash,
2000 ; Barash et al., 2017 ; Bartelt et al., 2017 ). Recentemente
anos, terapias baseadas em probióticos têm sido exploradas para tratar
giardíase ( Allain et al., 2017 ). Por exemplo, alguns lactobacilos
cepas como Lactobacillus johnsonii La1 (também conhecido como NCC533
mas doravante denominado La1), Lactobacillus casei MTCC1423 e
Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), foi mostrado para exibir
propriedades anti-giardiais por (i) antagonizar a proliferação
de trofozoítos e, (ii) reduzir a gravidade da infecção em
vários modelos murinos ( Humen et al., 2005 ; Shukla et al.,
2008 ; Goyal et al., 2011 ; Travers et al., 2011 ). Enquanto o
mecanismos moleculares permanecemmal compreendidos, temos
descobriu recentemente o envolvimento de sais biliares desconjugados,
gerado pela hidrólise de sais biliares conjugados da bile
pela cepa La1, como um dos mecanismos que contribuem para a
inibição do crescimento do trofozoíto de Giardia in vitro ( Perez et al.,
2001 ; Travers et al., 2016 ). Nossa hipótese era que estes
sais biliares desconjugados foram produzidos por hidrolase de sais biliares
(BSH) -like enzimas liberadas ou secretadas por esta cepa ( Travers
et al., 2016 ).
No estudo atual, selecionamos uma ampla coleção de
cepas de lactobacilos de várias origens ambientais, a fim de
para determinar sua capacidade de exibir um efeito anti-giardial.
A análise in vitro de amostras de lactobacilos sobrenadantes levou ao
identificação de várias cepas com uma forte atividade inibitória
contra o crescimento de G. duodenalis (até o nível relatado anteriormente
para La1). Paralelamente, mostramos que o anti-Giardia in vitro
atividade exibida por algumas dessas cepas de lactobacilos é claramente
correlacionados com suas atividades semelhantes a BSH in vitro. As duas cepas
exibindo os efeitos inibitórios mais fortes: La1 e Lactobacillus
gasseri CNCM I-4884, foram então avaliados in vivo em um lactente
modelo de camundongo desafiado com a cepa WB6 de G. duodenalis. Nosso
os resultados mostraram que L. gasseri CNCM I-4884 apresentou um maior
efeito anti-giardial in vivo do que La1, com um quase completo
eliminação da infecção por Giardia em ratos lactentes. Estes achados
mostram que uma triagem com base na detecção de atividades de BSH é um
ferramenta promissora para identificar novas cepas anti-Giardia lactobacilli.
No geral, nosso estudo abre novas estratégias terapêuticas para ambos
prevenção e tratamento da giardíase em humanos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Condições de cultura de Giardia duodenalis
Giardia duodenalis foi cultivada in vitro, conforme descrito recentemente
( Travers et al., 2016 ). Trofozoítos de G. duodenalis cepa WB
clone 6 (WB6) assemblage A1 (ATCC 50803) foram cultivadas em
Meio TYI-S-33 modificado de Keiser (KM) ( Morrison et al.,
2007 ). O meio KM foi suplementado com 10% inativado por calor
soro fetal de vitela (FCS, referência A15-101, PAA Laboratories, GE
cuidados de saúde), ajustado para pH 6,0 e esterilizado com 0,22 µm
filtro. Trofozoítos de G. duodenalis WB6 foram subcultivados em
condições anaeróbicas a 5 ⇥ 10 4 células por ml após resfriamento em
gelo por 10 min e centrifugado a 700 ⇥ g, 5 min. Alíquotas eram
congelado em nitrogênio líquido e armazenado a 80 ° C até novo uso.
Para experimentos in vitro e in vivo, culturas de 48 h de confluentes
trofozoítos foram peletizados a 700 ⇥ g, 5 min após o resfriamento no gelo
por 10 min e ressuspenso nas concentrações necessárias.
Estirpes bacterianas e condições de cultura
A coleção de bactérias utilizadas neste estudo compreende 29 lactobacilos
isoladas de diferentes biótopos ( Tabela 1 ). As cepas foram cultivadas
em meio Man Rogosa Sharpe (MRS, Difco) em placas de ágar
durante a noite a 37 C em condições anaeróbicas (GasPack Plus, BBL).
