Guia Prático de CRISPR para Edição de Genes

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CRISPR na prática
Um guia para o passo a passo
Movimento Biotecnologia Brasil
Introdução
2 
Nos últimos anos, a tecnologia CRISPR revolucionou a engenharia genética. Composto apenas por um 
RNA guia (gRNA) e uma nuclease Cas, o CRISPR trabalha visando e cortando uma sequência de 
interesse e, em seguida, aproveitando o reparo celular para fazer alterações no genoma. Essa ferramenta 
relativamente simples tornou a edição de genes mais acessível aos pesquisadores do que nunca e está 
sendo cada vez mais utilizada em uma variedade de campos, incluindo medicina, agricultura, produção de 
alimentos e combustíveis alternativos.
Neste eBook, oferecemos diretrizes para a realização de um experimento CRISPR bem-sucedido, 
incluindo considerações sobre design, edição e análise experimental. A maioria das diretrizes é aplicável a 
experimentos de nocaute (em qual um gene de interesse está desativado), embora algumas dicas sobre 
imitações (isto é, inserção ou alteração de nucleotídeos) também estejam incluídas. À medida que você 
inicia sua experiência, lembre-se de que pode ser necessário algum nível de otimização de sua parte.
Neste eBook, supõe-se que o pesquisador possua um conhecimento prático de biologia molecular e 
técnicas de cultura de células necessárias para seu tipo e aplicação de células específicos. Se você ainda 
está se familiarizando com o que é o CRISPR, como ele funciona e para que pode ser usado, consulte o 
nosso e-book CRISPR: Um guia sobre CRISPR para iniciantes.
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ICE analysis 
NGS
Cleavage Assay 
Western/ELISA 
FACS
Fluxo de trabalho experimental e pontos a considerar
Figura 1. Experimento CRISPR dividido em três etapas principais: Design, 
Edição e Análise.
Um experimento CRISPR é composto por três etapas básicas: Design, Editar, e Analisar (Fig 1).
Design
Primeiro, projete e escolha os reagentes para o seu experimento. 
Essa fase requer a otimização das condições de transfecção para 
o seu tipo de célula.
• Crie gRNAs e escolha um formato
• Escolha uma nuclease Cas
• Escolha o método de transfecção e otimize para o tipo de célula
Editar
Usando as condições de transfecção otimizadas na fase de 
design, entregue os componentes CRISPR às células.
• Introduzir gRNAs específicos de alvo e nuclease Cas nas células
Analisar
Na etapa final, analise os resultados da edição de genes 
mediada por CRISPR.
• Analisar a eficiência da edição
• Realizar análises de proteínas / ensaios funcionais
ComponentesSequencia Método de Entrega
Cas9
+
+
-
-
Editar gene alvo 
em células de 
interesse
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Projetando sua experiência com CRISPR
Ferramenta de design CRISPR da Synthego
A ferramenta de design gratuita CRISPR da Synthego é uma das ferramentas de 
design mais rápidas e eficientes disponíveis para os pesquisadores. Ele inclui uma 
biblioteca de mais de 120.000 genomas e 9.000 espécies e oferece uma maneira 
conveniente de solicitar seus guias na ferramenta. Você também pode usar a 
ferramenta para validar gRNAs projetado usando outras plataformas.
Guia de criação de RNAs
O gRNA é o componente programável do sistema CRISPR-Cas9 que 
direciona o Cas9 para o local de destino. A primeira etapa de um 
experimento CRISPR envolve a criação de gRNAs para o seu alvo. Como é 
difícil prever o desempenho de um gRNA, recomendamos testar 3-4 guias 
diferentes para descobrir quais sequências oferecem as melhores eficiências 
de edição.
Embora seja importante maximizar a eficiência no alvo, também é 
importante limitar a ligação não intencional a outros locais no genoma (fora 
do alvo). Existem várias ferramentas online (por exemplo, CHOPCHOP) e 
protocolos (por exemplo, GUIDE-seq) disponíveis que prevêem sites 
potencialmente fora do alvo de gRNAs.
Existem parâmetros adicionais para o design do gRNA, com base no 
objetivo de obter um nocaute ou um knock-in. Nocautes dependem de 
células que formam turnos de quadros no DNA durante o reparo por junção 
não homóloga (NHEJ). O quadro de leitura defeituoso interrompe a 
transcrição de genes e a codificação de proteínas a jusante. Esses 
experimentos oferecem alguma flexibilidade na sequência de gRNA e 
localização do alvo. No entanto, os seguintes critérios devem ser atendidos 
ao projetar gRNAs para experimentos de knockout:
• Escolha seqüências de guias que segmentam exons presentes 
em todas as variantes de transcrição.
• Escolha sequências na extremidade 5 'do gene ou que 
codifiquem os domínios proteicos essenciais, pois é mais 
provável que eles interfiram na função da proteína.
A criação de um experimento CRISPR requer várias etapas. Abaixo, explicamos os fatores a serem levados em consideração ao 
projetar os gRNAs, escolher um formato de gRNA, selecionar uma nuclease de Cas e escolher um método de entrega.
Em experimentos knock-in, um pedaço de DNA contendo a sequência 
desejada flanqueada por braços de homologia é co-transfectado com o 
gRNA e a nuclease Cas. Esse DNA do doador é usado como modelo 
quando a célula corrige a quebra de fita dupla. Nessas experiências, os 
requisitos de projeto para os gRNAs são diferentes. Por exemplo, o 
gRNA deve ser projetado de modo que a distância entre o local de 
inserção e o local de corte seja inferior a 10 pb.
