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Curso de 
Biologia Molecular Básica 
 
MÓDULO IV 
Atenção: O material deste módulo está disponível apenas como parâmetro de estudos para 
este Programa de Educação Continuada. É proibida qualquer forma de comercialização do 
mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores 
descritos nas Referências Bibliográficas.
 
 
 
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MÓDULO IV 
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 
Há várias técnicas em biologia molecular usadas numa ampla variedade de 
estudos tais como genética de populações, estudos sobre evolução ou filogenia, 
mapeamento e expressão gênica. Estas técnicas se desenvolveram a partir de 
métodos básicos. 
No início da década de 1970, novas maneiras de se analisar e explorar as 
principais moléculas constituintes de uma célula começou a ser posta em prática. 
Essas metodologias inovadoras foram chamadas de tecnologia do DNA 
recombinante.
Com o desenvolvimento técnico, vários avanços significativos têm sido 
obtidos através do isolamento, análise e síntese de sequência de DNA e genes, e da 
introdução desses DNAs recombinantes em células vivas para o estudo da sua 
função e dos mecanismos que controlam sua expressão. Atualmente, os esforços 
estão voltados para o entendimento das relações entre ácidos nucleicos e proteínas 
que resultam em, virtualmente, todos os eventos genéticos na célula. 
1. Extração de DNA
Vários procedimentos de extração de DNA de tecidos vegetais ou de 
microrganismos têm sido descritos na literatura. O que se observa em geral é que 
protocolos padrão são utilizados com algumas modificações visando resolver os 
problemas específicos da espécie em estudo. Os protocolos se caracterizam por 
utilizar o detergente catiônico CTAB (‘cationic hexadecyl trimethyl ammonium 
bromide’) no tampão de extração e são, portanto, comumente denominados de 
protocolos CTAB; ou fenol. 
 
 
 
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A maioria dos protocolos de extração de DNA envolve em geral cinco etapas 
básicas. Na primeira etapa, algum tipo de maceração mecânica é utilizado para 
romper as paredes e membranas celulares das células microbianas, crescidas em 
meio líquido e separadas desse por filtração ou centrifugação, normalmente feita na 
presença de nitrogênio líquido. Na segunda etapa, as células maceradas são 
ressuspendidas em um tampão de extração, contendo algum detergente (SDS no 
caso da extração que utiliza fenol), antioxidantes, EDTA e agente tamponante, 
visando à solubilização de membranas lipoproteicas e desnaturação de proteínas 
enquanto o DNA é protegido da ação de enzimas de degradação. Esta suspensão é 
submetida a uma temperatura entre 50 e 65 ºC durante 15 a 60 minutos para facilitar 
a solubilização e homogeneização da suspensão. Na terceira etapa, esta suspensão 
é submetida a uma extração com um solvente orgânico, clorofórmio-álcool 
isoamílico. As fases, orgânica e aquosa são separadas por intermédio de 
centrifugação. Nesta extração, lipídios, proteínas e a maioria dos polissacarídeos 
são retidas na fase orgânica inferior, enquanto que o DNA, RNA e alguns 
polissacarídeos são retidos na fase superior (aquosa). Na quarta etapa, um álcool 
(isopropanol ou etanol) e sal (NaCl) são adicionados à fase aquosa. O DNA na 
presença de sal e álcool forma um precipitado frequentemente visível que pode ser 
peletizado1 por centrifugação. Após lavagens do precipitado com álcool, na quinta e 
última etapa, este precipitado de DNA/RNA é ressuspendido em um tampão Tris-
EDTA contendo RNAse para degradar o RNA, restando apenas o DNA genômico 
desejado.
2. Quantificação de DNA em gel de agarose 
Após finalizar os procedimentos de extração de ácidos nucleicos deve-se 
verificar a quantidade de DNA obtida. A quantidade de DNA pode ser determinada 
por dois métodos: a espectrofotometria ou em gel de agarose, por leitura da 
intensidade de fluorescência do brometo de etídeo. O brometo de etídeo é um 
corante que se intercala nas moléculas dos ácidos nucleicos sendo que a luz 
ultravioleta induz sua fluorescência. A quantidade observada sob UV é proporcional 
 
 
 
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à massa total de DNA da amostra colocada no poço da eletroforese. Para quantificá-
la, faz-se a foto (Figura 1) em câmara polaroide (ou também câmera digital) e 
compara-se a fluorescência da amostra àquela de um padrão conhecido. 
Os géis de agarose são dissolvidos na presença de tampão apropriado até 
se obter uma solução clara e transparente. Após a sua fusão em alta temperatura 
(ou em forno micro-ondas) a solução ainda quente é colocada em um suporte ou 
molde em geral, de acrílico. Após ocorrer a solidificação da matriz, cuja densidade é 
determinada pela concentração da agarose, as amostras podem ser aplicadas. 
Quando o campo elétrico é aplicado por meio do gel, o DNA, que é carregado 
negativamente em um pH neutro, migra para o ânodo. A taxa de migração é 
determinada por uma série de parâmetros dentre os quais podem ser citados: 
concentração da agarose, peso molecular do DNA, conformação do DNA, voltagem 
aplicada (para uma máxima resolução, a voltagem não deve ser maior que 5 V/cm – 
entenda-se pela medida em cm, a distância entre os eletrodos da cuba de 
eletroforese), direção do campo elétrico e composição do tampão. 
3. Reação de Polimerização em Cadeia – PCR 
Até meados da década de 1980, as técnicas de Biologia Molecular estavam 
limitadas pela sensibilidade dos métodos de clonagem e detecção. Esses métodos 
baseavam-se na marcação isotópica de sondas de DNA capazes de detectar 
quantidades ínfimas de uma dada sequência-alvo, tais como fragmentos gênicos e 
mRNA. Em, 1985, um grupo de cientistas da Cetus Corporation padronizou uma 
técnica por meio da qual eram geradas, a partir do DNA genômico, grandes 
quantidades de um fragmento específico de DNA, correspondendo a genes 
presentes como cópia única do genoma. 
Essa nova e revolucionária metodologia, baseada em uma reação de 
replicação in vitro, consiste na chamada Reação de Polimerização em Cadeia 
(Polymerase Chain Reaction – PCR), na qual se obtém o enriquecimento de um 
fragmento específico de DNA por meio de sua duplicação em modo exponencial 
(Figura 2). Assim, um gene presente no genoma como cópia única pode ser 
amplificado a partir de DNA genômico complexo, podendo ser posteriormente 
 
