Eletroforese e Teste de Falcização

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Teste de Falcização
Eletroforese de Hb
1. Pipetar uma gota de sangue total (EDTA) sobre uma lâmina.
2. Pipetar 2 gotas de metabissulfito a 2% sobre a gota de sangue.
3. Homogenizar a solução.
4. Cobrir com lamínula, retirar o excesso com papel absorvente.
5. Vedar com esmalte toda a extremidade da lamínula para que não entre oxigênio.
6. Colocar a lâmina em placa de petri úmida.
7. Após 1 hora ler no microscópio, na objetiva de 40X.
Caso o resultado seja negativo, repetir a leitura após 3, 6, 12 e 24 horas.
Se o resultado permanecer negativo, liberá-lo apenas após as 24 horas.
Interpretação
Positiva – hemácias falcizadas
Negativa – hemácias sem falcização
Técnica do Teste de Falcização
Teste de Falcização
Teste de Falcização
Teste de Falcização
Detecção qualitativa das hemoglobinopatias por eletroforese em
acetato de celulose em pH alcalino (pH 8,6)
Cuba de eletroforese
Fase estacionária – membrana de celulose.
Obtenção da solução de hemoglobina – amostras submetidas a hemólise (sangue total
com saponina a 1%).
1.Em um suporte colocar 100 uL de saponina e 100 uL de sangue total;
2.Homogenizar;
3.Mergulhar o aplicador na solução e aplicar sobre a fita de acetato de celulose (polo
negativo), a qual estará mergulhada na solução Tris-EDTA-Borato (TEB) - pH 8,6;
4.Deixar correr por 40 minutos a 200 volts;
5.Corar com Pounceau ou negro amido.
Técnica de Eletroforese de Hb
Dica - antes de iniciar o procedimento de corrida:
1. Embeber as fitas de acetato de celulose por 15 minutos em tampão TEB. 
2. Secar as fitas entre duas folhas de papel absorvente e colocá-las na cuba de 
eletroforese.
Técnica de Eletroforese de Hb
Técnica de Eletroforese de Hb
Técnica de Eletroforese de Hb
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Técnica de Eletroforese de Hb
As frações de Hb serão analisadas durante os cinco primeiros minutos
para observar a presença ou não da Hb H.
As demais frações podem ser observadas ao término do procedimento,
primeiramente, sem coloração e, posteriormente podem ser coradas
com Ponceau.
Técnica de Eletroforese de Hb
Eletroforese para quantificação de Hb A2 em pH alcalino (pH 8,6)
1. Aplicar 20 μL de hemolisado na extremidade da fita de acetato de celulose (polo 
negativo);
2. A corrida de Hb será submetida a 300 Volts, por 1 hora. 
3. Após o fracionamento, as hemoglobinas A e A2 devem ser separadas e eluídas 
em tubos contendo água destilada, na quantidade de 3 mL para a Hb A2 e 15 mL 
para a Hb A. 
4. Após 2 horas de eluição, em temperatura ambiente, as absorbâncias das 
amostras serão obtidas no espectrofotômetro em comprimento de onda de 410 nm.
5. A porcentagem de Hb A2 deve ser calculada pela fórmula:
Técnica de Eletroforese de Hb
% Hb A2 = DO A2 X 100 / DO A X 3 + DO A2
Ou
DO A2 X 100 / DO A2 + (DO A x 5)
VR: Hb A2 – 2,5 a 3,5%
Eletroforese para diferenciação de Hb em ágar fosfato (pH 6,2)
Hb migram em posições semelhantes: C, E correm na mesma posição do que a HbA2
Técnica de Eletroforese de Hb
Técnica de Eletroforese de Hb - HPLC
Técnica de Eletroforese de Hb - HPLC