As bactérias foram então subcultivadas por 16 h a 37 C em caldo MRS e
foram subsequentemente cultivados em meio TYI-S-33 modificado de Keiser
suplementado com 10% de FCS inativado por calor (ver acima) para
fase estacionária. Uma subcultura intermediária em TYI- modificado
O meio S-33 foi usado para algumas cepas conforme descrito anteriormente
( Perez et al., 2001 ). Os sobrenadantes bacterianos foram então coletados
após centrifugação a 10.000 ⇥ g por 10 min, esterilizado com um
Filtro de 0,22 µm e o pH foi ajustado para 6,2 com NaOH 5N.
Ensaios de hidrolase de sal biliar
As cepas bacterianas foram testadas para ácido tauro-desoxicólico
(TDCA) e ácido glico-desoxicólico (GDCA) hidrolase
atividades em placas de ágar MRS suplementadas com 0,5%
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Allain et al. Papel da BSH no Efeito Antigiardial dos Lactobacilos
TABELA 1 | Lista de cepas de lactobacilos testadas com suas características e especificidades da atividade da hidrolase dos sais biliares.
Espécies de Lactobacillus Estirpe 1 Origem TDCA (0,5%)
hidrolase
atividade
TDCA
hidrolase
pontuação de atividade 2
GDCA (0,5%)
hidrolase
atividade
GDCA
hidrolase
pontuação de atividade 2
L. acidophilus ATCC4356 Fezes, humano P + N
L. brevis CNRZ1845 Malte (cerveja) P + P +
L. casei ATCC393 Queijo N N
L. crispatus CIP103606 Desconhecido N P ++
L. curvatus CNRZ1335 Salsicha fermentada / mea N N
L. gasseri ATCC33323 Trato vaginal, humano N N
L. gasseri CNCM I-4884 ATCC29601 Dente cariouth, humano P +++ P ++
L. helveticus CNRZ1109 Lactic starter N N
L. helveticus ATCC11977 Iniciante láctico (queijo) N P ++
L. johnsonii CNRZ217 Fezes, rato N P +
L. johnsonii CNRZ218 Fezes, rato P + P ++
L. johnsonii CNRZ1897 Leite fermentado P +++ ND ND
L. johnsonii CIP103614 Trato vaginal, humano P ++ N
L. johnsonii CIP103786 Queijo P + P ++
L. johnsonii CIP103652 Desconhecido P ++ N
L. johnsonii CIP103653 Desconhecido P ++ N
L. johnsonii CIP103654 Preparação farmacêutica P + P +
L. johnsonii CIP103781 Desconhecido P +++ P ++
L. johnsonii CIP103782 Uretrano, humano P + N
L. johnsonii ATCC33200 Sangue humano P ++ P ++
L. johnsonii La1 (NCC533) Fezes, humano P +++ P ++
L. paracasei CNRZ315 Desconhecido N N
L. pentosus CNRZ1218 Queijo N N
L. plantarum CNRZ738 Silagem N P +
L. rhamnosus CNRZ317 Desconhecido N N
L. rhamnosus CNRZ2084 Leite fermentado N N
L. reuteri CNRZ431 Sourdough N N
L. sakei CNRZ1332 Moto, iniciante do saquê N N
L. zeae CNRZ2269 Licor de milho N N
P, positivo; N, negativo; ND, não determinado. 1 As cepas foram obtidas de diferentes coleções: CIP, Collection de l'Institut Pasteur, França; CNRZ / CIRM, Centro
International de Ressources Microbiennes; CNCM, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, França; ATCC, American Type Culture
Coleção, Estados Unidos. 2 A pontuação da atividade da hidrolase TDCA / GDCA foi determinada no tamanho da zona do halo (diâmetro): (): nenhum halo detectado; (+): <8 mm; (++):
9 mm a 12 mm; (+++):> 13 mm.
TDCA (Sigma – Aldrich) ou 0,5% GDCA (Merck) seguindo o
protocolo descrito por Moser e Savage (2001) . Placas MRS com
0,5% TDCA foram primeiro incubados a 37 C em condições anaeróbicas
por 24 horas antes da inoculação. As cepas foram cultivadas anaerobicamente
por 16 h a 37 ° C em caldo MRS, depois semeado em ágar MRS
placas, suplementadas ou não, com 0,5% TDCA ou 0,5% GDCA
e incubado a 37 C em condições anaeróbicas por 48-72 h. BSH
atividade pode ser facilmente detectada quando desoxicólico não conjugado
ácido precipita na placa de MRS-ágar, formando um iridescente
halo abaixo e ao redor das colônias ativas. Esses ensaios foram
realizada em duplicatas e incluiu duas repetições biológicas.
