Protocolos de Microbiologia Clínica - Parte 1

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NewsLab - edição 86 - 2008 58
Protocolos de Microbiologia Clínica
Coprocultura
Parte 1 - Salmonella e Shigella
 Carlos Henrique Pessôa 
 de Menezes e Silva
Doutor em Microbiologia 
Microbiologista do Centro 
Tecnológico de Análises 
(CETAN), Vila Velha-ES 
Consultor em Microbiologia do 
Laboratório Landsteiner, Vitória-ES
: carloshenrique@cetan.com.br
Quadro 1. Agentes etiológicos mais relacionados com as diarréias infecciosas
Bactérias Vírus Protozoários
Vibrio cholerae e outros 
vibriões, Shigella spp., Sal-
monella spp. (não tifóide), 
E. coli (enterotoxigênica, 
enteropatogênica clássica, 
enteroinvasora, enterohe-
morrágica, enteroagregati-
va), Campylobacter jejuni, 
Yersinia enterocolitica, 
Clostridium difficile, Bac-
teroides fragilis (entero-
toxigênico)
Rotavírus, Adenovírus en-
térico, Calicivírus, Astro-
vírus
Entamoeba histolytica, 
Giardia lamblia, Cryptos-
poridium, Cyclospora
Introdução
As doenças diarréicas continuam 
sendo uma freqüente causa de morte 
ainda nos dias atuais, especialmente em 
países em desenvolvimento. A incidência 
anual e o perfil etiológico das diarréias em 
diferentes populações podem variar de 
acordo com os diversos fatores de risco, 
tais como a idade muito jovem, deficiên-
cias nutricionais, higiene inadequada de 
alimentos e do próprio corpo, ausência 
de cuidados sanitários básicos, acesso a 
suprimentos de água contaminados e até 
mesmo o verão, estação do ano que sem-
pre registra o maior número de casos de 
internações devido às diarréias. Nos países 
industrializados, a freqüência de casos de 
diarréia por criança é de somente 0,5 a 2 
episódios/criança/ano, enquanto que em 
países em desenvolvimento este número 
pode alcançar facilmente os 10 episódios/
criança/ano. Nos países industrializados 
as diarréias por rotavírus predominam, 
enquanto que nos países em desenvolvi-
mento as bactérias são comumente encon-
tradas nos casos de diarréia (18).
Os agentes etiológicos envolvidos 
nas diarréias infecciosas incluem muitas 
espécies de bactérias, vírus e protozoá-
rios, todos possuindo grande número de 
sorogrupos e biotipos e sendo também 
A convite da Revista Newslab, preparamos uma série denominada “Protocolos de Microbiologia Clínica”, abordando os principais temas de interesse àqueles que militam na área, objetivando a educação conti-nuada, o aprimoramento científico e a aplicabilidade imediata das diretrizes sugeridas para que os seto-
res de Microbiologia Clínica dos laboratórios brasileiros possam realizar seus exames com acurácia e qualidade. 
Proporcionaremos, ainda, uma visão crítica, com sugestões construtivas, para a melhoria da qualidade neste setor, 
tanto para aqueles que já possuem um setor ativo, mas que desejam incrementá-lo com informações precisas e 
coesas, quanto para os laboratórios de pequeno porte, os quais terão a oportunidade de implementar rotinas de 
fácil execução com toda informação científica necessária. Inicialmente, abordaremos o tema Coprocultura, dividi-
do em duas partes para melhor interpretação. Bimestralmente, a Revista Newslab trará novos protocolos, a saber: 
Urocultura, Microbiologia dos Líquidos Corporais Estéreis, Microbiologia das Secreções, Microbiologia do Sistema 
Genital Humano e Micologia Clínica.
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todos transmitidos pela via fecal-oral. 
Pelo fato da grande diversidade de 
microrganismos que podem estar envol-
vidos, é virtualmente impossível para 
qualquer laboratório clínico realizar um 
completo exame de fezes diarréicas. Por-
tanto, os patógenos mais freqüentes são 
investigados, dependendo da localização 
geográfica e da estação do ano (13). 
Shigella 
O homem é o reservatório natural e as 
infecções ocorrem via fecal-oral através 
da ingestão de 20 a 200 células viáveis 
em alimentos e água contaminados. Na 
shigelose, corre uma invasão e destruição 
da camada epitelial da mucosa com in-
tensa reação inflamatória, gerando leucó-
citos, muco e sangue nas fezes. Deve-se 
suspeitar de espécies de Shigella quando 
observamos colônias lactose-negativas, 
bioquimicamente inertes em muitas 
provas bioquímicas de identificação. Elas 
tipicamente não produzem gás a partir 
de carboidratos, com exceção de alguns 
biogrupos de S. flexneri que são aerogê-
nicos. Raras cepas de S. sonnei podem 
fermentar tardiamente a lactose (2%) e 
a sacarose (1%) e a maioria das cepas 
desta espécie descarboxila a ornitina, 
característica não observada em outras 
espécies de Shigella. 
