Modelo de Slide I

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BIOTECNOLOGIA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
Helmer Kefrem Pereira da Silva
Karla Vanessa do Carmo Cunha
Raysla Maria de Sousa Almeida
Sthefany Renaly de Andrade
Sebastião Tilbert
CAMPINA GRANDE-PB
MAIO/2019
As técnicas de genética molecular 
revolucionaram a biologia
Revolução da Genética Molecular
Stanley Cohen e Herbert Boyer Moléculas de DNA
recombinante
Tecnologia do DNA recombinante Localizar, isolar, alterar e
estudar segmentos de
DNA
• Fármacos;
• Hormônios;
• Enzimas;
• Plantações.
Como trabalhar a nível celular?
▪ São complementares a cada uma
e podem parear espontaneamente
para ligar os fragmentos.
▪ Quando suas extremidades
coesivas pareiam, dois
fragmentos de DNA podem ser
unidos de forma permanente pela
DNA ligase, que sela os cortes
entre os grupos de açúcar-fosfato
dos fragmentos.
Enzima de Restrição | Extremidades Coesivas
Corta no meio do sítio de reconhecimento e os cortes nas duas fitas são 
diretamente opostas uma à outra, produzindo fragmentos de extremidades cegas.
Enzima de Restrição | Extremidades Cegas 
Essa sequência específica é determinada pela sequência de aminoácidos
da proteína. Ao alterar a sequência de aminoácidos da proteína ligadora,
a nuclease modificada pode ser personalizada ao se ligar e cortar
qualquer sequência específica de DNA.
Produzem cortes de fita dupla no DNA em qualquer sequência de
DNA predeterminada. As nucleases modificadas são parte de uma
enzima de restrição que cliva o DNA, acoplada com outra proteína que
reconhece e se liga a uma sequência específica de DNA.
Enzima de Restrição | Nucleases Modificadas
Clonagem de Genes
Clonagem de Genes
Vetor de clonagem
Vetores plasmídeos
• Origem de replicação
• Marcadores selecionáveis
• Um ou mais sítio de restrição
Clonar fragmentos de
DNA nas bactérias
Transformação Células bacterianas captam o DNA
do ambiente externo
Clonagem de Genes
Seleção de células para plamídios 
recombinantes
Aplicação | Engenharia Genética
das Plantas com Pesticidas
Aplicação | Engenharia Genética das Plantas com Pesticidas
A bactéria Bacillus thuringiensis produz naturalmente uma
proteína, conhecida como toxina Bt, letal para muitos insetos.
Essa toxina é particularmente atraente como inseticida porque é
específica para alguns insetos, degradada rapidamente no
ambiente e não tóxica para os humanos e outros animais.
Aplicação | Transgênicos
Amplificação dos fragmentos de 
DNA utilizando a PCR
▪ Desnaturação: Quebra da
dupla fita de DNA.
▪ Anelamento: Os primers se
ligarão aos seus locais
específicos na fita do DNA.
▪ Extensão: Taq polimerase vai
estender a fita (preencher).
Aplicações da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Técnica usada para separar fragmentos de DNA 
de acordo com seu tamanho:
▪ As amostras de DNA são aplicadas nos poços
localizados em um gel, e uma corrente elétrica
é aplicada para fazê-las avançar pelo gel;
▪ Os fragmentos de DNA estão carregados
negativamente, então movem-se na direção do
eletrodo positivo. Já que todos os fragmentos
de DNA têm a mesma quantidade de carga por
massa, os fragmentos menores atravessam o
gel mais rapidamente do que os maiores.
Eletroforese em Gel 
Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA, os fragmentos
de DNA podem ser vistos como bandas, cada uma representando um grupo de
fragmentos de DNA de mesmo tamanho. Essa visualização é possível através do
transluminador que emite uma luz UV que permite visualizar os fragmentos.
Visualização dos Fragmentos de DNA
Amplificação dos fragmentos 
de DNA utilizando a RFLP
Cada individuo apresentará o seu padrão de
fragmentos, chamado “perfil de digestão”, detectado
pelo número e tamanho dos fragmentos gerados.
Sendo possível analisar os genótipos de cada indivíduo
da população.