 
 
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visualizado como uma banda discreta, constituída por moléculas de DNA, por meio 
de eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídeo. 
O princípio da PCR envolve três etapas básicas, requeridas na reação de 
síntese de qualquer DNA, que são repetidas por várias vezes, em ciclos: 
Desnaturação térmica do DNA molde; 
Anelamento de oligonucleotídeos sintéticos, que funcionam como os 
iniciadores da reação de polimerização, a cada uma das fitas do DNA molde; 
3) Polimerização das novas fitas de DNA a partir de cada um dos 
iniciadores, utilizando cada um dos quatro dNTP como substrato da reação de 
polimerização. 
O processo de amplificação envolve repetidos ciclos de desnaturação 
térmica do DNA molde, anelamento dos iniciadores (primers) às suas sequências 
complementares e extensão dos oligonucleotídeos anelados por uma DNA 
polimerase altamente resistente à desnaturação em temperaturas elevadas. Estes
primers são sintetizados artificialmente de maneira que suas sequências de 
nucleotídeos sejam complementares às sequências específicas que flanqueiama 
região alvo. Assim, os iniciadores anelam-se às fitas opostas da sequência-alvo e 
são orientados de tal forma que a síntese de DNA ocorra por meio da região 
compreendida entre estes. Tem-se, então, a duplicação desse segmento de DNA a 
cada ciclo de reação, e a cada ciclo sucessivo dobra a quantidade de DNA 
sintetizada no ciclo anterior. O resultado é o acúmulo exponencial do fragmento 
específico de DNA aproximadamente a 2n, onde n é igual ao número de ciclos 
realizados.
No início, o principal problema técnico foi à enzima DNA polimerase, que 
perdia a atividade enzimática rapidamente a elevadas temperaturas, necessárias no 
processo de desnaturação do DNA. O isolamento de enzimas termoestáveis, a partir 
de organismos termofílicos, como bactérias nativas de fontes termais ou de 
chaminés vulcânicas do fundo do mar, trouxe a solução para esse problema técnico. 
O grande impacto dessa técnica foi à utilização da DNA polimerase 
termoestável, a partir da purificação da Thermus aquaticus, a Taq DNA polimerase, 
em substituição ao fragmento Klenow da DNA polimerase I de E. coli, tornando a 
técnica, uma das maiores realizações da Biologia Molecular. A grande estabilidade e 
 
 
 
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eficiência dessas DNAs polimerases, aumentou a especificidade e sensibilidade da 
reação, assegurando que os iniciadores estarão anelados estavelmente somente às 
suas sequências perfeitamente homólogas. Além disso, houve um ganho quanto à 
eficiência da reação, obtendo-se um maior rendimento do produto amplificado e 
também a possibilidade de amplificação de fragmentos de DNA de maior tamanho. A 
maioria das enzimas DNA polimerase usadas em PCR é obtida a partir da clonagem 
e do melhoramento de seus genes, o que envolve procedimentos da tecnologia do 
DNA recombinante. 
Figura 2. Representação esquemática da amplificação do DNA utilizando a técnica do PCR. 
Essa metodologia apresenta uma grande versatilidade, tendo vasta 
aplicabilidade, como: 
Varredura e/ou sequenciamento rápido de insertos de DNA; 
 
 
 
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Estudos de expressão qualitativa e quantitativa de genes específicos; 
Identificação de mRNA gerado por meio de processamento alternativo do 
pré-mRNA;
Amplificação e clonagem de sequências genômicas a partir do uso de 
pequenas quantidades de DNA genômico complexo; 
Síntese química de genes por meio da amplificação e junção de partes de 
uma sequência de DNA conhecida; 
Diagnóstico por meio da detecção das sequências de DNA específicas de 
um determinado patógeno; 
Teste de paternidade; 
Mutagênese, sítio dirigida, de modo a obter alterações de uma ou mais 
bases no DNA amplificado. 
4. Parâmetros da amplificação 
Em razão a grande diversidade de aplicações da PCR, cada situação pode 
requerer a otimização de um protocolo específico. No entanto, o uso de um protocolo 
padrão exemplifica as condições para o bom funcionamento da maioria dos 
experimentos.
Uma reação típica de PCR é constituída pelos seguintes componentes: 
Água MiliQ estéril; 
A enzima Taq DNA polimerase e seu respectivo tampão de reação 
(concentrado 10x); 
Os desoxirribonucleotídeos trifosfato (dNTP: numa mistura equimolar de 
dATP, dCTP, dGTP e dTTP, que irão funcionar como substrato da reação de 
polimerização); 
O par de oligonucleotídeos que funcionarão como iniciadores (primers) que
vêm na forma de pellets liofilizados; 
E o cátion bivalente magnésio (Mg+2), que é um cofator da Taq polimerase.
É de grande importância o preparo de uma mistura (“mix”) dos componentes 
para reação de PCR, desta maneira a variabilidade intrínseca é minimizada, 
considerando a alta sensibilidade da técnica. Na grande maioria dos protocolos de 
 
 
 