Para outras aplicações, como CRISPRa / CRISPRi, o design do gRNA 
também é diferente. Por exemplo, a sequência deve ser complementar 
ao promotor que regula o gene alvo, em vez da sequência do próprio 
gene.
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Escolhendo um formato de RNA guia
5 
Um experimento de edição do genoma do CRISPR pode ser orquestrado 
de várias maneiras diferentes. O mecanismo essencial de CRISPR (gRNA e 
proteína Cas) pode ser entregue em um de três formatos: DNA plasmídico, 
RNA transcrito in vitro ou complexo de ribonucleoproteína (RNP) (Fig 2).
DNA
Uma abordagem comum é entregar componentes CRISPR nas células 
como DNA plasmídico. Isso requer que um pesquisador clone a proteína 
Cas (geralmente Cas9) e o gRNA desejado que codifica fragmentos de 
DNA em um plasmídeo e depois o introduza nas células-alvo.
A engenharia de um plasmídeo CRISPR segue o mesmo protocolo que um 
ensaio de clonagem típico. Primeiro, um modelo de DNA que codifica a 
proteína gRNA e Cas9 é projetado e ordenado. O molde de DNA deve 
então ser amplificado, digerido e ligado ao plasmídeo. Após o rastreio do 
plasmídeo recombinante e a verificação da sua sequência, o plasmídeo 
pode ser entregue às células alvo. Como os componentes CRISPR estão 
no formato de DNA, o gRNA deve ser transcrito e o Cas9, transcrito e 
traduzido antes que a edição possa ocorrer.
O processo de preparação interna de um plasmídeo CRISPR personalizado 
leva de 1 a 2 semanas para que o ensaio de edição real possa começar. 
Além disso, a abordagem plasmidial também é propensa a efeitos fora do 
alvo devido à presença celular contínua de Cas9. Os plasmídeos também 
correm o risco de se integrar ao genoma do hospedeiro em locais que 
causam citotoxicidade. Isso é particularmente problemático em aplicações 
relacionadas à medicina humana e engenharia de culturas.
RNA
Os componentes CRISPR podem ser entregues nas células em um formato 
de RNA. O componente de gRNA pode ser produzido de duas maneiras: 1) 
enzimaticamente através da transcrição in vitro (IVT) ou 2) através de um 
processo sintético.
Esses dois métodos são descritos abaixo.
1) Transcrição in vitro (IVT)
A transcrição in vitro é um processo pelo qual o RNA é transcrito 
enzimaticamente sem o uso de células. O primeiro passo é o mesmo da 
clonagem de plasmídeos: projete o modelo de DNA com base na 
sequência alvo dentrodo gene de interesse. Nesse caso, o modelo deve 
incluir adicionalmente um local promotor a montante (tipicamente T7) para 
que a RNA polimerase use durante a transcrição.
Uma vez obtido o modelo de DNA, ele é transcrito para um gRNA usando 
um dos muitos kits de IVT disponíveis no mercado (contendo enzimas e 
reagentes). O processo de IVT requer 1-3 dias para preparar o gRNA para 
um ensaio CRISPR. Após a purificação, o RNAt pode ser co-transfectado 
para a célula ao lado do RNAm de Cas9. Alternativamente, também pode 
ser complexado com a proteína Cas9 e entregue à célula alvo como 
ribonucleoproteínas (RNPs).
A abordagem de IVT é trabalhosa e não é escalável para vários alvos 
CRISPR. Além disso, os gRNAs derivados da IVT são propensos a erros 
cometidos pelas enzimas durante a síntese. Por exemplo, a RNA 
polimerase pode inserir o nucleotídeo errado ou fazer uma sequência guia 
muito longa ou curta. este
pode não apenas levar a eficiências de edição altamente variáveis, mas 
também aumentar a possibilidade de efeitos fora do alvo. Por fim, as guias 
produzidas por IVT arriscam a contaminação pelo DNA.
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2) RNA guia sintético
Outra opção para gerar gRNAs é através da produção sintética. O 
processo sintético cria RNA oligos quimicamente, sem DNA ou enzimas. 
Os guias podem ser produzidos como fragmentos separados de crRNA e 
racrRNA que são posteriormente recozidos juntos ou como um RNA 
único guia contínuo (sgRNA). Dessas duas formas, o sgRNA geralmente 
produz uma eficiência de edição mais alta, evitando o recozimento 
ineficiente do sistema de duas peças e a tendência dos fragmentos de 
tracrRNA para formar tetrâmeros que interferem na proteína Cas9.
Até muito recentemente, o alto custo associado à produção de sgRNA 
sintético era proibitivo para muitos laboratórios. No entanto, 
desenvolvimentos recentes em tecnologia permitem acesso acessível e 
implantação bem-sucedida da tecnologia CRISPR. Por exemplo, o 
método de produção automatizado da Synthego, que permite que os 
sgRNAs sejam gerados muito mais rapidamente e a um custo muito 
menor do que os métodos de síntese tradicionais. A técnica de síntese de 
alto rendimento também resulta em sgRNAs de alta fidelidade, permitindo 
um direcionamento mais eficiente e reprodutível do local genômico 
desejado.
O processo sintético permite a produção de sgRNAs quimicamente 
modificados. As modificações químicas protegem os sgRNAs da 
degradação por exonucleases, resultando em maior eficiência de edição. 
Eles também impedem o desencadeamento de respostas imunes inatas 
que podem resultar em morte celular. Os sgRNAs sintéticos podem ser 
co-transfectados com o mRNA de Cas9 ou podem ser introduzidos com a 
proteína Cas9 como complexos de ribonucleoproteínas, conforme descrito 
na próxima seção.