O escore de atividade de BSH foi determinado como indicado na Tabela 1 .
Ensaios anti-giardial in vitro
Os sobrenadantes bacterianos filtrados (500 µl) foram co-incubados com
culturas frescas de trofozoítos de Giardia (1,33 ⇥ 10 5 parasitas / ml em
Meio KM, pH 6,0, suplementado com 10% inativado por calor
FCS) a uma razão volumétrica de 1-3, na presença ou ausência
de bile bovina (0,6 g / L) a 37 C em condições anaeróbicas para
22 h. BSH de Clostridium perfringens (1 U) (referência C4018,
Sigma-Aldrich) foi usado como um controle positivo para o crescimento de Giardia
inibição conforme descrito anteriormente ( Travers et al., 2016 ). Amostras
foram então resfriados com gelo por 10 min e a carga de trofozoíto foi
determinada usando hemocitômetro (a mobilidade dos flagelos foi usada para
viabilidade do parasita da tela). As taxasde inibição foram determinadas
contando o número de trofozoítos vivos e estabelecendo
proporções em comparação com os controles (em porcentagem). Experimentos
foram realizados em duplicata e incluíram três biológicos
replica.
Avaliação da atividade anti-giardial
na Vivo
Culturas de trofozoítos WB6 de G. duodenalis foram cultivadas em
Meio TYI-S-33 modificado de Keister com 10% inativado por calor
FCS. Cepas de lactobacilos (La1, L. gasseri CNCM I-4884 e
L. curvatus CNRZ1335) foram cultivadas em caldo MRS por 16 h
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Allain et al. Papel da BSH no Efeito Antigiardial dos Lactobacilos
a 37 C em condições anaeróbicas de pré-culturas. Bactérias eram
em seguida, colhido por centrifugação a 7000 ⇥ g por 15 min,
lavado duas vezes e ressuspenso em um volume correspondente
de PBS / Glicerol estéril 15% para obter uma concentração final de
2,5 ⇥ 10 10 CFU / ml para administrações intragástricas (5 ⇥ 10 8
UFC por camundongo neonatal). Os camundongos usados para reprodução não eram
camundongos consanguíneos da cepa OF1 (Charles River, Saint-Germain-
Nuelles, França). Todos os experimentos foram realizados em um ambiente filtrado
câmara de ar e as manipulações foram realizadas sob um laminar
capa de fluxo para evitar a contaminação do meio ambiente por cistos
de G. duodenalis e outros patógenos.
As cepas de lactobacilos foram administradas diariamente por via intragástrica
gavagem em um volume de 20 µl (5 ⇥ 10 8 CFU) a neonatal de 5 dias de idade
camundongos do dia 5 ao dia 15 (n = 9-12 por grupo) ( Figura 2 ).
Os animais de controle (n = 8) receberam PBS com glicerol 15% em vez de
suspensões bacterianas. Camundongos neonatais foram então desafiados com
trofozoítos no dia 10 por gavagem intragástrica em um volume de 100 µl
(10 5 trofozoítos). Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical em
dia 16. O intestino delgado e o conteúdo do cólon foram examinados para
a presença de trofozoítos e cistos, pela contagem do parasita
carga, usando um hemocitômetro. A contagem de trofozoítos
foi realizada a partir do intestino delgado (ressuspenso em 5 ml de
PBS estéril resfriado em gelo), enquanto os cistos foram enumerados no cólon
e ceco (ressuspenso em 5 ml de potássio 2,5% gelado
dicromato). O limite mínimo de valores de contagem para
a análise estatística foi fixada em 10 3 trofozoítos.
Análise Estatística
Os resultados foram expressos como médias ± erro padrão da média
(SEM). A comparação entre os grupos foi avaliada por um ou
análise de variância bidirecional (ANOVA), teste t, Mann-Whitney
e Kruskal-Wallis. Os testes de correlação foram realizados usando
Teste de correlação de postos de Spearman. A significância estatística foi
calculado em valores de p abaixo de 0,05 com intervalo de confiança de 95%.
Declaração de ética
Todos os protocolos foram realizados de acordo com as normas institucionais
diretrizes éticas do comitê de ética Animal ANSES
Laboratório de Saúde em Maisons-Alfort no campus da França
Escola Nacional de Veterinária de Alfort (ENVA), que aprovou
este estudo.