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PCR, é usado o procedimento de partida a quente (hot start), visando maximizar a 
especificidade dos primeiros ciclos da reação de amplificação. O procedimento de 
partida a quente convencional envolve a adição da enzima Taq DNA polimerase a 
cada um dos tubos após seu aquecimento prévio a 95ºC. 
Os parâmetros a serem definidos dependem das características do DNA 
molde, dos iniciadores e do protocolo de amplificação. Assim, pode-se definir um 
parâmetro padrão envolvendo três etapas: desnaturação, anelamento e extensão. A 
fita dupla do DNA alvo é desnaturada através da elevação da temperatura para 92 a 
95 C, de 15 segundos a 1 minuto. Na etapa de anelamento, a temperatura é 
rapidamente reduzida para 35 a 60 C, dependendo essencialmente do tamanho e 
sequência do primer utilizado, permitindo a hibridização DNA-DNA de cada primer
com as sequências complementares que flanqueiam a região alvo. Em seguida, a 
temperatura é elevada para 72 C para que a enzima DNA polimerase realize a 
extensão a partir de cada terminal 3’ dos primers. Esta extensão envolve a adição de 
nucleotídeos utilizando como molde a sequência alvo, de maneira que uma cópia 
desta sequência é feita no processo. Este ciclo é repetido por cerca de 25 a 40 
vezes. Uma vez que a quantidade de DNA da sequência alvo dobra a cada ciclo, a 
amplificação segue uma progressão geométrica de maneira que, depois de apenas 
20 ciclos, são produzidos mais de um milhão de vezes a quantidade inicial de 
sequência alvo. Na extensão final, a temperatura usada na etapa de extensão é 
repetida por cerca de 5 a 10 minutos. Esta etapa de incubação prolongada visa 
assegurar que toda população de DNA amplificada encontre-se como uma fita dupla 
e de tamanho completo. Por fim, uma incubação a 4 ºC por tempo indefinido. 
Esta escala de amplificação permite, portanto, iniciar com quantidades 
mínimas de DNA (da ordem de alguns picogramas ou nanogramas) e terminar a 
reação com grandes quantidades de DNA de uma sequência específica de 
interesse.
O DNA em grande quantidade pode ser facilmente detectado a olho nu 
diretamente em gel de eletroforese por meio de corantes específicos para DNA 
(brometo de etídeo). Entretanto, a técnica de PCR ainda apresentava uma limitação 
significativa na obtenção de marcadores moleculares anônimos distribuídos pelo 
genoma. A construção de primers para amplificação via PCR dependia 
 
 
 
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essencialmente do conhecimento prévio das sequências de nucleotídeos que 
flanqueiam a sequência de DNA de interesse. Para se conhecer estas sequências é 
necessária a clonagem e sequenciamento da região. Em vista disso, com exceção 
de alguns genes de sequência conhecida, a PCR apresentou, de início, um uso 
limitado como técnica para a obtenção de marcadores moleculares. 
A facilidade, rapidez, versatilidade e sensibilidade da PCR, a torna 
particularmente poderosa para estudos genético-moleculares, envolvendo grande 
número de indivíduos de qualquer organismo vivo. 
5. Cuidados importantes na utilização da técnica 
A grande sensibilidade da técnica exige cuidados importantes na sua 
manipulação e desenvolvimento. Reagentes, soluções e os materiais utilizados 
devem estar livres de possíveis contaminações por DNAs exógenos. Dessa forma: 
- Devem-se utilizar luvas; 
- As soluções e a água devem ser de boa qualidade; 
- A vidraria deve estar adequadamente preparada; 
- O material plástico, tais como ponteiras, tubos tipo Eppendorf, deve ser 
novo e de procedência confiável; 
- Se possível, as micropipetas devem ser de uso exclusivo nos 
procedimentos de PCR; 
- E um local de trabalho reservado e devidamente limpo. 
6. Eletroforese em gelde agarose 
A eletroforese em gel de agarose é usada como método analítico e 
preparativo, pois, uma vez resolvidas, isto é, separadas as moléculas de DNA, um 
fragmento de tamanho específico pode ser excisado do gel e purificado para, 
posteriormente ser usado em uma gama de procedimentos utilizando técnicas de 
manipulação genética. 
Os géis de agarose comumente preparados na rotina de laboratórios são 
indicados para separar fragmentos de DNA que variam entre poucas centenas de 
 
 
 
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pares de bases até cerca de 40-50 kb. Para fragmentos com tamanhos menores, é 
indicada a eletroforese em gel de poliacrilamida ou a utilização de agaroses 
especiais, quimicamente modificadas. 
A agarose é um polímero linear extraído de algas marinhas, e o gel é 
formado por uma complexa rede desse polímero. O polímero é fundido na presença 
da solução tampão adequado até que se obtenha uma preparação transparente e 
homogênea. Com temperatura próxima de 60ºC, a solução é transferida para um 
molde utilizado para o preparo do gel (figura). Após a gelificação, o diâmetro dos 
poros da matriz formada é diretamente proporcional à concentração do polímero 
utilizada. 
Em razão da presença de grupamentos fosfato, a molécula de DNA possui 
carga negativa em pH neutro ou alcalino. Consequentemente, quando aplicada a um 
gel e submetida a um campo elétrico, essa macromolécula migrará em direção ao 
anodo, ou seja, pólo positivo (Figura 3). 
Figura 3. Modelo esquemático da eletroforese, demonstrando o “poço” em que os 
fragmentos de DNA são aplicados e submetidos a um campo elétrico, de maneira que os fragmentos 
migrem do pólo negativo para o pólo positivo. O esquema também mostra que fragmentos de menor 
tamanho migram mais rápido que fragmentos de maior tamanho. 
A velocidade da migração bem como o poder de resolução de um gel 
depende do tamanho e da forma da molécula. Para a visualização e a interpretação 
dos resultados, são necessárias a incorporação de um agente intercalante de DNA 
(brometo de etídeo) e a utilização de marcadores de massa molecular apropriados, 
de maneira que migrem em paralelo às amostras de interesse. 
 