Há quatro subgrupos principais e 43 
sorotipos reconhecidos de Shigella (Qua-
dro 3). A classificação do CDC combina 
S. dysenteriae (grupo A), S. flexneri (grupo 
B) e S. boydii (grupo C) como “Shigella 
sorogrupos A, B e C” por conta de suas si-
milaridades bioquímicas. A presença de 
ornitina-descarboxilase e a atividade de 
beta-galactosidase fazem com que as ce-
pas de S. sonnei sejam bioquimicamente 
distintas de outras espécies de Shigella. A 
incapacidade de fermentar o manitol dis-
tingue a S. dysenteriae. Todos os isolados 
clínicos identificados bioquimicamente 
Quadro 2. Características gerais de alguns microrganismos envolvidos em diarréias
Microrganismos
Fonte de Contaminação ou 
Condição Predisponente
No de Células que Levam à 
Infecção
Período de Incubação
Aeromonas spp. Água Desconhecido Desconhecido
Bacillus cereus Carnes, vegetais Toxina 6-24 horas
Campylobacter jejuni Água, leite, carnes Desconhecido 3-11 dias
Clostridium difficile Terapia antimicrobiana Desconhecido 4-9 dias
Clostridium perfringens Carnes 109 – 1010 8-16 horas
ETEC Alimentos, água 106 – 108 4-24 horas
EIEC Alimentos 106 – 108 8-24 horas
EHEC Carnes, leite Desconhecido 3-5 dias
Plesiomonas shigelloides Água, pescados Desconhecido 1-2 dias
Salmonella spp. Alimentos em geral 102 – 108 8-72 horas
Shigella dysenteriae Água 10-200 3-5 dias
Outras Shigella Água, alimentos 10-200 8-72 horas
Staphylococcus aureus Carnes, laticínios Toxina 1-6 horas
Vibrio cholerae Água, pescados 108 1-5 dias
Vibrio parahaemolyticus Pescados 106 - 108 15-24 horas
Yersinia enterocolitica Água, alimentos Desconhecido 16-48 horas
como Shigella devem ser confirmados 
por testes sorológicos (13).
Salmonella 
Salmonelas patogênicas ingeridas 
com água ou alimentos contaminados 
sobrevivem à passagem pela barreira áci-
da do estômago e invadem as células da 
mucosa dos intestinos delgado e grosso 
e liberam toxinas. A invasão das células 
epiteliais intestinais estimula a liberação 
de citocinas que induzem uma resposta 
inflamatória aguda. A reação inflamatória 
na mucosa intestinal induz diarréia e 
pode levar à ulceração e destruição da 
mucosa intestinal. Da mucosa, a bactéria 
pode disseminar-se para órgãos internos 
causando doença sistêmica. As salmonelas 
possuem antígenos somáticos (O) que são 
Quadro 3. Subgrupos, sorotipos e subtipos de Shigella
Subgrupo Sorotipos e Subtipos
Grupo A: Shigella dysenteriae 15 sorotipos (o tipo 1 produz a shiga toxina)
Grupo B: Shigella flexneri Oito sorotipos e nove subtipos
Grupo C: Shigella boydii 19 sorotipos
Grupo D: Shigella sonnei Um sorotipo
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Protocolos de Microbiologia Clínica
lipopolissacarídeos e antígenos flagelares 
(H) que são proteínas. S. typhi também pos-
sui um antígeno capsular ou de virulência 
(Vi). Bioquimicamente elas geralmente são 
lactose e sacarose-negativas. 
Desde a época do primeiro isolamento 
de Salmonella, reportado em 1884 por Ga-
ffky (Bacterium typhosum) e em 1886 por 
Salmon e Smith (Salmonella choleraesuis), 
o desenvolvimento da nomenclatura para 
este gênero tem sido variado e complexo. 
O gênero Salmonella possui mais de 2.400 
sorotipos descritos no esquema atual de 
Kauffmann-White. Antes de 01 de julho 
de 1983, três espécies de Salmonella foram 
usadas para reportar os resultados positivos 
dos exames: S. choleraesuis, S. typhi e S. 
enteritidis (com a maioria dos sorotipos 
pertencendo a este último sorotipo).
Atualmente, todas as antigas denomi-
nações das espécies e subgruposde Sal-
monella e Arizona são consideradas como 
pertencentes à mesma espécie, mas podem 
ser separadas em sete grupos taxonômicos, 
representando seis subgrupos distintos. A 
única exceção é S. bongori, anteriormente 
conhecida como subgênero V, sendo uma 
espécie totalmente distinta através de 
estudos de homologia de DNA. Portanto, 
há duas espécies e seis subespécies de S. 
enterica no atual sistema de classificação 
do CDC (Quadro 4). 
Na prática do dia-a-dia, os isolados 
desconhecidos provenientes de espécimes 
clínicos que são sugestivos de perten-
ceram ao gênero Salmonella, devem ser 
confirmados por sorologia. Subcultivo 
dos isolados confirmados devem ser en-
caminhados para laboratórios de saúde 
pública, onde as designações de sorotipos 
(ex: Salmonella sorotipo Typhimurium) 
serão realizadas. Répteis, particularmente 
cobras, são o reservatório natural de S. en-
terica subespécie arizonae, mas o homem, 
aves e outros animais também podem ser 
infectados por esta bactéria. As infecções 
humanas podem ser originadas quando da 
manipulação de aves, répteis e produtos à 
base de ovos (13).
Microscopia 
A análise microscópica direta do ma-
terial fecal é muito útil, pois pode se ter 
uma noção do que será encontrado na co-
procultura. A presença de numerosos leu-
cócitos polimorfonucleares (PMN) sugere 
um processo inflamatório invasivo (Figura 
1) envolvendo o cólon (como a exemplo de 
infecções por Shigella ou Campylobacter). 