RESULTADOS
Atividades BSH de cepas de lactobacilos
As 29 cepas testadas neste estudo foram capazes de crescer em MRS-ágar
suplementado com 0,5% de TDCA enquanto apenas 25 cresceram em MRS-
ágar suplementado com 0,5% GDCA, apoiando que GDCA
tem uma atividade bactericida mais alta do que o TDCA in vivo ( Begley
et al., 2006 ). A atividade de hidrolase de TDCA / GDCA é um bem conhecido
indicador de atividade de BSH em bactérias ( Bustos et al., 2012 ). Um semi-
método quantitativo foi usado para monitorar a atividade de BSH por
medir a zona do halo de cepas positivas após 48-72 h de
incubação. Entre as 29 cepas, 6 exibiram TDCA hidrolase
atividade, 4 exibiram atividade de GDCA hidrolase e 8 exibiram
atividades de hidrolase de TDCA e GDCA ( Tabela 1 ). Sem auréola
foi detectado para 11 cepas. Curiosamente, todas as cepas de L. johnsonii
testado exibiu pelo menos um tipo de atividade BSH. Entre o
cepas que abrigam atividades BSH tauro e glico-específicas,
La1, L. gasseri CNCM I-4884 e L. johnsonii CIP103782
exibiram os maiores escores de BSH ( Tabela 1 e Figura 1A ).
Caracterização de Anti-giardial
Cepas de lactobacilos
Nós selecionamos as 29 cepas de lactobacilos quanto à sua inibição
habilidades contra G. duodenalis. Para isso, sobrenadantes bacterianos
foram co-incubados por 22 h a 37 C com trofozoíto de Giardia
culturas em meio de crescimento KM suplementado, ou não, com
bile bovina (0,6 g / L). Trofozoítos vivos foram enumerados usando
hemocitômetro. Culturas de parasitas que foram cultivadas sem bile
não apresentou grandes diferenças quando comparado aos trofozoítos
cultivado em KM suplementado com bile, mostrando que o colesterol
e os lipídios do soro fetal bovino são suficientes para preencher o
requisitos de absorção de Giardia e que os componentes da bile não são
tóxico para Giardia ( Travers et al., 2016 ).
Quando co-incubado com Giardia em KM suplementado com
bile bovina, 19 sobrenadantes bacterianos exibiram
efeitos antagônicos no crescimento da Giardia, com uma ampla gama
dos níveis de inibição ( Figura 1A ). Seis cepas apresentaram crescimento
níveis de inibição de 15 a 30%, 10 exibiram inibição do crescimento
níveis de 30 a 70%, e 12 cepas exibiram uma forte redução
de trofozoítos em 70-100% (p <0,001). Apenas sobrenadante de
L. gasseri CNCM I-4884 foram tão eficientes quanto o de La1 para
antagonizar o crescimento de Giardia in vitro (100%). Usando Spearman's
Teste de correlação de classificação, observamos uma correlação positiva
entre os níveis de inibição e o escore de atividade BSH (r = 0,86;
p <0,0001) de cepas bacterianas ( Figura 1B ). Ensaios de inibição
foram então divididos em dois grupos: (i) BSH negativo (cepas
sem atividade BSH detectada) e (ii) BSH positivo (cepas
exibindo as atividades TDCA, GDCA ou ambas BSH). Nós
observaram que a atividade inibitória do crescimento de Giardia de BSH positivo
as cepas foram duas vezes maiores em relação às cepas negativas para BSH
(Teste t de Student; p <0,0001) ( Figura 1C ). Além disso, o citotóxico
efeito na Giardia foi perdido quando trofozoítos foram co-incubados
com sobrenadante bacteriano na ausência de bile ( Figura 1D ).
No entanto, uma inibição muito fraca ainda foi observada para a maioria
das cepas (variação entre 5 e 15%), o que pode ser explicado
pela presença de outros compostos extracelulares liberados por
lactobacilos (por exemplo, bacteriocinas) que também são potencialmente deletérios
para o crescimento de Giardia. Tomados em conjunto, estes resultados in vitro fortemente
sugerem que o efeito anti-giardial exibido pelos lactobacilos
cepas testadas neste estudo são principalmente bile-dependentes.