❑ Água
❑ Tampão
❑ Enzima
❑ DNA
amplificado
Polimorfismos de Comprimento do Fragmento de Restrição
PCR RFLP
GENES PRIMERS
Fragmento 
esperado 
(PCR)
Enzimas
Fragmento 
esperado 
(RFLP)
CYCD1GA 5’GTGAAGTTCATTTCCAATCCGC-
3’ 5’GGGACATCACCCTCACTTAC-
3’ 
167 pb Nci I 145 e 22 pb
XRCC1 5’-TCTCCCTTGGTCTCCAACCT-3’ 
5’-AGTAGTCTGCTGGCTCTGG-3’
455 pb Msp I 210, 140 e 105
pb
XRCC3 5’-GACACCTTGT TGGAGTGTGT-3’
5’-GTCTTCTCGATGGTTAGGCA-3’
358 pb Nla III 200 e 150 pb
Os primers usados na PCR são específicos para sequências de DNA conhecidas, 
então a PCR pode ser usada para detectar a uma sequência específica de DNA 
em uma amostra.
Amplificar segmentos específicos de DNA, que são então analisados por outras 
ferramentas moleculares que identificam diferenças nos segmentos de 
nucleotídeos.
A PCR em tempo real é combinada com a PCR de transcriptase reversa
para quantificar o mRNA em uma amostra, permitindo determinar o
nível de expressão gênica em diferentes células e em diferentes
condições.
Aplicações da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Aplicações da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)Limitações da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Requer o conhecimento prévio de pelo menos parte da sequência do DNA-alvo 
para permitir a construção dos primers.
Capacidade da PCR em amplificar quantidades muito pequenas de DNA torna a
contaminação um problema grave. 
A Taq polimerase não tem a capacidade de revisar e sob as condições da PCR, ela 
incorpora um nucleotídeo incorreto a cada 20.000 pb.
A tamanho dos fragmentos que podem ser amplificados pela Taq polimerase 
padrão é em geral de menos de 2.000 pb
Sequenciamento de DNA
Tecnologias de Sequenciamento próxima geração
Pirossenquenciamento
Sequenciamneto Ilumina
Baseia-se na síntese de DNA: os
nucleotídios são adicionados um por vez na
ordem especificada pelo DNA molde, e a
adição de um nucleotídio específico é
detectada por um flash de luz, gerado à
medida que o nucleotídio é adicionado.
O sequenciamento illumina emprega uma
tecnologia semelhante à do método
didesoxi de Sanger. São usados
nucleotídios especiais que têm um
marcador fluorescente preso, com um
marcador colorido diferente para cada tipo
de nucleotídio.
Figura 9.6 Natureza das mutações p53 (A)
alelos p53 mutados pontualmente (quase
sempre a substituições de aminoácidos; em
verde) representam a grande maioria dos
alelos p53 mutantes encontrados em tumores
humanos, enquanto outros tipos de mutações
são observados com menos freqüência. Em
contraste, as mutações que acometem outros
tipos de genes supressores de tumor (APC), ou
genes caretakers envolvidos na manutenção do
genoma (ATM, BRCA1), representam
mudanças na fase de leitura (amarelo) ou
códons sem sentido (azul) na maioria dos
casos, ambos os quais modificam a estrutura,
geralmente por meio da criação de versões
truncadas de proteínas; tais formas defectivas
dessas proteínas são, várias vezes,
degradadas rapidamente nas células.
(B) Mais de 15 mil alelos p53 mutantes têm
sido seqüenciados em tumores humanos, dos
quais a maioria (75%) são mutações pontuais.
As localizações dessas mutações que se
encontram dentro da fase de leitura de p53 são
demonstradas aqui. Como pode se verificar, a
grande maioria das mutações de p53 (95,1%)
afeta o domínio de ligação ao DNA da proteína
p53. Os números acima na figura indicam o
número do resíduo de aminoácido.