Colites ulcerativas e a colite associada à 
antibioticoterapia (relacionada ao C. diffi-
cile) estão quase sempre associadas a um 
exsudato fecal contendo leucócitos. No 
entanto, deve-se ter em mente que nem 
todos os processos diarréicos causados 
por bactérias irão produzir leucócitos nos 
espécimes fecais. Para a realização do exa-
me, coloca-se uma pequena quantidade 
do material fecal em uma lâmina de vidro 
limpa e desengordurada, misturando uma 
gota de água destilada estéril (ou salina) e 
uma gota de azul de metileno sob lamínu-
la. Observar ao microscópio com aumento 
de 400x (13).
Isolamento
Grande parte dos métodos de identifica-
ção no laboratório ainda é demorada e re-
quer uma bateria de meios de cultura, apesar 
do constante progresso no desenvolvimento 
de novos métodos rápidos de diagnóstico. 
Assim, o período decorrido entre a entrada 
do material no laboratório de Microbiologia 
e a identificação e antibiograma dos agentes 
isolados pode demorar vários dias para uma 
completa análise (13). 
A qualidade dos insumos utilizados 
por muitos fabricantes é questionável e 
muitas vezes ruim, levando a um alto grau 
de inconsistência de resultados lote a lote 
de um mesmo meio de cultura (24). Portan-
to, deve-se dar preferência para meios de 
cultura de fabricantes idôneos, seja em pó 
ou em placas/tubos prontos para uso. Des-
confie de meios muito baratos, oferecidos 
comumente no mercado. Geralmente são 
de baixa qualidade e colocarão em cheque 
a qualidade dos serviços microbiológicos 
ofertados pelo seu laboratório. 
A metodologia tradicional para a detec-
ção de patógenos entéricos invariavelmente 
emprega a combinação de meios de cultura, 
geralmente um meio seletivo em placa e 
um caldo de pré-enriquecimento. A neces-
sidade de mais de uma placa é defendida 
por alguns autores, motivados pelo conhe-
cimento de que se um meio é altamente 
Quadro 4. Classificação das espécies e subespécies de Salmonella
Salmonella enterica subespécie enterica (I): inclui a maioria dos sorotipos
S. enterica subespécie salamae (II)
S. enterica subespécie arizonae (IIIa)
S. enterica subespécie diarizonae (IIIb)
S. enterica subespécie houtenate (IV)
S. enterica subespécie indica
Salmonella bongori (antigamente denominada subespécie V)
Quadro 5. Leucócitos PMN em infecções intestinais
Presentes Variáveis Ausentes
Shigella, 
Campylobacter, 
E.coli invasora (EIEC)
Salmonella, Yersinia, 
Vibrio parahaemolyticus, 
Clostridium difficile
Vibrio cholerae, E.coli toxigênica 
(ETEC), E.coli enteropatogênica 
(EPEC), Staphylococcus aureus 
[toxina], Bacillus cereus [toxina]
Figura 1. Gram: Diarréia muco-sanguinolenta 
por Shigella (numerosas hemácias, leucócitos 
PMN e acentuada presença de bacilos Gram-
negativos; microbiota intestinal normal 
praticamente inexistente).
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inibitório para alguns membros da família 
Enterobacteriaceae (isto é, os coliformes da 
microbiota normal intestinal), poderá haver 
uma concomitante perda de sensibilidade 
na detecção de patógenos verdadeiros, tais 
como a Shigella. Os meios de cultura para o 
isolamento de patógenos entéricos utilizados 
atualmente ou são muito inibitórios para Shi-
gella ou não suficientemente inibitórios para 
a microbiota intestinal normal. Além disso, a 
diferenciação das colônias não é tão boa o 
suficiente para evitar o subcultivo de muitos 
não patógenos os quais não fermentam a lac-
tose, tornando-se um trabalho que demanda 
tempo e maior custo, especialmente em 
laboratórios que analisam muitos espécimes 
diariamente (10, 13).
Os meios de cultura em placa mais 
utilizados para o isolamento de Salmonella 
e Shigella em laboratórios clínicos são:
• Eosina-Azul de Metileno (EMB), 
MacConkey (baixa seletividade)
• Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD), 
Salmonella-Shigella (SS), Hektoen Enteric, 
Citrato-Desoxicolato (média seletividade) 
(Figuras 2, 3, 4, 5, 6)
• Verde Brilhante, Bismuto-Sulfito (alta 
seletividade)
No entanto, os meios de alta sele-
tividade só servem para o isolamento 
seletivo de Salmonella e foram adaptados 
de forma incorreta da microbiologia de 
alimentos para a microbiologia clínica 
humana. Infelizmente, também, muitos 
são os laboratórios clínicos brasileiros que 
utilizam de forma completamente equi-
vocada combinações de meios de cultura 
que nada acrescentam para a realização 
de uma coprocultura de boa qualidade. 
Exemplo disso é a utilização de meios 
como ágar manitol hipertônico, ágar CLED, 
ágar sangue, dentre outros.
O surgimento de meios cromogênicos 
e fluorogênicos tem permitido avanços 
significativos na formulação dos meios 
de cultura diferenciais, os quais detectam 
caracteres fenotípicos bacterianos, mani-
festos pela ação de enzimas características 
de certos grupos taxonômicos, orientando 
a sua identificação presuntiva. Estes meios 
incluem em sua composição compostos 
cromogênicos e/ou fluorogênicos, habitu-
almente incolores, os quais servem como 
substrato de enzimas específicas. Quando 
a enzima atua sobre o substrato, este sofre 
uma mudança estrutural, formando um 
novo composto colorido (cromóforo) ou 
fluorescente (12). Nos últimos anos sur-
giram diversos meios cromogênicos úteis 
para o isolamento e identificação presunti-
va de Salmonella spp. (CHROMagar, SMID, 
Rambach, ABC, etc.); no entanto, até o 
momento, nenhum meio cromogênico 
foi desenvolvido para o isolamento e a 
identificação presuntiva de Shigella. O ágar 
Rambach (Figura 7) foi o primeiro meio 
cromogênico disponível comercialmente, 
seguido pelo SMID. 
