1,3-propanodiol

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PRODUÇÃO DE 1,3-PROPANODIOL A PARTIR DE FERMENTAÇÃO POR Lactobacillus diolivorans DSM 14421 
Aluno: Alexandre Valiatti do Prado
INTRODUÇÃO
- Produção biológica de metabólitos microbianos e produtos de alto valor agregado = 
- Este aumento na produção de compostos biotecnológicos deve-se ao fato da necessidade de se obter produtos e serviços a partir de fontes renováveis de energia devido ao aumento da demanda energética mundial; 
- Dentre os inúmeros produtos de alto valor agregado, a produção de biocombustíveis, particularmente biodiesel, atrai uma grande atenção;
- O biodiesel, produzido por transesterificação de gorduras e óleos vegetais, provenientes de milho, amendoim, soja, babaçu e outras plantas oleaginosas, têm sido considerado como uma fonte renovável, biodegradável e um combustível não tóxico, e pode ser uma potencial fonte para aliviar a crise energética e a pressão ambiental;
- Subproduto residual predominante da usina de biodiesel: glicerol, impuro;
- O glicerol impuro, por não ser usado preferencialmente como matéria-prima pela maioria das indústrias, torna-se um potencial poluente ambiental;
 
- Aplicação importante desse glicerol: bioconversão em produtos de alto valor agregado, p. ex.: ácido propiônico, ácido succínico, ácido cítrico, butanol, hidrogênio, bem como em 1,3 propanodiol;
- O 1,3-propanodiol é uma molécula versátil que pode ser utilizada na produção de tintas, cosméticos, medicamentos, lubrificantes e polímeros;
- Ele foi um dos primeiros produtos descobertos em fermentação, tendo sido descoberto em 1881 pelo químico Austríaco August Freund, em uma cultura mista de fermentação contendo Clostridium pasteurianum;
- Mais usado como monômero para produção de politrimetileno tereftalato (PTT);
- Os polímeros que podem ser sintetizados a partir de 1,3-PPD oferecem a esse mercado uma oportunidade significativa para o desenvolvimento de novos produtos, de custo competitivo, através de processos biotecnológicos, 
que evita a utilização de mais petróleo, além de proporcionar substancial economia de energia e recursos significativos para a indústria de bioprodutos;
- O 1,3-PPD tem um grande número de outras aplicações como: serem formulados em laminados, solventes, molduras, adesivos, resinas, detergentes, cosméticos, plásticos biodegradáveis, desodorizantes e etc...;
- Com isso, o mercado de 1,3-PD está crescendo e sua produção por via biológica também (G. KAUR et al., 2012);
- Várias espécies de Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Klebsiella and Lactobacillus são capazes de produzir 1,3 PD a partir da fermentação do glicerol;
- A bactéria Lactobacillus diolivorans é considerada bastante promissora para produção industrial de 1,3 PD
Não é patogênica;
Apresenta elevado rendimento na produção em batelada alimentada (85,4 g/l), comparável os melhores resultados encontrados na literatura: Clostridium butyricum 93,7 g/l e Klebsiella pneumoniae 71.6 g/l;
Produz poucos subprodutos, facilitando a recuperação do 1,3-PD. 
- Todos esses fatores demonstram o aspecto da sustentabilidade e economicidade nos processos biotecnológicos em que podemos visualizar: reutilização e transformação de um subproduto da produção de biodiesel, formação de um agente polimerizante (1,3-PPD) com várias aplicações industriais, baixa utilização de energia e geração de resíduos e biotransformação através de Lactobacillus diolivorans gerando poucos subprodutos. 
OBJETIVOS
 - Objetivo geral
Otimizar a produção de 1,3 - propanodiol por fermentação em biorreator do tipo agitação mecânica (STR) com diferentes substratos realizada por Lactobacillus diolivorans. 
- Objetivos específicos
Realizar a ativação do inóculo;
Estudar a cinética de produção do 1,3-propanodiol em biorreator tipo tanque perfeitamente agitado com o microrganismo em suspensão;
Determinar a cinética de crescimento do microrganismo;
Determinar a biomassa das células do microrganismo;
Analisar por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) as concentrações de glicose, glicerol, 1,3- propanodiol, etanol, ácido acético e ácido láctico;
Estimar a taxa de produtividade da fermentação.
 METODOLOGIA
Processo Fermentativo de Produção
3.1 MICRORGANISMO 
Será utilizada a bactéria Lactobacillus diolivorans proveniente da coleção de culturas Leibniz- Institut (DSMZ- GmBH) (Braunschweig- Alemanha) e catalogada sob o código DSM 14421. O isolado liofilizado será ativado em meio de cultura Mann, Rogosa & Sharpe (MRS) seguindo as orientações da coleção de origem. A preservação será realizada em freezer – 80 °C utilizando como crioprotetor glicerol 30 % no caldo fermentado.
 3.2 Meio de cultivo para produção 
Serão utilizados diferentes fontes de substrato para co-fermentação do L. diolivorans: glicerol, glicose e milhocina. Dessa forma o intuito é avaliar a influência destes substratos na rota metabólica, crescimento do microrganismo, rendimento de produção de 1,3-PPD e metabólitos secundários.