Ribonucleoproteína (RNP)
Antes de qualquer edição do CRISPR, um gRNA deve complexar com 
Cas9, formando uma ribonucleoproteína (RNP). Quando Cas9 é introduzido 
como DNA ou RNA, os RNPs são construídos dentro da célula. No entanto, 
pode-se alternativamente pré-complexar o gRNA e a proteína Cas9 antes 
da transfecção, de modo que as RNPs totalmente formadas sejam 
transfectadas. A introdução de componentes CRISPR dessa maneira tem 
várias vantagens sobre outros formatos. Por exemplo, os RNPs editam 
seus alvos rapidamente (durante horas) e se desassociam após alguns 
dias. Por estarem presentes apenas nas células de maneira transitória, os 
RNPs têm menos efeitos fora do alvo que os formatos de plasmídeo ou 
vírus (1,2). Além disso, como o DNA não é inserido no genoma, existe um 
baixo risco de citotoxicidade. Pensa-se também que a proteína Cas protege 
o gRNA da degradação dentro da célula, aumentando a eficiência da 
edição como resultado (3).
 SgRNA quimicamente 
modificado
SgRNA transcrito in 
vitro (IVT) DNA do plasmídeo
Tipos de 
células 
compatíveis
Células-tronco 
Células primárias 
Linhas celulares
Cell lines Cell lines
Etapas da 
preparação
3 5 5
Tempo de 
preparação
Baixa Média Alta
# Clones 
para 
classificar
Poucas Muitas Muitas
Eficiência 
da edição
Consistentemente 
alto
Váriavel Váriavel
Tabela 1. Comparação da eficiência de preparação e edição de 
diferentes formatos de RNA guia.
SgRNAs quimicamente modificados: RNAs de guia único com modificações 
químicas que os protegem da degradação e impedem o desencadeamento de 
respostas imunes inatas.
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5'
3'
NCC 3'
5'
Cas9
c. Ribonucleoproteina 
(RNP)
RN
P
form
ation
N c
e a
loc
u
ali
l
zat
r
ion
transcription
transla
tion
a. Componentes CRISPR 
baseados em DNA
plasmid DNA
gRNA Cas9 
mRNA
b. Componentes 
CRISPR baseados em RNA
gRNA-Cas9 protein
CRISPR-mediated 
cleavage
Nucleus
Figura 2. Diferentes formatos CRISPR.
Os componentes CRISPR podem ser 
introduzidos nas células como DNA, RNA ou 
RNPs do plasmídeo. Alguns formatos requerem 
etapas de transcrição e / ou tradução antes que a 
edição possa ocorrer. 
a) DNA plasmídico: a sequência de DNA do guia e 
Cas9 deve ser transportada para o núcleo e 
transcrita para o mRNA. O RNAm Cas9 se move 
para o citoplasma, onde é traduzido e complexa 
com um gRNA para formar uma RNP. A RNP volta 
ao núcleo. 
b) RNA: o RNA Cas9 é traduzido e depois 
complexado com um gRNA no citoplasma para 
formar um RNP. O RNP então se move para o 
núcleo.
c) Ribonucleoproteína (RNP): RNPs 
pré-complexados podem ser entregues no 
citoplasma ou diretamente no núcleo sem 
necessidade adicional de transcrição ou 
tradução.
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Escolhendo um Nuclease Cas
Nuclease Uses
Cas9 NLS, Cas9 2NLS Contém sinais de localização nuclear SV40 que marcam Cas9 para transporte para o núcleo celular. É benéfico quando as 
células eucarióticas estão sendo editadas. Recomendamos a versão 2NLS que contém sinais NLS nos terminais C e N da 
proteína Cas9.
Cas9 nickases Contém uma mutação (D10A ou H840A em S. pyogenes Cas9) que inativa um dos dois domínios de corte de Cas9, resultando 
em um corte em uma fita de DNA. Quando duas nickases são usadas na cadeia não alvo e na cadeia alvo, é feito um DSB. Isso 
pode ser usado para fazer com que o reparo ocorra via HDR usando DNA doador (em vez de NHEJ).
dCas9 Conhecido como "Cas9 morto", contém duas mutações (D10A e H840A em S. pyogenes Cas9) que inativam a atividade de 
corte de Cas9. Útil para silenciamento de genes (CRISPRi) e ativação (CRISPRa).
Cas12a (formerly Cpf1) Derivado de Prevotella e Francisella, o Cas12a é útil para reconhecer sequências ricas em AT e também gera um nick em vez de 
um DSB.
Cas13 (formerly C2c2) Enzima guiada por RNA de Leptotrichia shahii capaz de direcionar e degradar o RNA.
A nuclease Cas é o componente de "corte" do sistema CRISPR. 
Depois que o gRNA se liga à sequência alvo, a nuclease fará uma quebra de fita dupla (DSB) no DNA. Antes de qualquer corte, no entanto, a nuclease deve 
se ligar a um pequeno trecho de DNA chamado sequência de motivo adjacente protospacer (PAM), a jusante da sequência alvo. Se a sequência PAM não 
corresponder, o gRNA não poderá se ligar e o DNA permanecerá sem cortes. Nos últimos anos, vários tipos de nucleases de Cas foram descobertos, cada 
um associado a uma sequência PAM diferente. Abaixo, identificamos algumas nucleases diferentes e descrevemos situações em que são úteis para a edição 
do genoma.S. pyogenes Cas9
A nuclease Cas9 da bactéria Streptococcus pyogenes (SpCas9) é a nuclease mais comumente usada para edição de CRISPR. Esta nuclease reconhece o 
motivo PAM 5'-NGG-3 '(N significa qualquer nucleotídeo) e cria um DSB com extremidades rombas no local de destino. Foi a primeira nuclease projetada para 
edição CRISPR e é usada para uma variedade de aplicações knock-in e knock-in.