Muitos estudos demonstraram altos 
índices de sensibilidade e especificidade, 
mas as investigações foram baseadas es-
sencialmente no uso de culturas puras (es-
toque) de Salmonella. Estudos posteriores 
indicaram que a presença da microbiota 
intestinal normal, não inibida previamente 
por caldos de pré-enriquecimento, atrapa-
lhava sobremaneira a performance destes 
meios (3). O ágar Rambach permite a 
identificação de salmonelas não-tifóides, 
gerando colônias de cor vermelha no meio. 
Os coliformes aparecem como colônias 
azuis, verdes, violetas ou incolores. Uma 
vez que as características bioquímicas usa-
das neste meio são altamente específicas 
Figura 5. Ágar Hektoen: Aspecto colonial de 
Salmonella spp. (ausência de fermentação dos 
carboidratos do meio e produção de H2S).
Figura 2. Ágar Hektoen: Aspecto colonial de 
Shigella sonnei.
Figura 6. Ágar SS: Aspecto colonial de 
Salmonella spp. (lactose-negativa e produção 
de H2S).
Figura 3. ÁgarSS: Aspecto colonial de 
Shigella sonnei.
Figura 7. Ágar Rambach: Aspecto colonial 
de Salmonella não-tifóide (fermentação do 
propilenoglicol).
Figura 4. Ágar XLD: Aspecto colonial de 
Shigella sonnei.
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para salmonelas não-tifóides (fermentação 
do propilenoglicol e ausência de beta-
galactosidase), somente poucos resultados 
falsos-positivos são encontrados. 
O maior problema deste meio é a in-
capacidade de isolamento de Salmonella 
enterica sorotipo Typhi, pois estas não 
fermentam o propilenoglicol (17). No meio 
SMID, as colônias de Salmonella são tam-
bém distintas das demais pela formação 
de coloração vermelha intensa (devido à 
formação de ácido a partir do glicuronato e 
ausência de beta-galactosidase), enquanto 
outras bactérias acompanhantes aparecem 
como colônias azuis, violetas ou incolo-
res. Este meio possibilita o isolamento e a 
identificação presuntiva de todos os soro-
grupos de Salmonella. Já o ágar ABC (ágar 
alfa-beta-cromogênico) explora o fato das 
salmonelas poderem ser diferenciadas dos 
membros da família Enterobacteriaceae 
pela presença da enzima alfa-galactosi-
dase, na ausência da atividade da enzima 
beta-galactosidase (10). 
Um total de 1.022 cepas de Salmonella 
spp. e 300 outros bacilos Gram-negativos 
foram inoculados neste meio. Destas, 
99,7% das cepas de Salmonella produzi-
ram colônias com uma coloração verde 
característica, ao passo que somente uma 
cepa de Escherichia coli atípica (0,33%) 
também produziu colônias verdes (100% 
de sensibilidade e 90,5% de especifi-
cidade) (10). Atualmente, outros meios 
cromogênicos para Salmonella já estão 
disponíveis comercialmente e quase todos 
eles (com exceção dos meios Rambach e 
ABC) detectam a atividade de esterase (Fi-
gura 8), positiva para todas as salmonelas. 
Porém, estes meios possuem custo elevado 
e são específicos somente para Salmonella. 
Outros meios em ágar, invariavelmente, 
devem ser usados em conjunto para o iso-
lamento de outros enteropatógenos, one-
rando muito o custo final da coprocultura. 
Estes meios obtiveram excelente aceitação 
em laboratórios de controle de qualidade, 
os quais pesquisam somente Salmonella 
(em amostras de águas e alimentos).
Quando qualquer meio de cultura 
desidrata, o potencial de oxi-redução (eH) 
é alterado, as concentrações dos agentes 
inibidores são aumentadas e o efeito 
mais visível disso é o pouco ou nenhum 
crescimento de colônias. Nos laboratórios 
clínicos, onde é freqüente a prática de se 
confeccionar meios de cultura para uma 
ou mais semanas de trabalho, este efeito 
pode ser minimizado embalando as placas 
em sacolas plásticas ou, preferencialmen-
te, envoltas por plástico-filme de PVC (o 
mesmo utilizado em cozinha). Mesmo 
um tempo razoavelmente curto de duas 
semanas sob refrigeração é suficiente para 
promover efeitos deletérios nos meios em 
placa sem proteção, proporcionando resul-
tados aberrantes nas análises (13).
Isenberg et al. (6) estudaram vários 
meios de cultura seletivos (ágares SS, XLD, 
Hektoen) na tentativa de avaliar o grau de 
supressão da microbiota intestinal normal 
em espécimes fecais, permitindo o cresci-
mento dos reais patógenos significativos. 
Salmonella e Shigella, isolados de espéci-
mes clínicos humanos, foram misturados 
com Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, 
Serratia e Proteus. Foram feitas diferentes 
diluições destas misturas e então seme-
adas nas placas de ágar. Os resultados 
demonstraram um maior grau de inibição 
de Shigella utilizando o ágar SS, ao passo 
que os ágares XLD e Hektoen permitiram 
o isolamento normal desta bactéria (bem 
como de Salmonella), suprimindo conside-
ravelmente a microbiota intestinal normal 
acompanhante.
