6 AULA - Diagnóstico Molecular

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Questão 1: 
A anemia falciforme está associada a existência de uma mutação de ponto A - T, no 
gene da β-globina que ocasiona, na proteína, a troca do aminoácido Glu por Val. Esta 
mutação elimina um sítio reconhecido pela enzima de restrição Mst II. O desenho 
abaixo representa um esquema dos genes selvagem e mutante. O DNA de uma 
pessoa normal foi extraído, digerido com a enzima Mst II, fracionado por eletroforese 
e submetido a “Southern blot”. A sonda utilizada na hibridação foi o segmento de 1,3 
kb indicado na figura abaixo. 
 
A) Planeje um teste utilizando a técnica de "Southern blot" para o diagnóstico pré-
natal desta doença. Faça o esquema do resultado esperado considerando um feto 
normal e de um portador da doença cujos pais são heterozigóticos. 
 
B) Complete na figura o padrão de bandas esperado para o DNA de: 
b.1) Pessoa homozigótica para a mutação de ponto que causa a anemia 
falciforme. 
b.2) Pessoa heterozigótica para a mutação. 
 
Questão 2: 
2.1) Explique o processo de amplificação de DNA pela reação de polimerização em 
cadeia (PCR). 
A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para fazer muitas cópias 
de uma região específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao invés de um 
organismo). A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável, a Taq 
polimerase, e requer primers de DNA projetados especificamente para a região de 
interesse do DNA. Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de 
alterações de temperatura, o que possibilita a produção de muitas cópias da região 
de interesse. 
A DNA polimerase tipicamente usada na PCR é chamada de Taq polimerase, em 
homenagem à bactéria resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus). 
Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente 
quando lhe é dado um primer, uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um 
ponto de partida para a síntese de DNA. Em uma reação de PCR, o pesquisador 
determina a região do DNA que será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela 
ou ele escolher. 
Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por volta 
de 202020 nucleotídeos de comprimento. Dois primers são usados para cada reação 
de PCR, e eles são projetados de modo que englobem a região de interesse (região 
que deve ser copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas 
opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a ser copiada. Os primers 
se ligam ao molde por pareamento de bases complementares. 
 
Quando os primers são ligados ao molde, eles podem ser estendidos pela polimerase, 
e a região que está entre eles será copiada. 
 
Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers, DNA 
molde e nucleotídeos (blocos que compõem o DNA). Os ingredientes são reunidos 
em um tubo, juntamente com cofatores de que a enzima precisa, e passam por 
repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento que permitem que o DNA seja 
sintetizado. 
As etapas básicas são: 
• Desnaturação (96 °C): Aquece fortemente a reação para separar, ou 
desnaturar, as fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita simples para a 
próxima etapa. 
• Anelamento (55 - 65 °C): Resfria a reação para que os primers possam se ligar 
às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples. 
• Extensão (72 °C): Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase 
estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA. 
 
Este ciclo se repete 252525 - 353535 vezes em uma reação típica de PCR, que 
geralmente ocorre em 222 - 444 horas, dependendo do comprimento da região de 
DNA a ser copiada. Se a reação for eficiente (funcionar bem), a região de interesse 
pode gerar de uma ou poucas cópias até bilhões. 
Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada vez. Ao 
invés, o novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na próxima rodada de 
síntese de DNA. Há muitas cópias dos primers e muitas moléculas de Taq polimerase 
flutuando pela reação, então o número de moléculas de DNA pode aproximadamente 
dobrar a cada rodada do ciclo. 
2.2. Qual a função dos primers na técnica da PCR? 
Os primers servem como ponto inicial para a ação da Taq polimerase. 
2.3. Cite pelo menos três aplicações da técnica da PCR. 
Através da PCR, uma sequência de DNA pode ser amplificada milhões ou bilhões de 
vezes, produzindo cópias suficientes de DNA para serem analisadas por outras 
técnicas. Por exemplo, o DNA pode ser visualizado por eletroforese em gel, enviado 
para sequenciamento, ou digerido por enzimas de restrição e clonado em um 
plasmídeo. 
A PCR é usada em muitos laboratórios de pesquisa e também tem aplicações práticas 
em ciências forenses, testes genéticos e diagnósticos. Por exemplo, a PCR é utilizada 
para amplificar genes associados a desordens genéticas a partir do DNA de pacientes 
(ou do DNA fetal, nos casos de teste pré-natal). A PCR também pode ser utilizada 
para testar se há DNA bacteriano ou viral no corpo de um paciente: se o patógeno 
estiver presente, pode ser possível amplificar regiões de seu DNA a partir de uma 
amostra de sangue ou tecido. 
Questões 3: 
O que são enzimas de restrição? 
As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição como também são 
conhecidas, são enzimas que cortam a molécula de DNA através do reconhecimento 
de sequências nucleotídicas específicas. 
As endonucleases de restrição são enzimas bacterianas que atuam como "tesouras 
moleculares", reconhecendo sequências de pares de bases específicas em moléculas 
de DNA e cortando-as nesses pontos. Elas são altamente específicas: cada tipo de 
enzima reconhece e corta apenas uma determinada sequência de nucleotídeo, em 
geral constituída por 4 ou 6 pares de bases azotadas. 
Estas enzimas funcionam nas células bacterianas como parte de um mecanismo de 
proteção ao ataque de bacteriófagos chamado sistema de restrição modificação. Uma 
molécula de DNA viral que contenha sítios para uma endonuclease bacteriana, ao ser 
injetada na bactéria, é prontamente cortada nesses pontos e deixa de funcionar. O 
DNA da própria célula bacteriana é protegido por metilação. Hoje são conhecidas 
centenas dessas enzimas, que são purificadas e comercializadas por diversos 
laboratórios no mundo. 
Questões 4: 
O cromatograma da figura 1 foi obtido a partir da análise dos fragmentos de DNA ao 
lado, quando estes passaram por um sensor capaz de detectar cores diferentes. Em 
que ordem você espera que eles tenham passado para produzir tal resultado? 
 