Embora Cas9 seja o mais usado, não é a única nuclease capaz de editar o genoma. A Tabela 2 descreve outras nucleases de Cas, incluindo variantes de 
Cas9, e as situações em que são usadas.
Tabela 2. Nucleases associadas ao CRISPR e seus usos.
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Técnica de Entrega
Os métodos de transfecção podem ser amplamente classificados em categorias físicas, químicas e mediadas por vírus. Cada método 
tem diferentes vantagens e desvantagens em relação à eficiência, rendimento, equipamento, habilidade e custo. Nesta seção, 
fornecemos uma visão geral de cinco métodos comuns de transfecção: lipofecção, eletroporação, nucleofecção, microinjeção e 
entrega mediada por vírus. Consulte a Tabela 3 para obter uma comparação de cada um desses métodos.
Transfecção estável: os gRNAs e / ou Cas9 estão presentes 
permanentemente na célula (incorporados ao genoma da célula).
Transfecção transitória vs estável
O método usado depende se a proteína Cas9 e / ou o RNA guia estão 
presentes temporariamente ou são permanentemente expressos nas 
células. Em uma transfecção transitória, os componentes CRISPR são 
introduzidos na célula, mas nenhum DNA que codifica um RNA guia ou 
Cas9 é incorporado ao genoma da célula. O CRISPR-Cas9 só pode clivar 
o DNA genômico da célula por um período limitado de tempo com essa 
abordagem. Uma vantagem principal das transfecções transitórias é que 
essa abordagem limita o risco de efeitos fora do alvo, porque os 
componentes do CRISPR não editam o genoma por longos períodos de 
tempo.
Para certas experiências em que a expressão a longo prazo de gRNAs e / 
ou Cas9 é necessária, pode ser preferível fazer uma transfecção estável, 
na qual o DNA que codifica um ou ambos os componentes CRISPR é 
permanentemente inserido no genoma da célula. Como os genes são 
integrados ao genoma celular, eles serão passados para as gerações 
futuras de células após a divisão celular. A expressão de Cas9 e / ou 
genes de RNA guia pode ser induzível (por exemplo, por um gatilho, como 
um medicamento) ou constitutiva (ocorrendo o tempo todo).
As transfecções estáveis são mais efetivamente alcançadas usando um 
vetor viral, embora também possam ocorrer em baixa frequência após a 
introdução do DNA plasmídico. É comum que os pesquisadores transfiram 
estavelmente apenas o DNA que codifica Cas9 (mas não o RNA guia) para 
produzir uma linha celular que expressa Cas9. Então, os gRNAs para 
diferentes alvos podem ser introduzidos nas células que expressam Cas9 
através de transfecção transitória.
As transfecções estáveis são geralmente mais trabalhosas do que as 
transitórias. Eles geralmente envolvem a co-transfecção de um marcador 
selecionável (por exemplo, um gene de resistência a antibióticos), 
enriquecendo as células com a integração genômica bem-sucedida e a 
clonagem de células selecionadas. Como as transfecções 
estáveis envolvem mais trabalho, elas geralmente são geradas apenas para 
projetos de pesquisa em que é necessária a expressão a longo prazo dos 
componentes do CRISPR.
Transfecção transitória: gRNAs e / ou Cas9 estão presentes temporariamente na 
célula.
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Lipofecção
A lipofecção é um método de transfecção de base química, no qual os reagentes lipídicos catiônicos facilitam a liberação de biomoléculas nas células (Fig. 3). O 
processo envolve a construção de lipossomos (estruturas lipossolúveis) ao redor dos componentes do CRISPR, que são então transportados para a célula 
através da endocitose. Como os componentes CRISPR não estão integrados ao genoma, eles residem temporariamente dentro da célula. A lipofecção é 
econômica, possui baixa citotoxicidade e pode ser adaptada a sistemas de alto rendimento. No entanto, a eficiência da transfecção geralmente não é tão alta 
quanto os outros métodos, como a eletroporação. Embora a lipofecção seja amplamente utilizada para células imortalizadas, ela não é recomendada para 
células primárias ou células-tronco.
RNPs
(gRNA/Cas9)
Reagente de 
lipofecção
+
Lipossomos
RNPs
Adicionar às células
Endocitose
Liberar RNPs
Núcleo 
Citoplasma
Figura 3. Lipofecção de componentes CRISPR.
Na lipofecção, os componentes CRISPR (por exemplo, RNPs) são primeiro incubados em um reagente de lipofecção para formar lipossomas. Então, os 
lipossomas são absorvidos pela célula por endocitose. Os RNPs são liberados e viajam para o núcleo para mediar a edição do CRISPR-Cas.
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Acer
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Acer
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Acer
Destacar
Eletroporação e Nucleofection
A eletroporação é um método de transfecção transitória que fornece 
máquinas CRISPR através da manipulação física das células. O método 
envolve a aplicação de um pulso elétrico curto e controlado às células, 
causando a formação de poros temporários na membrana plasmática. 
Esses poros servem como passagens para a entrada dos componentes do 
CRISPR (Fig 4).
Os métodos baseados em eletroporação podem ser subdivididos em dois 
tipos: eletroporação tradicional e nucleofecção. A eletroporação tradicional 
coleta as células, o gRNA / Cas9 e os reagentes em uma ponta de pipeta ou 
em uma cubeta de eletroporação especializada. O pulso elétrico é então 
aplicado aos componentes para facilitar a introdução dos componentes 
CRISPR através da membrana plasmática e, às vezes, também no núcleo.