Versões mutantes de p53 interferem na função normal da proteína
Figura 9.13 Controle dos níveis de p53 por diversas cinases
(A) O ciclo de síntese e destruição de p53 pode ser
modulado por uma série de reguladores. Cinases sensíveis
a dano ao DNA, tais como ATM e ATR, atuando direta ou
indiretamente por meio de Chk2, podem fosforilar p53
(centro) no seu domínio N-terminal, que previne a ligação de
Mdm2 (dourado, no centro à esquerda). Ao mesmo tempo, a
fosforilação de moléculas de Mdm2, realizada por essas
cinases, bloqueia a sua habilidade de se associar à p53
(centro). Essas alterações salvam p53 da ligação mediada
por Mdm2, da ubiquitilaçãoe da destruição em
proteassomos (abaixo à esquerda) que poderiam ocorrer.
Atuando de maneira oposta, determinados sinais de
sobrevivência (como aqueles transportados por fatores de
crescimento mitogênicos), agindo por meio dos fatores de
transcrição AP-1 e Ets, colaboram com p53 para promover a
expressão do gene Mdm2 (centro à direita), resultando no
aumento do mRNA e na síntese protéica de Mdm2 (abaixo à
direita). Esses sinais de sobrevivência também ativam a
Akt/PKB cinase, a qual fosforila e ativa as moléculas Mdm2
já sintetizadas em outro sítio (abaixo). A proteína resultante
Mdm2 ativada então realiza sua ligação à p53 e
desencadeia a ubiquitilação desta e sua posterior destruição
mediada por proteassomos (abaixo, à esquerda). (Recentes
evidências sugerem que p53 se torna monoubiquitilada no
núcleo e poliubiquitilada no citoplasma.) (B) A estrutura da
interface em que p53 e Mdm2 interagem tem sido revelada
por cristalografia de raios X. O domínio interativo de p53 é
mostrado como um modelo amarelo de espaço preenchido
que inclui os resíduos 18 a 27 de p53, enquanto a superfície
do bolsão complementar de Mdm2 é mostrada como um
emaranhado de fio azul. A fosforilação de p53 por cinases
como Chk2, ATM e ATR previne essa interação, poupando
p53 da ubiquitilação mediada por Mdm2 e subseqüente
degradação.
Figura 9.15 Controle da apoptose por ARF (A) A proteína
p14ARF humana (p19ARF em camundongos), denominada
ARF na figura (azul-claro, acima), é capaz de se associar a
Mdm2 (dourado) no nucleoplasma de células e arrastar
Mdm2 para os nucléolos (acima, à direita). Uma vez
seqüestrada no nucléolo, Mdm2 não é mais capaz de atacar
p53 e, assim, fazê-la de alvo para destruição por
ubiquitilação (abaixo, à direita). Assim, elevados níveis de
ARF causam aumento dos níveis de p53. (B) Uma variedade
de sinais oncogênicos favorece a apoptose por meio de suas
habilidades em induzir a atividade de E2F, o que leva, por
sua vez, ao aumento da expressão de ARF. Dentre esses
fatores, estão incluídas as oncoproteínas E1A de adenovírus,
Myc (=c-Myc) e Ras. Isso sugere que essa via de sinalização
tem evoluído para eliminar células que apresentam, dentre
outros defeitos, sinalização excedente de E2F ativa. (C) Uma
cópia do gene que codifica p19ARF tem sido inativada na
linhagem germinativa de camundongos por meio de sua
substituição por uma seqüência que codifica GFP (green
fluorescent protein). Esses camundongos (ARF+/GFP, linha
vermelha) e camundongos tipo selvagem (ARF+/+, linha
verde) foram cruzados com outros que carregavam um
transgene Eμ−myc, o qual causa o desenvolvimento de
linfomas de célula B (também descritos na Figura 9.22). O
camundongo ARF+/GFP Eμ−myc desenvolveu tumores letais
muito mais rapidamente do que aqueles que apresentavam
somente o transgene Eμ−myc, e as células desses tumores
perderam seus alelos ARF tipo selvagem remanescentes.
Assim, na ausência da função de ARF, os efeitos pró-
apoptóticos de um oncogene myc (B) são amplamente
perdidos, permitindo que seus efeitos proliferativos dominem
e direcionem a formação do tumor.
Ainda um outro mecanismo que afeta Mdm2, é o ARF. 
Investigações revelaram que, em células tipo selvagem, a 
expressão de ARF causa um rápido aumento dos níveis de 
p53. A proteína ARF liga-se à Mdm2 e inibe a ação desta, 
por meio do sequestro de Mdm2 no nucléolo.