Vários estudos (5, 25, 26) comprova-
ram a inibição de Shigella por microrga-
nismos pertencentes à microbiota intestinal 
normal. Os primeiros estudos mostraram 
que Klebsiella/Enterobacter inibia o cres-
cimento de Shigella em culturas mistas, 
indicando que uma possível competição 
por fontes de carboidratos fermentáveis 
seria a causa principal. Outros estudos 
comprovaram parcialmente esta teoria, 
uma vez que também foram relatadas ini-
bições do crescimento de Shigella quando 
em presença de Klebsiella/Enterobacter, 
mesmo em meios aerados e com excesso 
de glicose. No entanto, estes estudos tam-
bém provaram que a produção de ácidos 
acético e fórmico por estas bactérias (e 
também por E. coli) fazia com que as 
Shigella entrasse em fase logarítmica de 
morte, comprovando que a produção de 
ácidos voláteis com a concomitante redu-
ção acentuada do meio eram os principais 
mecanismos de inibição do crescimento de 
Shigella em culturas mistas.
Os caldos de enriquecimento seletivo 
são utilizados para diminuir a quantidade 
de bactérias da microbiota intestinal nor-
mal no espécime fecal, inibindo de alguma 
forma seu metabolismo e propiciando o 
desenvolvimento franco dos verdadeiros 
enteropatógenos. Estes caldos devem ser 
sempre utilizados como uma etapa prévia, 
uma vez que a semeadura direta das fezes 
em meios sólidos geralmente leva a um 
supercrescimento da microbiota normal, 
em detrimento às poucas colônias que 
podem ser formadas pelos verdadeiros 
patógenos (13). 
Deve ser observado que cada caldo 
possui suas próprias características e seu 
uso deve ser criterioso, seguindo todas as 
informações dadas pelos fabricantes para 
uma melhor performance. No entanto, em 
muitos laboratórios clínicos estes caldos 
são usados de forma equivocada, muitas 
vezes sem o real conhecimento científico 
de sua utilidade. Muitos são os caldos para 
o pré-enriquecimento seletivo utilizados em 
microbiologia: tetrationato segundo Muller-
Kauffmann, Rappaport-Vassiliadis, selenito 
segundo Leifson, selenito-cistina e GN 
segundo Hajna. No entanto, com exceção 
dos dois últimos, estes meios foram adap-
tados, incorretamente, da microbiologia 
de alimentos para a microbiologia clínica 
Figura 8. Ágar cromogênico: Aspecto colonial 
de Salmonella spp. (utilização do substrato 
cromogênico através da enzima esterase)
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humana, pois são utilizados somente para 
o isolamento de Salmonella. Eles possuem 
diversas substâncias tóxicas para as outras 
bactérias (especialmente E. coli e Shigella) 
e, portanto, não devem ser utilizados em 
espécimes fecais (9, 11, 14, 15). 
Mesmo muito utilizado em micro-
biologia clínica, o caldo selenito-cistina 
também é bastante inibidor para o de-
senvolvimento de Shigella, especialmente 
pelo contato prolongado das células com 
o selenito de sódio (este caldo deve ser 
incubado por 24 horas antes do repique 
em meios sólidos). Já o caldo GN (Gram-
Negative), idealizado por Hajna em 1955 
(4), continua sendo o melhor meio para o 
pré-enriquecimento seletivo tanto para o 
isolamento de Salmonella quanto de Shi-
gella, a partir de espécimes fecais humanos 
(Figura-9). O meio deve ser inoculado 
com pequena porção de fezes, incubado 
por até 8 horas em estufa bacteriológica e 
repicado para meios em placa (o tempo 
ideal para a incubação é de 6 a 8 horas). 
O citrato e o desoxicolato de sódio pre-
sentes em sua formulação impedem o rá-
pido crescimento da microbiota intestinal 
normal, possibilitando a multiplicação 
dos verdadeiros enteropatógenos. No 
entanto, após 8 horas de incubação, esta 
capacidade inibitória começa a se perder 
e as bactérias intestinais acompanhantes 
começam a se multiplicar normalmente. 
Portanto, nunca devemos utilizar o cal-
do GN após 8 horas de incubação pois, 
dessa forma, é praticamente como se 
estivéssemos semeando o espécime fecal 
diretamente nas placas (10, 13). 
Taylor e Schelhart (21) compararam cal-
dos de pré-enriquecimento e três meios em 
placa durante a análise de 1.405 espécimes 
fecais com o intuito de escolherem a melhor 
combinação caldo/placa para o isolamento 
de Shigella. Os caldos GN e selenito foram 
semeados em ágar EMB, SS e XLD. Com 
o uso dos caldos de pré-enriquecimento, 
obteve-seo dobro de isolamentos de Sal-
monella e Shigella em comparação com a 
semeadura direta em placas das amostras 
fecais. Todos os três caldos obtiveram 
resultados ótimos no pré-enriquecimento 
seletivo de Salmonella; no entanto, o caldo 
GN possibilitou o isolamento de quase três 
vezes mais Shigella do que o caldo selenito 
(Tabela 1). A comparação entre os meios em 
placa mostrou que o ágar XLD foi muito 
mais eficiente que os ágares SS e EMB para 
o isolamento de ambos os gêneros bacteria-
nos (Tabela 2), indicando que a combinação 
GN/XLD foi a mais eficiente.