Existem apenas alguns buffers disponíveis compatíveis com a 
eletroporação, e cada amostra deve ser processada uma de cada vez 
(baixa taxa de transferência). Um benefício deste dispositivo é que ele é 
um sistema aberto e o usuário pode definir manualmente os parâmetros 
para cada amostra. Essa característica permite otimizar parâmetros 
específicos para cada célulatipo. Um dispositivo de eletroporação popular 
é o Sistema de transfecção de néon da ThermoFisher Scientific.
Os métodos baseados em eletroporação são fáceis de executar, altamente 
eficientes, rápidos e eficazes para muitos tipos de células. No entanto, é 
necessário equipamento especial e a alta tensão pode resultar em mais 
morte celular em relação a outros métodos.
+
Adicionar a RNPs 
(gRNA / Cas9)
Células Reagente de eletroporação / 
nucleofecção
Nucleofector EletroporadorOU
Antes do pulso elétrico Pulso elétrico causa a formação de poros na 
membrana, RNPs entram na célula
Poros selam com RNPs 
dentro da célula
Aplicar 
pulso 
elétrico
+
+
+
+
- -
+ -
-
-
-
+ - + +
- +- +
-
-
- + 
Reparar
- +
+
+
- - +
-
Figura 4. Eletroporação e nucleofecção mediam a entrega da RNP. A 
eletroporação depende de pulsos elétricos, criando poros da membrana celular 
que permitem que os RNPs viajem dentro da célula. A nucleofecção é 
semelhante, exceto que forma poros na membrana nuclear para mediar a 
entrega nuclear de RNPs.
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Microinjeção
A microinjeção é comumente usada para injetar o Cas9 e o gRNA em 
oócitos ou zigotos, a fim de gerar organismos geneticamente modificados 
(Fig. 5). Este método envolve o posicionamento cuidadoso de uma célula 
alvo sob um microscópio e a entrega de gRNA / Cas9 no citoplasma ou 
núcleo através de uma micropipeta de vidro. A microinjeção é altamente 
técnica e requer equipamento especial, incluindo micromanipuladores e 
um microinjetor.Também é de baixa produtividade, pois apenas uma 
célula pode ser transfectada por vez.
No entanto, esse método pode resultar em eficiência muito alta quando 
realizado por indivíduos qualificados. A microinjeção é usada 
principalmente para transfectar células únicas, oócitos, zigotos e embriões. 
É um método popular para injeções pronucleares (no núcleo de óvulos 
fertilizados), usado para gerar camundongos transgênicos e outros 
animais.
Os embriões de vários organismos modelo, como o peixe-zebra e o embrião 
de camundongo, foram manipulados usando essa técnica (4,5). Também 
pode ser usado para transfectar alguns tipos de células.
Microscópio
Microinjetor
Placa de microinjeção
agulha de microinjeção
Núcleo
Citoplasma
RNPs
(gRNA/Cas9)
Figura 5. Entrega dos componentes CRISPR por microinjeção. A 
microinjeção de RNPs envolve o uso de uma agulha de microinjeção que perfura 
a membrana celular para facilitar a colocação direta de RNPs no núcleo.
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Lápis
Acer
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Vírus
Os vetores virais podem ser usados para obter transfecções estáveis, nas quais o DNA que codifica o gRNA e / ou Cas9 é inserido no genoma e reside 
permanentemente no interior das células. O processo envolve primeiro a introdução das seqüências de gRNA / Cas9 (plasmídeos) em uma linha de células de 
empacotamento (por exemplo, células T 293) para produzir partículas virais. Uma vez que as partículas virais são produzidas, elas são colhidas das células da 
embalagem e introduzidas nas células alvo. O vírus insere as sequências (como cDNA) no genoma das células alvo, onde são transcritas / traduzidas usando o 
próprio mecanismo da célula.
Existem vários tipos de vírus que podem ser usados para transdução, incluindo lentivírus, adenovírus, vírus adeno-associado e vírus do herpes. Para a 
transdução, os lentivírus (uma família de retrovírus que inclui o HIV) são frequentemente usados porque integram seu genoma no genoma das células 
infectadas (Fig. 6). Esses vírus são eficazes em uma variedade de linhas celulares, células primárias e células-tronco e podem ser usados in vivo. No entanto, 
porque se integram aleatoriamente no genoma, eles podem interromper os genes vitais ou alterar a regulação da expressão gênica. Os vetores virais são 
altamente eficientes na transfecção de componentes CRISPR e compatíveis com muitos tipos de células. No entanto, a construção de partículas virais é 
demorada e trabalhosa. Dependendo do tipo de vírus usado, podem ser necessárias medidas extras de segurança em laboratório.
Transfect Packaging Cells
gRNA/Cas9 
Plasmid
Packaging 
Genes 
Plasmid
 
Envelope 
Genes 
Plasmid
Coletar partículas virais 
(contendo RNA de gRNA / Cas9)
Transduzir células alvo,
O RNA é transcrito reversamente em cDNA
O cRNA do gRNA / Cas9 é integrado 
ao genoma das células alvo
Produzir partículas virais a partir de 
plasmídeos de expressão
 Transdução de vírus de CRISPR
componentes nas células alvo
 
Figura 6. Transdução lentiviral.
A transdução viral pode ser dividida em duas fases. Primeiro, as sequências de gRNA / Cas9, genes de empacotamento viral e genes de envelope viral são clonados em 
plasmídeos de expressão separados e depois introduzidos nas células de empacotamento. As partículas virais construídas são então colhidas. Em seguida, o vírus é usado 
para transduzir as células-alvo, onde o cDNA é integrado ao genoma das células-alvo.