Efeito in vivo da administração oral
Lactobacilos contra G. duodenalis
Experimentos in vivo foram realizados a fim de avaliar a
potencial de cepas de lactobacilos anti-giardial recentemente identificadas
para antagonizar G. duodenalis in vivo. Suspensões bacterianas, ou
PBS / glicerol foram administrados diariamente por gavagem intragástrica
(5 ⇥ 10 8 CFU) para camundongos neonatais do dia 5 ao dia
15 ( Figura 2 ). A persistência de lactobacilos na amamentação
camundongos e a via de administração foram determinados em
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Allain et al. Papel da BSH no Efeito Antigiardial dos Lactobacilos
FIGURA 1 | Atividades in vitro da hidrolase do sal biliar (BSH) e anti-Giardia de diferentes cepas de lactobacilos. (A) Porcentagem de trofozoítos vivos de Giardia duodenalis quando
cultivado por 22 h com sobrenadantes de lactobacilos. Trofozoítos de G. duodenalis foram enumerados após 22 h de co-incubação a 37 C em condições anaeróbicas(os valores são
representado com suplementação de bile). Os valores são média ± SEM. (B) Teste de correlação de Spearman entre a porcentagem de inibição de cepas de lactobacilos e
sua pontuação de atividade BSH. A pontuação BSH foi determinada dependendo do tamanho da zona do halo (+ = 1; ++ = 2; +++ = 3, Tabela 1) e a capacidade de desconjugar
sais biliares tauro-conjugados ou sais biliares glico-conjugados ou ambos (adição de pontuação BSH para cada especificidade de substrato). Uma correlação positiva é observada (r = 0,86;
p <0,0001). (C) Ensaios de inibição de acordo com as atividades da hidrolase do sal biliar. As cepas de lactobacilos foram divididas em dois grupos: (i) BSH negativo (cepas sem
detectou atividade BSH), (ii) BSH positivo (cepas exibindo TDCA, GDCA ou ambas as atividades BSH). Trofozoítos de G. duodenalis foram enumerados após 22 h de
co-incubação a 37 C em condições anaeróbicas (os valores são representados com a suplementação de bile). Os valores estão em média ± SEM. (D) Porcentagem de G. duodenalis vivos
trofozoítos quando co-cultivados 22 h com sobrenadantes de cepas de lactobacilos, com ou sem suplementação de bile (bile bovina 0,6 g / L). Trofozoítos de G. duodenalis
foram enumerados após 22 h de co-incubação a 37 C em condições anaeróbias. Os valores são média ± SEM. ⇤⇤ p 0,01; ⇤⇤⇤ p 0,001.
experimentos ( Figura Suplementar S1 ). Ratos foram desafiados
com trofozoítos de G. duodenalis WB6 no dia 10 por intragástrico
gavagem (1 ± 10 5 trofozoítos) e sacrificados no dia 16 ( Figura 2 ).
Em experimentos preliminares, mostramos que esta cepa do parasita
foi capaz de persistir e colonizar no modelo de camundongos lactentes OF1, o
pico de carga de trofozoíto sendo alcançado no dia 16 (ou seja, 6 dias após
inoculação) ( Figura Suplementar S2 ). Por outro lado, nós
demonstraram que cepas de lactobacilos podem persistir no intestino até
3-4 dias após gavagem intragástrica.
Os camundongos foram divididos em quatro grupos com um mínimo de oito
animais por grupo. A carga parasitária em camundongos tratados com
PBS / glicerol foi 20 vezes maior do que a dose inicial mostrando
que os trofozoítos foram capazes de colonizar, multiplicar e persistir em
o intestino delgado. Conforme mostrado na Figura 3A , camundongos tratados com
L. curvatus CNRZ1335 não foram protegidos contra G. duodenalis
desafio, pois apresentam perfil semelhante no trofozoíto
colonização e proliferação. Em contraste, os camundongos tratados com
L. gasseri CNCM I-4884 exibiu uma redução de 18 vezes no
carga de trofozoítos no intestino delgado (⇠93%) (p <0,001)
em comparação com o grupo PBS / glicerol ( Figura 3A ). Ratos alimentados com
a cepa probiótica La1 exibiu uma redução dupla na
carga de trofozoítos em comparação com os controles (⇠43%). Curiosamente,
L. gasseri CNCM I-4884 foi mais eficiente do que La1 na prevenção
Proliferação de G. duodenalis in vivo.
Enumerações de cistos foram realizadas no cólon e
ceco. Observamos redução significativa (81%) (p <0,01)
na formação de cistos em grupos tratados com L. gasseri CNCM I-4884
em comparação com os grupos tratados com PBS / glicerol e L. curvatus.
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FIGURA 2 | Projeto experimental de infecção por G. duodenalis em modelo de camundongo lactente OF1. Cepas de lactobacilos foram administradas diariamente por gavagem intragástrica
(5 ± 10 8 CFU) a camundongos amamentados OF1 de 5 dias de idade do dia 5 ao dia 15. Os animais de controle receberam PBS / glicerol 15%. Os camundongos foram desafiados com G. duodenalis WB6
trofozoítos (10 5 ) no dia 10 por gavagem intragástrica. Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical no dia 16.