 
 
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Assim, pode-se definir um parâmetro padrão envolvendo as seguintes 
etapas:
Preparar uma solução de agarose (a concentração dependerá do tamanho 
da molécula de DNA a ser visualizada) em tampão TAE ou TBE (diluído). Aquecer 
no forno micro-ondas até a total dissolução da agarose. Esperar a solução esfriar; 
Esperar esfriar e adicionar Brometo de etídeo (10 mg/mL); 
Colocar a solução, no suporte (“cama”) de eletroforese; 
Colocar o pente de modo que não forme bolhas. Aguardar o gel endurecer e 
retirar o pente; 
Colocar o conjunto na cuba de eletroforese, cobrindo com o tampão; 
Colocar nos poços o DNA (diluído) e misturado com solução azul de 
bromofenol.
Encaixar a tampa da cuba e os eletrodos de modo que o DNA migre do pólo 
negativo para o positivo; 
 
 
 
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Ajustar a voltagem e o tempo; 
Visualizar as bandas obtidas com auxílio de luz ultravioleta. 
7. Fatores que afetam a migração do DNA no gel 
Tamanho da molécula de DNA e concentração do gel – As moléculas 
maiores migram mais lentamente em razão de um maior efeito friccional de arraste e 
porque as mesmas promovem menor aquecimento em seu trajeto de migração 
através dos poros do gel. O tamanho da molécula de DNA, dado em número de 
pares de bases (pb), é diretamente proporcional à massa molecular que é dada em 
Daltons (Da). A densidade do gel determina o intervalo de tamanho das moléculas 
que podem ser adequadamente separadas. Existem diferentes tipos de marcadores 
com massa molecular variando desde poucos pares de bases até dezenas de kb. O 
tamanho de uma molécula de DNA pode ser determinado com precisão razoável se 
 
 
 
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um marcador de massa molecular adequado migra em paralelo com as moléculas 
que estão sendo fracionadas. Quando a concentração desses marcadores é 
conhecida, pode-se fazer uma estimativa visual de concentrações desconhecidas 
das amostras por comparação direta da intensidade das bandas. Quantificações 
mais acuradas devem ser feitas por densitometria. No entanto, onde houver 
necessidade de determinar concentrações desconhecidas com alta precisão, a 
espectrofotometria é a metodologia mais indicada. 
Conformação do DNA – O DNA apresenta três formas distintas que migram 
em velocidades diferentes no gel de agarose (Figura 4). As formas são: circular 
superenovelada (forma 1), circular relaxada (forma 2) e linear (forma 3). A motilidade 
das diferentes formas pode variar de acordo com o tamanho da molécula de DNA e 
também depende do diâmetro dos poros do gel, voltagem e força iônica do tampão 
de corrida. A forma 1 migra mais rapidamente que a forma 3, e a forma 2 é a mais 
lenta. A forma 1 é a mais rápida, em razão do seu menor diâmetro. 
Figura 4. Representação esquemática e também por meio de fotografia das formas 
superenovelada e circular relaxada do DNA. 
Agentes intercalantes – O brometo de etídeo (Figura 5) é um análogo de 
base que se intercala na molécula de DNA e emite fluorescência quando exposto à 
luz ultravioleta (UV). As moléculas de DNA fracionadas em géis de agarose 
contendo brometo de etídeo são diretamente visualizadas na presença da luz UV, e 
+
-
Superenovelada 
Circular relaxada 
UV
Superenovelada Circular relaxada 
 
 
 
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o limite de detecção é cerca de 10 ng/banda de ácido nucleico. A intensidade de 
fluorescência é diretamente proporcional à massa molecular do fragmento de ácido 
nucleico. Apesar de ser bastante ampla a faixa de UV, geralmente, o comprimento 
de onda mais utilizado para detecção de ácidos nucleicos é de 300-360 nm 
(nanômetros). O brometo de etídeo diminui a motilidade do DNA, e esse 
retardamento na corrida se deve ao aumento no tamanho e na rigidez das formas 
linear e circular relaxada. O efeito intercalante retarda a corrida da forma linear cerca 
de 15% e é mais pronunciado no DNA relaxado, pois nesse tipo de conformação a 
presença de brometo de etídeo induz à formação de superenovelamento positivo, 
que acarreta aumento na motilidade eletroforética. 
8.
Figura 5. Estrutura química do brometo de etídeo. 
Voltagem – As moléculas de DNA migram por meio do gel com velocidade 
diretamente proporcional à voltagem aplicada, essa correlação acontece até o limite 
de 5V/cm, que é a distância entre os eletrodos. A linearidade é perdida quando se 
aplica uma voltagem maior, então as moléculas maiores migram mais rapidamente 
que as menores. 
Tampão de corrida - A composição e a força iônica do tampão de corrida 
influenciam na migração e na qualidade de resultado da eletroforese. Os tampões 
mais usados são o TAE (Tris-Acetato-EDTA) e TBE (Tris-Borato-EDTA). O TBE tem 
um custo mais alto que o TAE, porém apresenta maior capacidade tamponante, 
enquanto o TAE promove uma corrida cerca de 10% mais rápida quando o DNA 
apresenta-se sob forma linear. Entretanto, a capacidade de resolução de DNA de fita 
 
 
 