Quatro meios de cultura em placa 
(MacConkey, citrato-desoxicolato, XLD e 
verde brilhante) foram inoculados direta-
mente com amostras fecais e também após 
o pré-enriquecimento seletivo usando os 
caldos selenito, GN e tetrationato, em 
um estudo conduzido por Taylor e Sche-
lhart (22) com 1.117 espécimes fecais na 
tentativa de isolamento de Salmonella e 
Shigella. O ágar XLD foi claramente supe-
rior na detecção destas bactérias (Tabela 
3) e o uso do caldo GN mostrou-se de 
Figura 9. Caldo GN Hajna: 1) meio inoculado 
com espécime fecal; 2) meio não inoculado
Tabela 1. Performance dos caldos de pré-enriquecimento no isolamento de Salmonella e Shigella
Bactéria Semeadura direta Caldo GN* Caldo Selenito*
Salmonella 160 332 260
Shigella 57 118 38
Total 217 450 298
* pré-enriquecimento com posterior semeadura em placa
Tabela 2. Performance dos meios em placa no isolamento de Salmonella e Shigella
Bactéria EMB XLD SS
Salmonella 235 (47%) 497 (99%) 343 (68%)
Shigella 103 (73%) 137 (96%) 75 (53%)
Total 338 (52%) 634 (98%) 418 (65%)
 
Tabela 3. Total de amostras positivas para Salmonella e Shigella usando caldos de pré-enriquecimento seletivo
Bactéria Semeadura direta Caldo GN* Caldo Selenito* Caldo Tetrationato*
Salmonella 157 250 257 164
Shigella 53 77 66 27
Total 210 327 323 191
* pré-enriquecimento com posterior semeadura em placa
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fundamental importância para a detecção 
de ambos os patógenos, especialmente 
Shigella (Tabela 4).
Vassiliadis et al. (24) reportaram que 
105 Shigella foram isoladas em ágar citrato-
desoxicolato quando semeadas diretamen-
te mas somente 16 foram recuperadas após 
o uso do pré-enriquecimento com caldo 
selenito, das quais 13 de 25 foram S. sonnei 
e somente três de 78 foram S. flexneri. 
Dois caldos de enriquecimento e quatro 
meios em placa foram avaliados por Taylor e 
Schelhart (23), comparando a eficiência de 
detecção de Salmonella e Shigella a partir 
de 1.597 espécimes fecais. Todas as 17 
Shigella foram isoladas no ágar XLD após 
o enriquecimento prévio em caldo GN. 
A semeadura direta das fezes nos quatro 
meios em placa permitiu o isolamento de 
somente 92 das 170 Salmonella (54%); da 
mesma forma, somente 10 das 17 Shigella 
(59%) foram recuperadas. Os caldos de 
pré-enriquecimento se mostraram efetivos 
para a recuperação de todos os patógenos 
pesquisados, sendo que o caldo GN propor-
cionou o isolamento de 87% das Salmonella 
e 100% das Shigella e o caldo selenito 97 e 
76%, respectivamente. 
Foi observado que o ágar XLD produ-
ziu mais resultados positivos para ambos 
os patógenos em comparação com os 
outros três meios. O ágar XLD recuperou 
3%, 12% e 99% mais Salmonella que os 
ágares Hektoen, SS e EMB, respectiva-
mente. Para Shigella, o ágar XLD produziu 
13%, 33% e 44% mais isolamentos que 
os ágares Hektoen, SS e EMB, respectiva-
mente. Neste mesmo estudo, os autores 
observaram que o número de resultados 
falsos-positivos na observação preliminar 
das placas (colônias H2S+ que não foram 
identificadas como Salmonella) foi maior 
nos meios SS e Hektoen (Tabela 5).
A vantagem do ágar XLD sobre os ou-
tros meios seletivos avaliados neste estudo 
(SS e Hektoen) provavelmente seja um 
sistema de diferenciação de colônias com 
maior poder de discriminação (a xilose, 
presente no XLD, é fermentada por muito 
mais membros da família Enterobacteriace-
ae do que a salicina, presente no Hektoen). 
Portanto, todas as colônias salicina(-) de não 
fermentadores ou fermentadores tardios de 
lactose/sacarose são uma fonte de possíveis 
resultados falsos-positivos no ágar Hektoen. 
No entanto, a maioria destes microrga-
nismos fermenta rapidamente a xilose, 
possibilitando uma maior discriminação no 
ágar XLD. Já o ágar SS, não possuindo nem 
xilose nem salicina como características di-
ferenciais (somente lactose), é dependente 
quase que exclusivamente do maior efeito 
inibitório de sua formulação.
King e Metzger (7, 8) desenvolveram o 
meio de cultura Hektoen Enteric em 1968 
como um modo de melhorar a performan-
ce de isolamento de patógenos intestinais, 
obtendo bom crescimento de Shigella e 
Salmonella através da utilização de proteose-
peptona e a adição da salicina como um 
terceiro carboidrato fermentável, além de 
melhorar o sistema indicador da produção 
de H2S. Durante o estudo, comparando a 
performance do recém-criado meio Hektoen 
Enteric com os ágares SS e EMB, somente Sal-
monella e Shigella foram pesquisados a partir 
da semeadura de 2.855 espécimes fecais. 
Os autores relataram que o meio Hektoen 
possibilitou mais isolamentos de Shigella que 
os demais. Do total de 98 Shigella isoladas 
de todos os três meios, 97 foram isoladas em 
Hektoen e somente 40 no ágar SS.
Citrobacter freundii, bacilo Gram-
negativo pertencente à família Enterobac-
teriaceae, membro da microbiota intestinal 
normal da grande maioria das pessoas 
sadias, lactose(-) e produtor de H2S, não 
tem o seu crescimento inibido nos ágares 
EMB, MacConkey, Hektoen e XLD, mas o 
ágar SS mostra-se bastante inibidor para 
esta espécie. Conseqüentemente, C. freun-
dii está entre as causas menos freqüentes 
de resultados falsos-positivos no ágar SS. 