FIGURA 3 | Atividades in vivo de cepas de Lactobacillus gasseri CNCM I-4884 e La1 de lactobacilli contra G. duodenalis. (A) Enumeração de trofozoítos de G. duodenalis
após administração a animais. Camundongos lactentes receberam PBS (n = 8), La1 (n = 12), L. gasseri CNCM I-4884 (n = 10) ou L. curvatus CNRZ1335 (n = 9) por
gavagem intragástrica (5 ⇥ 10 8 UFC / camundongos) diariamente a partir do dia 5, antes da inoculação com trofozoítos de G. duodenalis WB6 (10 5 trofozoítos por animal) no dia 10. Gavagens
foram realizados até o dia 15. O intestino delgado foi ressuspenso em PBS e os trofozoítos foram contados usando um hemocitômetro. Os valores são média ± SEM; p <0,05.
(B) Contagem de cistos de G. duodenalis no cólon e ceco. Camundongos lactentes receberam PBS / glicerol 15%, La1, L. gasseri CNCM I-4884 ou L. curvatus CNRZ1335 por
gavagem intragástrica (5 ⇥ 10 8 UFC / camundongos) diariamente a partir do dia 5 antes da inoculação com trofozoítos G. duodenalis WB6 (10 5 trofozoítos por animal) no dia 10. Gavagens
foram realizados até o dia 15 (n = 8-12 / grupo). Os cólons e cecos foram ressuspensos em 5 ml de dicromato de potássio 2,5% resfriado em gelo e os cistos foram contados usando
um hemocitômetro. Os valores são média ± SEM. ⇤⇤ p 0,01; ⇤⇤⇤ p 0,001.
Nenhuma redução significativa foi observada no grupo tratado com
La1 ou L. curvatus CNRZ1335 em comparação com os grupos de controle
tratado com PBS / glicerol ( Figura 3B ).
DISCUSSÃO
Vários estudos demonstraram que os probióticos podem jogar
papéis principais contra enteropatógenos, incluindo prototozan intestinal
parasitas (ver Travers et al., 2011 , para uma revisão). Nos últimos 10 anos,
várias cepas de lactobacilos foram estudadas por sua capacidade de
prevenir o estabelecimento de G. duodenalis in vivo e reduzir
a gravidade das infecções giardiais ( Humen et al., 2005 ; Shukla
et al., 2008 ; Goyal et al., 2011 ; Goyal e Shukla, 2013 ). Em alguns
casos, os ensaios in vitro foram projetados para decifrar o
mecanismos envolvidos nesses efeitos protetores. Para o probiótico
cepa La1 de L. johnsonii, anteriormente conhecida por antagonizar
Crescimento de Giardia in vitro e in vivo, Perez e colaboradores
estabeleceu a presença de um princípio ativo no sobrenadante
desta cepa probiótica ( Perez et al., 2001 ; Humen et al., 2005 ).
Mais recentemente, empreendemos a caracterização molecular de
este princípio ativo de La1 e descobriu pelo menos um possível
mecanismo de ação: o envolvimento de bactérias semelhantes a BSH
atividades, que mediariam o efeito anti-giardial, gerando
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sais biliares desconjugados (tóxicos para o parasita) de não tóxicos
sais biliares conjugados ( Travers et al., 2016 ). BSH são comuns em
Lactobacillus e Bifidobacterium, desempenhando um papel importante para
colonização e persistência no intestino ( Tanaka et al., 1999 ; Begley
et al., 2006 ; Denou et al., 2008 ). Portanto, procuramos outros
cepas probióticas (intimamente relacionadas ou não a La1) exibindo anti-
atividades giardiais. Assim, selecionamos 29 cepas de lactobacilos de
origens diversas e selecionaram seus sobrenadantes para sua suposta
atividades anti-giardial in vitro enquanto, em paralelo, analisamos
suas atividades e propriedades BSH. Entre os sobrenadantes
emitido a partir das 29 cepas analisadas, 19 foram encontrados para exibir
atividades antiparasitárias em culturas frescas de trofozoítos de Giardia.
Curiosamente, essas 19 cepas também exibiram o maior BSH
escores, indicando uma correlação entre essas duas propriedades.