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Controles experimentais
É importante considerar o uso de controles em seu experimento CRISPR. Os controles variam de acordo com o tipo de célula que está sendo editado. Os 
três tipos principais são descritos abaixo.
Controle positivo
Um controle positivo deve ser incluído para garantir que todos os 
reagentes, protocolos e equipamentos estejam funcionando (isto é, a 
edição é esperada). Isso pode incluir sgRNA que validou alta eficiência de 
edição.
Controle negativo
Um controle negativo, como Cas9 complexado com um sgRNA não 
direcionado ou sem sgRNA, deve ser incluído. Nenhum efeito é esperado 
(tipo selvagem). Esse controle garante que não haja falsos positivos 
devido à contaminação.
Tabela 3. Comparação dos métodos de transfecção CRISPR
14 
Lipofection
Electroporation/ 
Nucleofection Microinjection Virus
Princípio O lipídio complexado com 
componentes CRISPR funde-se 
com a membrana celular.
O pulso elétrico forma os poros na 
membrana celular para a entrada 
dos componentes CRISPR.
Microneedle injeta componentes 
CRISPR dentro de células, oócitos 
ou zigotos.
DNA/RNA is packaged into infectious 
particles and introduced into cells.
Vantagens • Custo-beneficio
• Alto rendimento
• Fácil, rápido
• Alta eficiência
• Alta eficiência • Alta eficiência
Limitações • Menos eficiente • Requer otimização
• Requer equipamento especializado
• Demorado
• Tecnicamente exigente
• Baixa produtividade
• Demorado
• Requisitos de segurança
• Caro
Transitório / Estável Transitório Transitório Transitório Estável
Mock
Também é recomendável usar um tratamento simulado, no qual as 
células são transfectadas sem o gRNA e Cas9 (nenhum efeito é 
esperado, tipo selvagem). Esse tratamento controla a toxicidade do 
RNP, a morte celular por transfecção ou possíveis problemas de 
viabilidade associados à edição do gene específico de interesse.
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Edite seu gene alvo em células de interesse
Após projetar os parâmetros experimentais do CRISPR e escolher um método de transfecção, é essencial otimizar 
a transfecção para o seu tipo de célula específico. Após a otimização, agora é hora de editar seu gene alvo em 
suas células de interesse. Esta etapa envolve transfectar as células com os componentes CRISPR usando os 
parâmetros ideais de transfecção que você estabeleceu na etapa anterior e permitindo que as células se 
recuperem posteriormente. Experimentos que usam CRISPR para diferentes objetivos são projetados para 
explorar diferentes caminhos de reparo.
Diferentes tipos de edições são gerados em cada caso. Abaixo, resumiremos os tipos de edições produzidas para 
dois usos comuns do CRISPR: knock-in e knockout.
Knock-ins
Para experimentos knock-in, um modelo de doador de DNA é transfectado junto com os componentes CRISPR. 
Este modelo contém a sequência de interesse ladeada por sequências que são homólogas à sequência genômica 
alvo.
Como um modelo é usado, esse reparo em HDR é normalmente preciso e a sequência de interesse é inserida no 
genoma sem problemas. No entanto, o HDR ocorre apenas nas fases S e G2 do ciclo celular e é menos eficiente 
que o NHEJ. Uma eficiência de cerca de 20% é geralmente considerada boa, mas varia de acordo com o tipo de 
célula e as condições utilizadas. Também não é incomum que algum reparo do NHEJ ocorra em experimentos de 
imersão. Como resultado, as células editadas podem conter alguns indels.
Knockout (KO): uma mutação em uma sequência genética que faz com que seja 
inoperante (isto é, nenhuma proteína funcional é produzida).
Knock-in (KI): a integração de uma sequência genética estranha no genoma 
de uma célula.
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Knockouts
As experiências de nocaute contam com o NHEJ para reparar DSBs 
induzidos por CRISPR. Embora esse caminho geralmente conserte 
quebras fielmente, ocasionalmente são gerados indels aleatórios. À 
medida que as sequências alvo são cortadas, reparadas e recortadas, 
esses índices aumentam na população de células.
A população de célulaseditada (denominada pool de células knockout) 
terá, portanto, uma mistura de diferentes indels no site de destino. Cada 
alelo é reparado independentemente, de modo que uma célula diplóide 
possa ter ambos os alelos editados (edição homozigótica), um alelo 
editado e um não editado (edição heterozigótica) ou ambos os alelos 
não editados (tipo selvagem; Fig 7). As células que têm ambos os alelos 
editados, mas com mutações diferentes em cada um, são chamadas 
heterozigotos compostos. Das seqüências editadas, aquelas que têm 
mutações no deslocamento de quadro induzirão um nocaute no gene 
alvo.
Knockout Cell Pool
Alelo 1
¯2 nt
Homozigoto Editado
Ambos os alelos são editados. 
Nesta célula, o alelo 1 e 2 têm 
uma exclusão de 2 nt.
¯2 nt
Alelo 2
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
Heterozigoto Editado
Um alelo é editado. Nesta 
célula, o alelo 1 tem uma 
inserção de 1 nt e o alelo 2 
não é editado (tipo selvagem)
Resultado
Nocaute em um alelo
Resultado
Nocaute em ambos os alelos
Alelo 1
+1 nt
Alelo 2
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
Alelo 1
Alelo 2
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
Célula não editada
Ambos os alelos são do 
tipo selvagem não editado 
(peso).
Resultado
Sem Knockout
wtwt
wt
Figura 7. Tipos de edições em um conjunto de células knockout.