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dupla é semelhante nos dois tampões. A baixaforça iônica promove uma migração 
muito lenta, e a alta força iônica provoca alta condutividade elétrica, gerando calor e 
podendo desnaturar o DNA. 
8. Cuidados importantes na utilização da técnica 
Essa técnica exige o uso de materiais perigosos e mutagênicos (luz UV e 
brometo de etídeo), portanto são necessários cuidados importantes na sua 
manipulação e desenvolvimento, como: 
- Usar luvas para manipular géis ou soluções contendo brometo de etídeo, 
que é um potente agente mutagênico; 
- Usar óculos e outros equipamentos de proteção ao trabalhar com a luz UV, 
já que a mesma é mutagênica; 
- A agarose fundida pode eventualmente borbulhar, por isso não se deve 
agitar o erlenmeyer logo após a fusão, para evitar queimaduras. 
9. Eletroforese em gel de poliacrilamida 
A eletroforese em gel de poliacrilamida é uma técnica amplamente usada 
para a separação de biomoléculas, tais como os ácidos nucleicos e as proteínas. Os 
géis de poliacrilamida são constituídos pela polimerização da acrilamida e da N,N’ – 
metilenobisacrilamida, que é induzida por radicais livres, e apresentam poros de 
dimensões moleculares, sendo que a separação nessas malhas é baseada tanto 
nos princípios da filtração em gel como na mobilidade eletroforética das moléculas. 
Nesse sentido, nesse tipo de eletroforese, as grandes moléculas têm sua migração 
retardada com relação às moléculas de menor tamanho. 
O sistema de poliacrilamida consiste em dois géis que apresentam 
composição e função diferentes: o gel de empacotamento (concentrador) e o gel de 
corrida (separador). O primeiro é constituído por uma malha de grande porosidade 
(gel de poliacrilamida a 5%), e sua função é compactar a amostra em um pequeno 
volume, depositando-a sobre a superfície-limite do gel separador como uma “banda 
estreita”. Já o segundo é constituído de uma malha de poros menores (poliacrilamida 
 
 
 
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na faixa de 8% a 20%), com a função de separar as proteínas ou DNAs, em razão 
de suas massas moleculares. 
Na maioria dos casos, o tampão nos reservatórios da cuba de eletroforese 
apresenta pH e força iônica diferentes do tampão usado para confeccionar o gel 
(sistema descontínuo). Depois de aplicada, a amostra é arrastada por uma fronteira 
de íons em movimento, que é criada quando a corrente elétrica passa através dos 
eletrodos, do pólo negativo em direção ao pólo positivo. A combinação do sistema 
descontínuo do tampão com a grande porosidade do gel concentrador promove o 
efeito de empacotamento da amostra, o qual é crucial para a alta resolução desse 
sistema de separação. 
Após a separação, as proteínas ou DNAs podem ser visualizadas segundo 
diversas metodologias de coloração, detecção imunológica ou radioativa. Cada um 
desses sistemas de detecção apresenta o requerimento de um protocolo específico 
para sua execução. As duas principais metodologias de coloração utilizam o corante 
azul brilhante de Coomassie ou sais de prata (soluções amoniacais de prata ou 
nitrato de prata). A coloração de prata é cerca de cem a mil vezes, mais sensível que 
a coloração de Coomassie, podendo detectar moléculas em quantidade de 0,1 a 1,0 
ng em uma única banda. 
Assim, pode-se definir um parâmetro padrão envolvendo as seguintes 
etapas:
Montagem da cuba de eletroforese e confecção do gel de poliacrilamida. Ao 
contrário da eletroforese em gel de agarose, que utiliza uma cuba horizontal para 
corrida do gel, a eletroforese em gel de poliacrilamida utiliza uma cuba vertical; 
Verter o gel de corrida, e assim que esse polimerizar, verter sobre ele o gel 
de empacotamento e introduzir imediatamente o pente para formação dos poços; 
i.
 
 
 
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Após a polimerização, remover o pente e limpar os poços; 
Adicionar o tampão aos reservatórios e aplicar as amostras; 
Conectar os eletrodos à fonte de corrente e ligá-la. A corrente sempre irá do 
pólo negativo ao pólo positivo; 
Após o término da corrida, realizar a coloração para visualização do gel. 
10. Cuidados importantes na utilização da técnica 
- Os reagentes acrilamida e bisacrilamida são neurotóxicos, e seus efeitos 
são cumulativos, portanto é obrigatório o uso de luvas e máscara para manipulação 
desses reagentes. 
11. Southern Blot 
A técnica de Southern blot baseia-se na hibridização entre moléculas de 
DNA, fixas em um suporte, com sondas (moléculas de DNA ou RNA) marcadas, 
visando à localização de sequências específicas de DNA. Esse tipo de procedimento 
torna-se possível em razão da estrutura em duplas fitas das moléculas de DNA que, 
quando aquecidas ou submetidas a tratamento com soluções desnaturantes, tendem 
 
 
 
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a separar-se. Essas moléculas desnaturadas, quando submetidas a um 
resfriamento, em condições controladas tendem novamente a renaturar-se. 
O pesquisador Ed Southern propôs a transferência e a imobilização dos 
fragmentos de DNA resultantes da digestão enzimática em um suporte sólido (Figura 
6). Assim, após a digestão e a eletroforese do DNA, as moléculas presentes no gel 
são transferidas para membranas, geralmente de nitrocelulose ou náilon, sendo 
então hibridizado com a sonda de interesse, esse procedimento é chamado de 
Southern Blot (Figura 7). Essa técnica caracteriza-se por ser menos trabalhosa, uma 
vez que todos os fragmentos de DNA podem ser sondados de uma só vez. 
12. Cuidados importantes na utilização da técnica 
Usar luvas ao manipular as membranas, pois estas apresentam grande 
capacidade de adsorção, podendo interferir nos resultados; e também ao manipular 
o gel, pois o mesmo contém brometo de etídeo - agente mutagênico. 
Figura 6. Representação esquemática da montagem do sistema de transferência em um 
suporte sólido. Componentes: suporte, gel de agarose, membrana de nitrocelulose ou nylon, e por 
último papel absorvente. 
 