No ágar XLD esta espécie geralmente não 
causa resultados falsos-positivos pois, 
devido ao sistema diferencial daquele 
meio, as colônias de C. freundii tornam-se 
amarelas (Figura-10), semelhantes àquelas 
Tabela 4. Total de amostras positivas para Salmonella e Shigella utilizando os meios em placa
Bactéria MC XLD CD VB
Salmonella 178 (55%) 305 (94%) 115 (35%) 230 (71%)
Shigella 66 (75%) 78 (89%) 24 (27%) 55 (63%)
Total 244 (59%) 383 (93%) 139 (34%) 285 (69%)
MC: MacConkey; XLD: Xilose-lisina-desoxicolato; CD: Citrato-desoxicolato; VB: Verde brilhante.
Tabela 5. Distribuição dos resultados falsos-positivos (H2S+ não Salmonella) nos meios em placa
Bactéria XLD SS Hektoen
Citrobacter freundii 27 (6,7%) 82 (9,5%) 361 (36,5%)
Proteus vulgaris/mirabilis 122 (30,1%) 359 (41,6%) 244 (24,7%)
Total 149 (36,8%) 441 (51,1%) 605 (61,2%)
Figura 10. Ágar XLD: Aspectos coloniais de 
Citrobacter freundii (Cf), Proteus mirabilis 
(Pm) e Escherichia coli (Ec)
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Figura 11. Ágar Hektoen: Aspecto colonial de 
Citrobacter freundii (ausência de fermentação 
dos carboidratos do meio e produção de H2S).
dos coliformes da microbiota intestinal 
normal, mesmo as cepas fermentadoras 
tardias de lactose são xilose(+) e lisina(-). 
O ágar Hektoen, entretanto, não possui 
nenhum sistema inibidor nem diferencial 
para distinguir C. freundii de Salmonella, 
uma vez que ambos podem ser lactose/
sacarose/salicina(-) e H2S(+). Portanto, C. 
freundii também é a causa mais freqüente 
de resultados falsos-positivos quando se 
usa este meio de cultura em amostras fecais 
(13) (Figura 11).
Os efeitos de temperaturas de incu-
bação diferentes (20, 35 e 40 oC), longos 
períodos de transporte, caldos de pré-
enriquecimento e meios em placa foram 
determinados por análises exaustivas, 
pesquisando Salmonella e Shigella, em 132 
amostras fecais (20). Estes espécimes foram 
semeados diretamente em ágares SS, XLD e 
EMB, meios de transporte Cary-Blair (CB) e 
salina e caldos de pré-enriquecimento GN 
e selenito. Os melhores resultados dos cal-
dos na recuperação de Salmonella foram 
GN > selenito > salina > CB > semeadura 
direta. Para Shigella,GN > salina > seme-
adura direta > CB > selenito, provando 
que o caldo selenito não é adequado para 
o isolamento de Shigella. A eficiência dos 
meios em placa, tanto para Salmonella 
quanto para Shigella, foi: XLD > EMB > SS. 
Além disso, 10 das 39 Shigella não foram 
isoladas a partir da combinação selenito/
SS. As temperaturas de incubação não 
afetaram as taxas de recuperação de Sal-
monella; no entanto, somente metade das 
Shigella foi isolada a 40oC e os isolamentos 
a 20 e 35oC foram equivalentes. A análise 
das placas com crescimento de Salmonella 
e Shigella revelou que a semeadura direta 
das amostras fecais deve ser desencoraja-
da, uma vez que o supercrescimento da 
microbiota intestinal normal atrapalha o 
desenvolvimento daquelas colônias dos 
verdadeiros patógenos, principalmente 
através da competição por nutrientes.
Tem sido provado por diferentes 
autores (2, 10, 13, 14, 16,) que a combi-
nação de pré-enriquecimento com caldo 
selenito e semeadura posterior em ágar SS 
é excessivamente inibidora para Shigella. 
Taylor e Schelhart (23) mostraram que 19 
das 39 cepas de Shigella não cresceram em 
nenhuma das 78 replicatas por espécime 
em placas de ágar SS e 20 não foram iso-
ladas dos 48 subcultivos de caldo selenito 
com Shigella. Cinco de seis S. flexneri não 
cresceram em ágar SS, quatro de seis não 
cresceram em selenito, nenhuma das cinco 
cepas de S. dysenteriae foi detectada na 
combinação selenito/SS e somente uma 
cresceu em ágar SS. Desta forma, somen-
te 10 das 39 cepas de Shigella puderam 
ser isoladas da combinação selenito/SS, 
mesmo com 16 replicatas de cada amostra 
fecal. Os autores concluíram que é alta-
mente insatisfatória a combinação destes 
meios, embora eles sejam utilizados por 
muitos laboratórios clínicos para a reali-
zação de coproculturas. 