Os pools de células knockout são compostos por uma mistura de células editadas e 
não editadas (tipo selvagem). Essa mistura de células pode incluir três tipos de 
edições: edição não editada, homozigótica e edição heterozigótica. Indels que não 
são múltiplos de três induzirão um nocaute. Quanto mais alelos de nocaute em um 
pool, maior a eficiência do nocaute.Edição homozigótica: ambos os alelos de um par cromossômico têm a mesma 
mutação.
Edição heterozigótica: cada alelo de um par cromossômico tem uma 
mutação diferente ou um alelo tem uma mutação e um não é editado.
Conjunto de células nocauteadas: uma cultura de células editada pelo 
CRISPR que contém uma mistura de sequências editadas e não editadas no 
locus de destino.
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Analisar edição genética
A validação da edição do CRISPR por análise é uma etapa extremamente importante em seu experimento. Existem muitas opções
disponível para avaliar a eficiência da edição do CRISPR - como você sabe qual é a certa para você? Resumimos as principais 
ferramentas e métodos de análise CRISPR que os cientistas usam para avaliar os resultados de suas experiências com CRISPR.
Visão geral dos métodos de análise CRISPR
Os métodos disponíveis para analisar a eficiência da edição do CRISPR 
variam de acordo com o mecanismo de reparo. Experiências interativas 
que utilizam o reparo direcionado à homologia (HDR) para inserir ou 
alterar uma sequência de DNA
pode ser analisado por vários métodos, como digestão da enzima de 
restrição (se a sua mutação resultar em perda ou ganho de um local da 
enzima de restrição) ou alterações no tamanho do seu produto de PCR (se 
o seu modelo de reparo for
grande o suficiente para detectar uma alteração de tamanho). O 
sequenciamento tradicional de Sanger ou o sequenciamento de próxima 
geração (NGS) podem ser usados para avaliar alterações em uma 
resolução mais precisa. A ferramenta ICE da Synthego (consulte a seção 
abaixo) é uma maneira rápida e eficaz de analisar os dados de inserção 
da sequência Sanger.
As experiências de nocaute exploram o caminho de reparo da junção não 
homóloga (NHEJ). Esse mecanismo geralmente insere e exclui 
nucleotídeos (chamados indels) no local do corte. A frequência e o tipo de 
indel são aleatórios, resultando em uma população heterogênea de 
células que abrigam vários indels. As abordagens baseadas em 
sequenciamento e não sequenciamento para avaliar a eficiência da 
edição em sua população são descritas abaixo.
Indels: inserção ou deleção de nucleotídeos no genoma. Freqüentemente 
causada por junção de extremidade não homóloga após uma quebra de fita dupla 
no DNA.
Se sua experiência está usando HDR ou NHEJ, muitos métodos de análise 
CRISPR contam com a amplificação por PCR da região editada como um 
primeiro passo. Dependendo do método, o sequenciamento Sanger 
subsequente de amostras de controle (não editadas) e experimentais 
(editadas) é usado para analisar o grau ou extensão da edição do CRISPR 
(eficiência de edição) e o espectro dos eventos de edição (clonalidade). 
Abordagens baseadas em não sequenciamento dependem da manipulação 
do produto de PCR resultante para determinar as alterações.
União final não homóloga (NHEJ): um mecanismo celular que repara quebras de fita 
dupla no DNA, mas pode inserir ou excluir nucleotídeos (indels) no processo. Indels que 
não são múltiplos de três provavelmente causarão um KO do gene.
17 Movimento Biotecnologia Brasil
Inferência de edições CRISPR (ICE)
A maneira mais fácil de fazer isso é sequenciar o DNA editado e controlar o 
Sanger no local do corte e usar um programa de análise de software, como 
a ferramenta Inference of CRISPR Edits (ICE) da Synthego ou Tracking 
Indels by DEcomposition (TIDE). No início, o software TIDE era comumente 
usado para analisar dados no nível do Sanger. Semelhante ao TIDE, o ICE 
utiliza os dados de sequenciamento Sanger e analisa as populações de 
células contendo edições mistas. No entanto, a ferramenta ICE da Synthego 
é um programa gratuito e fácil de usar que fornecerá resultados em questão 
de minutos com a qualidade do nível NGS (Fig 8). O ICE é capaz de 
analisar as experiências de nocaute e knock-in do CRISPR. No relatório ICE 
para nocautes gerado pelo NHEJ, é possível descobrir a eficiência geral da 
edição, os indels específicos gerados e a Pontuação de Knockout (a 
porcentagem de indels provavelmente causará um nocaute). Para 
knock-ins, a eficiência da edição é relatada como uma Pontuação de 
Knock-In (porcentagem de sequências com a inserção desejada) exibida no 
relatório ICE.
Figura 8. Saída da análise de ICE.
Um exemplo de saída de análise para um experimento de knockout da 
ferramenta Inference of CRISPR Edits (ICE). A sequência guia (sublinhado 
preto) e o local de corte (linha pontilhada) são representados. A ferramenta ICE 
compara traços editados e não editados e a porcentagem de indel e a 
Pontuação de Knockout são calculadas.
Pontuação de nocaute (KO): uma métrica da eficiência do nocaute determinada pela 
ferramenta ICE da Synthego. A pontuação KO é definida como a porcentagem de 
sequências editadas pelo CRISPR que causam um nocaute putativo do gene alvo, 
incluindo aquelas com indels de indução de mudança de quadro e indels com 21 + nt de 
comprimento.
Pontuação de Knock-in: uma métrica de eficiência de knock-in determinada pela 
ferramenta ICE da Synthego. A pontuação KI é definida como a porcentagem de 
sequências que contêm a edição de inserção desejada.