 
 
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Figura 7. Passo a passo da técnica de southern blot. No primeiro passo, os ácidos nucleicos 
são separados em gel de agarose; em seguida (passo 2) o gel é transferido para membrana de 
nitrocelulose; no terceiro passo, depois de transferidos para membrana, os ácidos nucleicos são 
hibridizados; então, no passo 4, ocorre a revelação; seguida, no último passo (5), da detecção das 
bandas. 
13. Northern Blot 
Essa técnica surgiu alguns anos após o desenvolvimento da técnica de 
Southern Blot e, de forma similar, tem a finalidade de detectar moléculas de RNA 
separadas por eletroforese e imobilizados em um suporte. Essa metodologia permite 
a análise da expressão de genes em diferentes estágios de desenvolvimento, ou de 
diferentes tipos celulares, uma vez que nesse tipo de técnica são imobilizadas 
moléculas de RNA, incluindo o mRNA. Assim, tal técnica apresenta grande 
importância nos estudos envolvendo a expressão gênica. Enquanto no Southern Blot 
a hibrização ocorre com moléculas de fita dupla (DNA), no Northern Blot ocorre com 
polímeros de fita simples (RNA). Dessa forma, é frequente o pareamento 
 
 
 
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intramolecular de bases, promovendo um dobramento da molécula ou pareamento 
de bases presentes em moléculas distintas, levando à formação de regiões de 
híbridos de RNA-RNA. Assim, a migração do RNA em géis de agarose depende do 
seu tamanho e do seu estado conformacional.A realização dessa técnica implica, obrigatoriamente, a utilização de géis de 
agarose adicionados de agentes desnaturantes. Geralmente, emprega-se o 
formaldeído para tal finalidade, uma vez que este reage covalentemente com os 
grupamentos amina de adenina, guanina e citosina, evitando a formação de 
pareamento envolvendo essas bases. Como esse fenômeno pode também ocorrer 
em relação à sonda no momento da hibridação, tal atividade deve ser revertida 
antes da etapa de hibridação com a sonda, pela desnaturação térmica seguida de 
resfriamento.
RNAses são enzimas, presentes nas células, nos tecidos, alguns fluídos 
biológicos, e degradam as moléculas de RNA. A técnica em questão, deve ocorrer 
em condições RNAse free, ou seja, livre de RNAses, até a transferência para as 
membranas, quando então tal precaução não é mais necessária. 
Para obtenção das condições RNAse free é necessário alguns cuidados 
como:
Uso de luvas novas, sem talco; 
Reagentes e materiais plásticos, como ponteiras e tubos tipo Eppendorf, 
devem ser novos; 
A vidraria e os instrumentos metálicos devem ser limpos, envolvidos em 
papel alumínio e submetidos a 180 ºC por dezesseis a dezoito horas; 
Os equipamentos, como cubas de eletroforese e pentes, devem ser tratados 
com 0,1% de dietil pirocarbonato (DEOC), um potente inibidor de RNAse; 
A água deve ser bidestilada ou Milli-Q. 
14. Cuidados importantes na utilização da técnica 
Condições RNAse free durante a preparação e a execução das etapas da 
técnica;
Usar luvas ao manipular as membranas e o gel; 
 
 
 
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Manusear o formaldeído sempre em capela de exaustão, evitando aspirar 
seus vapores, que são tóxicos; 
15. Western Blot 
A técnica western blot, também conhecida como ensaio imunoenzimático, 
refere-se à imunodetecção de proteínas em filtro de nitrocelulose, é rotineiramente 
utilizado para a detecção de proteínas e em extratos proteico cru, varredura e 
caracterização de polipeptídeos recombinantes, detecção de produtos de 
degradação proteica, caracterização de soros e anticorpos monoclonais, 
caracterização de epitopos, determinação de massa molecular, entre outros. 
A técnica consiste na detecção de pequenas quantidades de proteínas 
adsorvidas em uma membrana de nitrocelulose pela reação com anticorpos 
específicos desenvolvidos para reconhecer o polipeptídeo em exame. O anticorpo 
específico é adicionado à membrana e deixado reagir por certo período de tempo, 
após o qual uma fração do anticorpo fica retida na região da membrana que contém 
o polipeptídeo específico. Em um segundo estágio, esse anticorpo adsorvido 
especificamente sobre o polipeptídeo é detectado com um antissoro, ou seja, um 
anticorpo específico (ou segundo anticorpo/ conjugado) que foi quimicamente 
modificado pelo acoplamento covalente de uma ou mais moléculas de uma enzima. 
Esse reagente tem como função detectar o anticorpo específico e permitir a sua 
visualização em razão da atividade enzimática associada. 
Com o auxílio de substratos sintéticos para a enzima conjugada, é possível 
visualizar a região do filtro onde está localizado o polipeptídeo ensaiado. O substrato 
utilizado é capaz de precipitar e formar uma camada colorida exatamente onde está 
localizado o segundo anticorpo e, portanto, o anticorpo específico, e, em última 
instância, o polipeptídeo ao qual se quer detectar. 
16. Cuidados importantes na utilização da técnica 
 
 
 
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Proteínas com alta massa molecular e hidrofobicidade tornam a 
transferência mais lenta; 
Géis fixados não podem ser transferidos, por isso não se deve corar o gel 
antes da transferência; 
Bolhas entre o gel e membrana causam problemas na transferência; 
Manipular as membranas sempre com luva e pinça, já que as impressões 
digitais podem interferir na adsorção de proteínas; 
17. Sequenciamento de DNA 
O sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos 
nucleotídeos em uma amostra. Existem vários métodos disponíveis, e cada um 
apresenta vantagens e desvantagens. Um dos mais utilizados é o chamado método 
de Sanger também conhecido como de terminação de cadeia com 
didesoxirribonucleosídeo trifosfato, ele constitui a base da metodologia empregada 
no sequenciamento do genoma humano. Sua estratégia consiste em identificar, 
continuamente e sequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo 
incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação 
deverão também portar uma “marca” que permita detectá-los na etapa de análise. O 
processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla) do DNA a ser 
sequenciado, esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da 
dupla hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula nativa” (Figura 8). 
Figura 8. Representação desnaturação da molécula de fita dupla (DNA) e do fragmento a 
ser sequenciado (5’ 3’). 
 