 3.3 Cultivo em Biorreator 
3.3.1 Preparo do pré-inóculo 
A reativação do microrganismo será realizada pela transferência de 1 ml do meio contendo o microrganismo (eppendorf a -80°C) para um tubo ensaio de 12 ml incubado por 12 horas contendo o meio de produção. Após o período de inoculação o conteúdo do tubo de ensaio é transferido para um erlenmeyer contendo 48 mL de meio de produção previamente esterilizado a 121 °C. O erlenmeyer é mantido em estufa a 30 °C incubado por 12 horas. Todos os procedimentos serão realizados em câmara de anaerobiose, para promover a anaerobiose do meio (PLUFGL et al., 2012). 
 3.3.2 Preparo do inóculo 
O inóculo será preparado com a transferência do pré-inóculo (60 ml) para o meio de produção com volume de 540 ml com os microrganismos na fase de crescimento exponencial. 
O crescimento é mantido em modo estático a 30 ºC por 12 horas antes de ser transferido para o biorreator (PLUFGL et al., 2012).
3.3.3 Cultivo em biorreator batelada simples com células em suspensão 
Serão realizadas duas fermentações em batelada simples com células suspensas, com duração de 20 e 18 horas respectivamente. As fermentações serão conduzidas em biorreator do tipo STR da marca SOLAB (Tecnal - Brasil), com capacidade total de 5L, utilizando 2400 mL de meio de produção e 600 mL de inóculo em fase de crescimento exponencial. Para conduzir o experimento em condições de anaerobiose e direcionar a via redutiva, utilizar-se-á nitrogênio comercial a uma vazão de 2 vvm (6l/min) durante o experimento para eliminar o O2 dissolvido, medido por um sensor acoplado ao biorreator. 
A velocidade de agitação é de 100 rpm, o pH mantido em 5,7 através de um sistema de controle que adiciona NaOH 5 M, medido por um sensor acoplado ao biorreator, e utilizado temperatura de 30 °C . Serão retiradas amostras de aproximadamente 10 mL, em intervalos de 2 horas (PLUFGL et al., 2012), para a determinação da concentração de curva de crescimento, biomassa, glicerol, glicose, etanol, ácido láctico, ácido acético e 1,3- propanodiol. Quando necessário utilizar-se-á uma solução de antiespumante polipropilenoglicol P-2000 (Sigma-Aldrich, EUA). O biorreator e acessórios como filtros e mangueiras serão autoclavados em 121°C por 15 minutos. 
3.4 Metodologia Analítica das Fermentações 
3.4.1 Determinação de 1,3-PPD, ácido láctico, ácido acético, etanol, glicose e glicerol 
Alíquotas retiradas do biorreator serão analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), em um equipamento Agilent série 1200 (Hewllet Packard), (Figura 23). As amostras serão filtradas em membrana 0,2 μm. Utilizar-se-á coluna Aminex HPX-87H, como fase móvel e utilizar-sá H2SO4 5 mM, e as condições de análise serão: vazão de 0,6 mL /min; 20 μL da amostra injetada, temperatura da coluna de 35 °C. Para quantificar o ácido láctico utilizar-se-á o detector de arranjo de diodos (DAD) e comprimento de onda 210 nm. Para quantificar 1,3-PPD, glicose, ácido acético, glicerol e etanolserá utilizado o detector de índice de refração (IR) (PUFLGL et.al, 2012). Obtenção de curvas de calibração.
3.4.2 Determinação de biomassa 
Para determinação da biomassa, a densidade ótica (D.O.), obtida em espectrofotômetro (Halo DB 20 – Dynamica) a 600 nm, será correlacionada com peso seco através da construção de uma curva de calibração (Apêndice A). O peso seco será determinado após filtração à vácuo das amostras em membrana de celulose MILLIPORE 0,45 µm e secagem em estufa a 90 ºC por 24 horas. A curva de calibração será construída através da transferência de 1ml do meio de conservação contendo o microrganismo (eppendorfs) armazenado em freezer -80°C, para um Erlenmayer de 60 ml de meio de crescimento previamente esterilizado por autoclavagem , a 121°C por 15 minutos. Após o crescimento, será transferido para um frasco contendo 540 ml do meio de crescimento e uma curva de calibração será estabelecida para correlacionar o peso seco (g/L) de células suspensas com a absorbância. 
3.4.3 Cinética de crescimento 
Serão retiradas alíquotas durante todo o processo fermentativo, em intervalos de 2h (PUFLGL et.al, 2012). A cinética de crescimento do microrganismo será acompanhada durante toda a produção e lida em espectrofotômetro (Dynamica), em comprimento de onda de 600 nm.
3.4.4 Taxa de Produtividade 
Serão calculadas as taxas de produtividade das fermentações, através da seguinte fórmula: TxP(g/L.h)= (Px-P0)/t, onde TxP= taxa de produtividade, Px= rendimento final, P0= rendimento inicial, t=tempo de cultivo a cada amostragem.