7 [6], 4 [7], 8 [8], 2 [9], 10 [10], 12 [11], 6 [12], 11 [13], 1 [14], 5 [15], 9 [16], 3 [17]. 
Questões 5: 
Conceitue Terapia Gênica, relacionando vantagens e desvantagens. 
Terapia gênica é o tratamento baseado na introdução de genes sadios com uso de 
técnicas de DNA recombinante. Consiste na inserção de genes nas células e tecidos 
de um indivíduo para o tratamento de uma doença, em especial, doenças hereditárias. 
A terapia genética visa a suplementar com alelos funcionais aqueles que são 
defeituosos ou mortos. 
Na maioria dos estudos a respeito de terapia genética, um gene "normal" é inserido 
no genoma para substituir um gene "anômalo" causador de doença. Uma molécula 
transportadora, chamada vetor, precisa ser usada para se enviar o gene terapêutico 
para as células-alvo do paciente. Atualmente, o vetor mais comum é um vírus que foi 
geneticamente alterado para transportar DNA humano normal. Vírus evoluíram de 
forma a encapsular e transportar seus genes para células humanas, causando 
doenças. Cientistas tentaram aproveitar essa capacidade e manipular o genoma dos 
vírus, removendo os genes causadores de doença e inserindo genes terapêuticos. 
Células-alvo, tais como células do fígado ou dos pulmões do paciente, são infectadas 
com o vetor. O vetor, então, descarrega seu material genético, contendo o gene 
terapêutico humano, na célula-alvo. A produçãode proteínas funcionais pelos genes 
terapêuticos restauram as células-alvo a um estado de normalidade. 
A utilização de vírus como vetores apresentam as maiores vantagens e também as 
maiores desvantagens para terapia gênica. Dentre as vantagens, pode-se salientar o 
fato de serem vetores naturais de transferência de genes e que resistem à 
degradação. Possuem, entretanto, maior potencial para induzir uma resposta imune, 
sendo considerados mais prejudiciais ao organismo. 
Se, de um lado, a terapia gênica aparece como possibilidade de tratamento de 
doenças até hoje sem cura, ela também é considerada um procedimento de risco e, 
por isso, vários ensaios são realizados para testar sua segurança. A caracterização 
como procedimento de risco vem do fato de, muitas vezes, um vírus ser utilizado 
como vetor, além do próprio produto do gene, a proteína, poder ser entendido pelo 
organismo como um elemento estranho a ser combatido. Nesse contexto, muitos 
testes clínicos não obtiveram resultados satisfatórios, seja porque não foi possível 
detectar a proteína resultante do gene inserido ou porque a terapia não resultou nos 
efeitos esperados. Além disso, reações imunitárias desencadeadas pelo vetor, pelo 
DNA inserido ou pela proteína expressa são um grande problema e, para contorná-
lo, os pesquisadores podem fazer uso de imunossupressores, para que a reação 
inicial seja interrompida e a terapia tenha tempo de agir sobre o organismo. Outra 
ameaça é que o vírus pode realizar inserções mutagênicas, levando ao 
desenvolvimento de leucemias, como ocorreu em testes clínicos em pacientes com 
SCID-X1 e granulomatose crônica. 
Questões 6: 
A pedido de um laboratório de análises clínicas você desenvolveu um PCR para 
identificar se um indivíduo é portador são de uma doença genética. Para tal você 
amplifica uma região do gene de interesse e em seguida corta o produto do PCR com 
2 enzimas de restrição diferentes. Cada uma reconhece um sítio que só existe nos 
alelos mutantes. Uma única mutação é suficiente para eliminar a função do produto 
gênico. O esquema abaixo mostra as várias possibilidades dos resultados. Explique-
o detalhadamente. 
 
Portador são 1: 
Este indivíduo é heterozigoto: possui um alelo normal (mais acima) e um alelo 
mutado, o qual é clivado pela enzima de restrição em um sítio próximo à extremidade, 
gerando um fragmento bastante leve (inferior) e um bastante pesado (entre o alelo 
normal e o mais leve). 
Portador são 2: 
Este indivíduo é heterozigoto: possui um alelo normal (mais acima) e um alelo 
mutado, o qual é clivado pela enzima de restrição em um sítio próximo ao centro, 
gerando dois fragmentos de peso semelhante (ambos abaixo do alelo normal). 
Afetado 1: 
Este indivíduo é heterozigoto: possui dois alelos mutados diferentes, que são clivados 
pelas duas enzimas de restrição em dois sítios distintos, gerando quatro fragmentos 
de pesos diferentes. 
Afetado 2: 
Este indivíduo é homozigoto: possui dois alelos mutados iguais, que são clivados pela 
mesma enzima de restrição em um mesmo sítio, gerando dois pares de fragmentos, 
cada par com peso semelhante. 
Afetado 3: 
Este indivíduo é homozigoto: possui dois alelos mutados iguais, que são clivados pela 
mesma enzima de restrição em um mesmo sítio, gerando dois pares de fragmentos, 
cada par com peso semelhante. 
Homozigoto normal: 
Este indivíduo é homozigoto: possui dois alelos normais, que não são clivados pela 
enzima de restrição, gerando um fragmento com elevado peso.