 
 
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A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, 
na presença da enzima DNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a 
forma de dNTPs (3’-desoxinucleotídeos trifosfatos): dATP, dCTP, dGTP e dTTP 
sendo um deles marcado radioativamente com ³²P ou 35S; um dos mais utilizados é 
o dATP ³²P (Figura 9.2a). Como a enzima utilizada catalisa somente o alongamento 
da cadeia nascente é necessário também, a presença na reação, de um pequeno 
fragmento de DNA sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na 
extremidade 3’ do DNA molde; estas características permitirão sua hibridização no 
local mencionado, e fornecerão um ponto de partida para a replicação do DNA. O 
fragmento XXX, denominado iniciador ou primer, quando marcado, poderá ser 
utilizado para rastrear o fragmento de DNA recém-sintetizado no lugar do dNTP. O 
processo é executado em quatro reações separadas; cada uma delas, contendo 
adicionalmente pequena quantidade de um, e apenas de um, dos quatro tipos de 
cada dNTP sob a forma análoga de ddNTPs (2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos) 
(Figura 9.2b). 
Figura 9.2. Representação química dos 3’-desoxinucleotídeos trifosfatos – dNTPs (2a), e 
dos 2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos – ddNTPs (2b). 
 
 
 
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As formas análogas (ddNTPs) são conhecidas como terminadores, e ao 
serem incorporados à cadeia nascente bloqueiam todo processo, por não 
apresentarem 3’OH que permita formar ligação com o próximo dNTP a ser 
adicionado. Com todos os nucleotídeos normais (dNTPs) presentes, o alongamento 
da cadeia prosseguirá até que a enzima DNA-polimerase insira um análogo 
(ddNTP). Consequentemente e imediatamente, a reação de síntese irá parar no 
ponto em que seu alongamento foi interrompido: na extremidade e, a molécula 
estará marcada com ³²P. Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um 
resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi 
adicionado, são separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente, 
ou seja, um canal de análise para cada reação. Então, o gel é transferido para um 
suporte de nitrocelulose (filtro). 
Após autorradiografia a ordem dos nucleotídeos, na cadeia de DNA recém-
sintetizada, pode ser visualizada e obtida diretamente; esta é complementar à da 
molécula sequenciada que serviu de molde. Portanto, é possível conhecer a 
sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’ para 5’ partindo-se da parte 
inferior para a superiordo gel (Figura 10). 
 
 
 
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Figura 10. Representação da sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’ para 5’. 
O método pode ser automatizado utilizando o sequenciador automático, 
gerenciado por computadores com programas que leem sequencialmente e 
identificam os produtos. A automatização permite executar o processo em grande 
escala, já que, é possível utilizar os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) 
simultaneamente, por meio da marcação por fluorescência (figura 11.4a). Em cada 
reação, ou seja, para cada base (A,T,G,C) utiliza-se um fluorocromo diferente (uma 
cor diferente), de modo que os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes 
realizada em um único canal do gel de sequenciamento (figura 11.4b). O sinal 
fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, após iluminação com um feixe 
de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda. A 
luz emitida é detectada por escaneamento do gel e a sequência deduzida por 
computador (figura 11.4c). Variáveis mais modernas, mais rápidas e poderosas; 
incluem a robotização total do processo com a inclusão das etapas de purificação e 
da reação de síntese da cadeia do DNA. 
 
 
 
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Figura 11.4. Representação do sequenciamento automatizado. Na figura 4a é possível 
observar os dNTPs marcados por fluorescência; em seguida, em 4b, eletroforese realizada em um 
único canal do gel de sequenciamento; e por fim, em 4c, a luz emitida é detectada por escaneamento 
do gel e a sequência deduzida por computador (eletroforegrama). 
Existe outro método de sequenciamento de DNA que teve uma ampla 
aplicação inicialmente, porém é pouco utilizado atualmente. Este é conhecido como 
o método da degradação química, desenvolvido em 1977, por Maxam e Gilbert. 
Essa técnica consiste no tratamento com substâncias químicas que cortam a 
molécula de DNA em nucleotídeos específicos. 
Os tratamentos químicos para modificação das bases e clivagem são feitos 
de maneira que ocorram em G, C, G+A e T+C. Esses fragmentos gerados são 
analisados em gel de poliacrilamida. 
18. Projeto Genoma Humano 
As primeiras discussões sobre o Projeto Genoma Humano (PGH) remontam 
à década de 1980 quando o Departamento de Energia dos EUA promoveu um 
workshop para avaliar os métodos disponíveis para detecção de mutações durante o 
qual divulgou a ideia de mapear o genoma humano. Na mesma época foi criado na 
França o Centre d’Etude du Polymorsphisme Humaine (CEPH - Centro de Estudos 
 
 
 