Esses resultados, portanto, sugerem que um método de triagem baseado
nas atividades de BSH pode predizer potencial atividade anti-giardial
em lactobacilos. Curiosamente, L. gasseri CNCM I-4884 e La1
cepas (que mataram 100% dos trofozoítos in vitro) exibiram ambos
Atividades BSH específicas de TDCA e GDCA. Portanto, propomos
que esta atividade BSH dupla ou combinada contribuiriapara
reforçar a liberação de sal biliar desconjugado tóxico para Giardia,
de um painel maior de substratos. No entanto, nenhuma relação clara
apareceu entre a atividade anti-giardial observada e o
origens ambientais dos isolados de lactobacilos ( Tabela 1 ).
Lactobacillus gasseri CNCM I-4884 e La1 foram subsequentemente
administrado a camundongos lactentes OF1 para avaliar seus antagonistas
efeitos in vivo. L. curvatus CNRZ1335, que não exibiu nenhum
atividade anti-giardial nem atividades BSH in vitro, foi usado como um
controle negativo. Carga elevada de trofozoítos nos controles mostrou
colonização e proliferação eficientes de G. duodenalis
WB6 nos camundongos OF1 ( Shukla et al., 2008 ). Camundongos tratados com
L. gasseri CNCM I-4884 exibiu uma redução dramática de viabilidade
trofozoítos no intestino delgado, 6 dias após o desafio. La1
a suplementação de cepas também leva a uma redução de trofozoítos em
intestinos de camundongos, mas em muito menor extensão do que L. gasseri CNCM
I-4884. Estudos anteriores relataram propriedades anti-giardial de
cepas de lactobacilos. Por exemplo, L. casei MTCC1423 e LGG
cepas reduziram a duração e a gravidade de G. duodenalis
infecção (cepa Portland) em camundongos C57BL / 6 em 7–14 dias ( Shukla
et al., 2008 ; Goyal et al., 2011 ) e La1 antagonizou Giardia
(WB6) em gerbils da Mongólia em 7–21 dias ( Humen et al., 2005 ).
No entanto, nenhuma correlação entre os efeitos anti-giardial e um
A atividade do tipo BSH foi estabelecida nesses estudos. Surpreendentemente, em
o estudo atual, a administração de L. gasseri CNCM I-4884 levou
para uma redução mais forte da carga de trofozoítos em um curto período
de tempo. A formação de cisto é outra indicação importante da
controle do desenvolvimento de parasitas infecciosos ( Lujan et al., 1997 ).
Um tratamento capaz de prevenir a diferenciação trofozoíta
em cistos é realmente essencial para minimizar a sua propagação no
ambiente através das fezes dos animais. Observamos que os ratos alimentados com
L. gasseri CNCM I-4884 exibiu uma redução dramática de cisto
excreção 6 dias após o desafio em comparação com infectados não tratados
ratos. Isso está em concordância com os resultados anteriores, mostrando que
outros lactobacilos, como L. casei MTCC 1423 e LGG foram
eficaz na eliminação de cistos após 7 dias de tratamento. Em contraste,
nenhuma redução de cisto foi observada em camundongos tratados com La1, embora
sua capacidade de eliminar cistos foi relatada anteriormente em
gerbils da Mongólia ( Humen et al., 2005 ). As diferenças de termos
da eficiência in vivo entre L. gasseri CNCM I-4884 e La1,
ambas as cepas BSH-positivas, podem ser explicadas por um melhor
hidrólise de sais biliares conjugados in vivo, uma maior capacidade para
competindo por nichos biológicos no intestino delgado, e um melhor
persistência no intestino.
Até o momento, os mecanismos subjacentes envolvidos no
efeito antagônico dos lactobacilos contra Giardia é um emergente
campo. Além do papel das atividades do tipo BSH que temos
relatado anteriormente para La1 ( Travers et al., 2016 ), e agora
para outras cepas de Lactobacillus, outros mecanismos foram
identificado. Entre eles, o papel dos peptídeos antimicrobianos
na atividade anti-giardial dos lactobacilos foi explorado.
Na verdade, quando administrado por via oral, P106, uma bacteriocina derivada
isolado de L. acidophilus, mostrou reduzir o trofozoíto
carga em camundongos em altas concentrações ( Amer et al., 2014 ).