18 Movimento Biotecnologia Brasil
Sequenciação de Nova Geração (NGS)
O padrão-ouro para analisar a edição do CRISPR envolve o seqüenciamento 
direcionado da próxima geração para executar o sequenciamento profundo 
na região de interesse. O NGS direcionado é um método extremamente 
sensível para detectar resultados de edição, e os dados baseados em 
sequência de alto rendimento fornecem uma visão abrangente dos indels 
gerados. Este nível de análise detalhada dos dados não sai barato. O NGS é 
um processo extremamente demorado e trabalhoso que inclui muitas etapas 
de extração do DNA para sequenciamento e análise, que não são passíveis 
de laboratórios menores ou estudos CRISPR em pequena escala. Portanto, 
o NGS é mais eficaz quando o número de amostras é alto, você tem acesso 
a uma equipe de bioinformática e seu orçamento permite.
Ensaio de endonuclease 1 de T7 (T7E1)
O ensaio T7E1 é uma maneira simples e simples de estimar a eficiência 
de edição do CRISPR usando a endonuclease T7 para clivar o DNA 
incompatível. Após a amplificação por PCR, o produto resultará em DNA 
heteroduplexado.O T7E1 reconhece e cliva duplexes de DNA que contêm 
incompatibilidades, de modo que as regiões editadas serão clivadas e 
geram fragmentos de DNA de tamanho menor que são visualizados por 
eletroforese em gel de agarose. Este ensaio pode ser usado para 
identificar a presença de mutações geradas por CRISPR, mas não é 
quantitativo e não fornece informações sobre as diferentes sequências 
indel. Como é barato e rápido, o teste T7E1 às vezes é usado para 
otimizar as condições do CRISPR quando opções precisas de análise não 
estão disponíveis ou são desnecessárias.
Ensaios a jusante
Embora a análise genotípica seja crítica, a validação em nível de proteína 
também é importante. Os ensaios incluem métodos laboratoriais comuns, 
incluindo Western blot, ELISA e FACS. Todos os três dependem da 
disponibilidade, epítopo e qualidade do anticorpo para detectar suas edições 
do CRISPR. A validação por FACS é uma maneira simples e rápida de 
analisar proteínas da superfície celular. Se sua proteína é secretada, os 
ELISA são úteis na detecção de fatores secretados.
Finalmente, os Western blots são um bom método para a detecção de 
proteínas, especialmente para proteínas intracelulares, pois a lise celular é 
um passo anterior à extração de proteínas.
19 Movimento Biotecnologia Brasil
Qual método de análise CRISPR é 
ideal para você?
20 
Agora que você se familiarizou com as várias maneiras de analisar seus 
dados do CRISPR, como você sabe qual escolher? O método escolhido 
depende do tempo e orçamento disponíveis, bem como do nível de detalhe 
que você deseja entender ou obter com a análise.
Embora o NGS seja o padrão-ouro devido à sua alta precisão e 
sensibilidade, ele só é útil quando você tem um grande número de amostras 
e fundos e acesso a bioinformática para apoiar a análise. Se o NGS não 
estiver no seu orçamento, as ferramentas de software ICE e TIDE oferecem 
alternativas econômicas que fornecem dados no nível da sequência e 
significância estatística para os indels identificados. Entre os dois, o ICE 
possui maiores recursos em comparação com o TIDE, pois pode detectar 
mais resultados de edição, incluindo inserções ou exclusões grandes. Além 
disso, o ICE demonstrou ser comparável ao NGS, o que significa que você 
obtém a relação custo-benefício do seqüenciamento Sanger sem sacrificar 
a precisão.
Seja qual for o método escolhido, é extremamente importante validar os 
resultados do seu experimento CRISPR antes de prosseguir para as 
próximas etapas do seu projeto.
Referências
1. Liang X, Potter J, Kumar S, Zou Y, 
Quintanilla R, Sridharan M, Carte J, Chen W, Roark 
N, Ranganathan S, Ravinder N,
Chesnut JD. (2015) Rapid and highly efficient 
mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. 
J Biotechnol. Aug 20;208:44-53.
2. Farboud B, Jarvis E, Roth TL, Shin J, Corn JE, 
Marson A, Meyer BJ, Patel NH, Hochstrasser ML. 
(2018) Enhanced Genome Editing with Cas9 
Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. J Vis 
Exp. May 25;(135).
3. Hendel H, Bak RO, Clark JT, Kennedy AB, Ryan DE, Roy S, 
Steinfeld I, Lunstad BD, Kaiser RJ, Wilkens AB, 
Bacchetta R, Tsalenko A, Dellinger D, Bruhn L, 
Porteus MH. (2015)
Chemically modified guide RNAs enhance 
CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat 
Biotechnol. Sept 33;9:985-989.
4. Xie SL, Bian WP, Wang C, Junaid M, Zou JX, 
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A novel technique based on in vitro oocyte injection to 
improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Sci 
Rep. Sep 29;6:34555.
5. Horii T, Arai Y, Yamazaki M, Morita S, Kimura M, Itoh M, 
Abe Y, Hatada I. (2014) Validation of microinjection 
methods for generating knockout mice by 
CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Sci Rep. Mar 
28;4:4513.
Sobre o Movimento Biotecnologia Brasil
Somos uma instituição que visa mobilizar os cidadãos em 
favor de implementar planos, programas, projetos, ações e 
atividades para o efetivo desenvolvimento da Biotecnologia 
no Brasil. Defendemos a interação do Governo Federal com 
o setor empresarial, academia, laboratórios públicos e 
institutos de pesquisa, o que permite criar oportunidades para 
os diversos setores que utilizam a biotecnologia no país.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26003884
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26003884
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