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do Polimorfismo Humano). Este centro coleta amostras de sangue e tecidos de 
famílias extensas e tornou-se o principal fornecedor de material para a elaboração 
dos mapas de ligação realizados pelo Genéthon. 
O mapeamento do genoma humano sempre causou expectativas. Alguns 
cientistas acreditavam ser impossível, enquanto outros achavam que seria um 
projeto muito trabalhoso e em vão, já que as informações obtidas seriam 
desencontradas; e os cientistas que reconheciam o projeto como a grande “sacada” 
da biologia, transformando a biologia numa grande ciência (big science), com direito 
a financiamentos gigantescos e divulgação ampla. 
O Projeto Genoma Humano é um empreendimento internacional, iniciado 
formalmente em 1990 e projetado para durar 15 anos, com os objetivos de identificar 
e fazer o mapeamento do DNA do corpo humano, determinar as sequências dos três 
bilhões de bases químicas que compõem o DNA humano, e armazenar essa 
informação em bancos de dados, desenvolverem ferramentas eficientes para 
analisar esses dados e torná-los acessíveis para novas pesquisas biológicas. 
O PGH começou como uma iniciativa do setor público, tendo a liderança do 
cientista Francis Collins, e posteriormente, a busca para decifrar o código genético 
humano, também passou a ser desenvolvido pela companhia privada Celera, 
liderada pelo cientista Craig Venter. 
O PGH é sem dúvida o mais audacioso projeto da biologia, com a pretensão 
de ter toda a sequência de genes da espécie humana, descobrir sua localização e 
determinar as suas funções. O anúncio do rascunho de 98% do genoma humano 
ocorreu no dia 26/07/2000, com a participação do presidente americano Bill Clinton e 
do 1° ministro britânico Tony Blair. O anúncio também mostrou que a aparente 
corrida não declarada entre os setores estatal e privado, envolvidos com o projeto 
terminou em empate, visto que o anúncio foi conjunto. Os resultados foram 
publicados em duas revistas diferentes. A revista inglesa Nature publicou o trabalho 
dos pesquisadores do PGH, liderados por Francis Collins, e a norte-americana 
Science, o dos pesquisadores da Celera, liderados pelo empresário-cientista Craig 
Venter (Figura 12). 
 
 
 
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Figura 12. Capa das revistas nature e science. Foram nessas edições, que as revistas 
publicaram o anúncio dos cientistas sobre o rascunho de 98% do sequenciamento do genoma 
humano. 
Francis Collins, diretor do projeto genoma estatal, apertou a mão de seu ex-
colega e presidente da companhia privada Celera, Craig Venter ao lado do 
presidente Bill Clinton. A trégua não significa uma conciliação de pontos de vista 
bem divergentes. Collins, apoiado por Clinton e Blair, quer que as informações nele 
contidas sejam de domínio público. No entanto, Venter quer o direito de patentear 
sequências desse código. Ele pretende lucrar com a venda de informações 
determinantes para empresas farmacêuticas. 
Basicamente, 18 países iniciaram programas de pesquisas sobre o genoma 
humano. Os maiores programas desenvolvem-se na Alemanha, Austrália, Brasil, 
Canadá, China, Coreia, Dinamarca, Estados Unidos, França, Holanda, Israel, Itália, 
Japão, México, Reino Unido, Rússia, Suécia e União Europeia. Alguns países em 
desenvolvimento, não incluídos na relação, participam por intermédio de estudos de 
técnicas de biologia molecular de aplicação à pesquisa genética e estudos de 
organismos que têm interesse particular para suas regiões geográficas. Informações 
sobre estes países e suas pesquisas de contribuição para o PGH podem ser obtidas 
por meio da HUGO (Human Genome Organization).
 
 
 
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O Projeto Genoma poderá trazer muitos benefícios para a humanidade 
como:
O conhecimento sobre como os genes contribuem para a formação de 
doenças que envolvem um fator genético- como o câncer, por exemplo, levarão a 
uma mudança da prática médica; 
Será dada ênfase à prevenção da doença, em vez do tratamento do doente; 
Novas tecnologias clínicas deverão surgir baseadas em diagnósticos de 
DNA; 
Novas terapias baseadas em novas classes de remédios; 
Novas técnicas imunoterápicas; 
Prevenção em maior grau de doenças pelo conhecimento das condições 
ambientais que podem desencadeá-las; 
Possível substituição de genes defeituosos por meio da terapia genética; 
Produção de drogas medicinais por organismos geneticamente alterados e; 
Grande impacto nas indústrias relacionadas à biotecnologia, como na área 
da agricultura, produção de energia, controle do lixo, despoluição ambiental e outras. 
----------- FIM DO MÓDULO IV ----------- 
 
 
 
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
ALBERTS, B.; et al. Molecular Biology of The Cell, 4. ed. 2002. 
AZEVEDO, M.O.; et al. Técnicas básicas em Biologia Molecular. Brasília: UnB, 
2003.
HAUSMANN, R. História da biologia molecular. Ribeirão Preto: Sociedade 
Brasileira de Genética, 2002. 
LEWIN, Genes VII. Oxford University Press, Inc., New York, 2000. 
MAYR, E. O desenvolvimento do pensamento biológico: diversidade, evolução e 
herança. Tradução de Ivo Martinazzo. Brasília: UnB, 1998. 
MENEGHINI, R. Os gênios e o gene. São Paulo, 2003. 
NOUVEL, P. A arte de amar a ciência. São Leopoldo: Editora Unisinos, 2001. 
OLBY, R. The path to the Double Helix: the discovery of DNA. New York: Dover 
Publications, 1994. 
SCHEID, N.M.J; FERRARI, N.; DELIZOICOV, D. The collective scientific 
knowledge production on the DNA structure. Ciência & Educação, v. 11, n. 2, p. 
223-233, 2005. 
SCHRÖDINGER, E. O que é vida? O aspecto físico da célula viva seguido de 
mente e matéria e fragmentos autobiográficos. Tradução de Jesus de Paula Assis e
Vera Yukie Kuwajima de Paula Assis. 4. ed. São Paulo: Unesp, 1997. 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
WEAVER, W. Molecular biology: origins of the term. Science, Washington, v. 170, 
p. 581-582, 1970. 
ZAHA, A.; et al. Biologia Molecular Básica. Porto Alegre: Mercado Aberto, 2003. 
--------------- FIM DO CURSO! ---------------