Em um estudo conduzido por Pollock 
e Dahlgren (16), em um período de 12 
meses, vários meios em placa (MacConkey, 
XLD, SS, Hektoen) e caldos de pré-enri-
quecimento (selenito, tetrationato) para o 
isolamento de Salmonella e Shigella foram 
comparados, utilizando 455 amostras fe-
cais. Destas foram isolados 53 patógenos, 
dos quais 56% foram S. sonnei e 13% 
foram S. flexneri. Destes isolados, 90% 
foram recuperados em ágar XLD, 87% em 
ágar Hektoen e 80% em ágar MacConkey, 
mas somente 28% em ágar SS. Menos da 
metade das Shigella foi isolada a partir do 
pré-enriquecimento em caldo selenito e 
somente duas foram isoladas à partir do 
caldo tetrationato. O ágar XLD mostrou-
se o melhor meio para o isolamento tanto 
de Salmonella quanto de Shigella, seguido 
pelo ágar Hektoen. Ambos possuem for-
mulações que evitam a combinação de 
ingredientes sabidamente responsáveis 
pela baixa eficiência na recuperação de 
várias cepas de Shigella, como ocorre no 
ágar SS (sais biliares + citrato).
Dunn e Martin (2) avaliaram cinco 
meios de transporte, oito meios em placa 
e três caldos de enriquecimento seletivo 
para o isolamento de Salmonella e Shigella 
em oito laboratórios de diferentes regiões 
dos Estados Unidos, os quais submeteram 
para análise 490 espécimes fecais de suas 
rotinas nos meios de transporte fornecidos 
pelos autores. Os resultados sugerem a 
utilização de mais de um meio de cultura 
para o isolamento primário aliado ao uso 
de um caldo de pré-enriquecimento sele-
tivo e a obrigatoriedade de utilização de 
swabs com meios de transporte nos casos 
onde as amostras “in natura” não puderem 
ser inoculadas imediatamente. Os autores 
concluíram, também, que o uso de ágar 
XLD em conjunto com o caldo GN como 
pré-enriquecimento seletivo foi a melhor 
combinação para o isolamento de Salmo-
nella e Shigella.
Embora um número bastante grande 
de meios de transporte tenha sido descrito, 
eles possuem as mesmas funções básicas: 
manter o status quo da população bacteria-
na no espécime clínico, bem como prevenir 
o supercrescimento de uma população 
bacteriana em particular (como as entero-
bactérias da microbiota normal intestinal). 
Swabs retais podem ser utilizados, desde 
que adequada e racionalmente. Deve-se dar 
preferência para a inoculação das amostras 
“in natura” mas, nos casos onde a inocu-
lação destas amostras no laboratório não 
seja possível (como nos casos de envio de 
espécimes para laboratórios de referência 
localizados em outras cidades), os swabs 
podem e ser utilizados. No entanto, jamais 
utilizar swabs “secos”, ou seja, sem meios 
de transporte. Atualmente os swabs comer-
ciais possuem preços bastante acessíveis a 
qualquer laboratório e devem ter preferên-
cia. Colocando os custos diretos e indiretos 
na ponta do lápis, os swabs confeccionados 
no próprio laboratório elevam substancial-
mente o valor final do teste (13). 
NewsLab - edição 86 - 2008 70
Protocolos de Microbiologia Clínica
Alguns estudos relataram a importância 
da utilização de meios conservantes para 
espécimes fecais com a finalidade de rea-
lização de coproculturas. Stuart (19) foi o 
primeiro a publicar um meio quimicamente 
definido para a preservação de células bac-
terianas até o momento da inoculação em 
meios apropriados no laboratório, inclusive 
para amostras destinadas ao cultivo de Sal-
monella e Shigella. Seu estudo concluiu que 
as evidências sugeriam que os swabs retais 
preservados no meio de transporte proposto 
não possuíam performance inferior aos es-
pécimes fecais “in natura” para o isolamen-
to de Salmonella e Shigella após um ou dois 
dias de transporte. Posteriormente, Cary e 
Blair (1) reportaram o desenvolvimento de 
um novo meio de transporte para amostras 
fecais, indicando que Salmonella e Shigella 
poderiam ser isoladas por até 49 dias, Vibrio 
cholerae por até 22 dias e Yersinia pestis por, 
pelo menos, 75 dias quando armazenadas 
neste novo meio.
No entanto, estudos mais recentes, 
comparando a eficiência na manutenção 
de células viáveis de Shigella em meios 
de transporte comumente utilizados em 
laboratórios clínicos (Cary-Blair e salina 
glicerinada tamponada), questionaram a 
real utilidade dos swabs com meios de 
transporte no isolamento de patógenos 
entéricos mais delicados e que morrem 
rapidamente quando há demora no seu 
isolamento. Em um estudo (1), 376 es-
pécimes fecais de pacientes envolvidos 
em surtos de diarréia por Shigella foram 
analisados utilizando swabs com meio de 
transporte Cary-Blair e salina glicerinada 
tamponada. A duração do transporte das 
amostras até o laboratório variou de um a 
seis dias. Os maiores índices de isolamento 
foram obtidos em espécimes refrigerados 
ou congelados, em ambos meios de trans-
porte, em comparação com os meios em 
temperatura ambiente. Esta diferença foi 
mais evidente na análise dos espécimes 
deixados à temperatura ambiente por mais 
de três dias. Os autores concluíram que a 
salina glicerinada tamponada é melhor 
para o transporte e posterior isolamento 
de Shigella do que o swab com Cary-Blair, 
mas o grau de superioridade é dependente 
da temperatura de transporte. 
Baseado nas informações anteriores 
e ainda na nossa experiência prática, 
sugerimos a utilização do caldo GN (com 
incubação a 35-37oC por 6 a 8 horas) 
e repique deste para placas de ágares 
MacConkey e XLD, para uma ótima recu-
peração de Salmonella, Shigella e outros 
enteropatógenos bacterianos. No entanto, 
a análise destes últimos será tema da Parte 
2 deste protocolo de coprocultura. 
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