No entanto, a capacidade de produzir peptídeos antimicrobianos é tensão
dependente e altamente variável e isso não pode ser extrapolado
a todas as cepas anti-giardial. Além disso, lactobacilos probióticos são conhecidos
para melhorar o sistema imunológico da mucosa, que participa de
limpar enteropatógenos do intestino ( Howarth e Wang,
2013 ). As propriedades imunomoduladoras dos lactobacilos têm
também foi proposto para explicar suas propriedades anti-giardial
( Goyal e Shukla, 2013 ; Allain et al., 2017 ; Barash et al., 2017 ;
Bartelt et al., 2017 ; Fink e Singer, 2017 ). Em nosso estudo, o local
e a resposta sistêmica à infecção por Giardia não foi avaliada
devido ao fato de que camundongos lactentes têm um sistema imunológico imaturo
sistema ( Basha et al., 2014 ).
Embora as propriedades anti-giardiais dos lactobacilos pareçam
ser multifatorial, há uma contribuição clara das atividades da BSH.
No entanto, mais experimentos são necessários para investigar o
potencial da BSH no tratamento da giardíase, incluindo o efeito direto
de BSHs in vitro e in vivo. Cepas mutantes nocaute para todos os BSH
genes (vários genes BSH são comumente encontrados em lactobacilos)
ainda são necessários para avaliar a contribuição relativa de cada um
dessas enzimas. Para resumir, este estudo mostra a atividade BSH
como um parâmetro de triagem chave para identificar anti-Giardia lactobacilli
Deformação. Além disso, L. gasseri CNCM I-4884, que exibiu
ambas as atividades anti-giardial e BSH in vitro, antagonizam
Sobrevivência de Giardia em camundongos OF1. Este estudo representa um significativo
passo em direção ao desenvolvimento de novas estratégias profiláticas, com
aplicações humanas e veterinárias.
CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR
IF, BP, PG, TA e LB-H conceberam e delinearam o estudo. TA,
BP, SC e MT realizaram todos os experimentos. M-AT, IV e PL
discutiu os experimentos e resultados. TA, IF e LB-H escreveram o
manuscrito.
FINANCIAMENTO
Este trabalho foi parcialmente financiado pela Région Île-de-France-DIM
(Maladies Infectieuses, Parasitaires et Nosocomiales Émergentes,
programa não. 120092).
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AGRADECIMENTOS FIGURA S1 | Persistência da cepa L. johnsonii La1 (Ery r ) em camundongos lactentes OF1.
Cada camundongo recebeu uma única administração de 5 ⇥ 10 8 CFU de L. johnsonii La1
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Os autores agradecem a Dra. Cissé Sow (MHNH) e Yasmine Kirati
(Mett) por sua ajuda técnica em experimentos preliminares. Eles
também agradeço ao Dr. Saulius Kulakauskas (INRA, Jouy-en-Josas) que
forneceu algumas cepas de bactérias de ácido láctico.
MATERIAL SUPLEMENTAR
O material suplementar para este artigo pode ser encontrado
online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.
2018.00089 / full # material suplementar
Ery r por gavagem oral (dias 1, 2 e 3; n = 4) ou gavagem intragástrica (dias 1,
2, 3 e 4; n = 4). L. johnsonii La1 foi transformado com um plasmídeo contendo um
gene de resistência à eritromicina (Ery), conforme descrito anteriormente ( Allain et al., 2016 ).
Os valores estão em média ± SEM.
FIGURA S2 | Cinética de infecção de G. duodenalis cepa WB6 em amamentação OF1
ratos. (A) Enumeração de trofozoítos de G. duodenalis no intestino delgado após
gavagem (dia 0). A carga de trofozoíta foi medida nos dias 3, 6, 8, 10, 12, 15 e
18 (n = 10). O intestino delgado foi ressuspenso em PBS e os trofozoítos foram
contados usando um hemocitômetro (B) G. duodenalis cistos enumeração em grande
intestino após gavagem única (dia 0). Os cistos foram medidos nos dias 3, 6, 8, 10, 12,
15 e 18 (n = 10). O intestino grosso foi ressuspenso em 2,5% de potássio
dicromato e cistos foram contados usando um hemocitômetro. Os valores estão em
média ± SEM.
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atividades semelhantes à hidrolase do probiótico Lactobacillus johnsonii La1 Inhibit
Declaração de conflito de interesses: Os autores declaram que a pesquisa foi
conduzido na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que poderiam
ser interpretado como um potencial conflito de interesses.
Copyright © 2018 Allain, Chaouch, Thomas, Travers, Valle, Langella, Grellier,
Polack, Florent e Bermúdez-Humarán. Este é um artigo de acesso aberto distribuído
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Fronteiras em Microbiologia | www.frontiersin.org 9 Fevereiro de 2018 | Volume 9 | Artigo89