Metodologia N - colorimetria

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1.1.1. N-inorgânico e N-orgânico dissolvido (NOD) 
Para a extração das formas N, Amônio (N-NH4+), Nitrato (N-NO3-), Nitrito (NO2- ) e NOD, 4,0 g de amostras frescas devidamente corrigidas pela umidade foram agitadas com 40 mL de solução de K2SO4 0,5 M em tubos de polipropileno com tampa de rosca de 50 mL (tubos Falcon) colocado horizontalmente em um agitador a 180 rpm durante uma hora. Após agitação, o sobrenadante foi filtrado através do filtro quantitativo de papel com fita azul Nalgon® # 3552, previamente lixiviado com 5 mL de solução de K2SO4 0,5 M, a fim de remover eventual contaminação por N-NH4+. (Mulvaney, 1996). Visando evitar transformações químicas ou biológicas adicionais das formas de NOD em solução (Rousk e Jones, 2010), os extratos foram armazenados a -80 °C até a leitura.
A determinação da concentração de NH4+ e NO3- + NO2- foi baseada no pelo princípio colorimétrico sob leitura de absorbância em microplaca de 96 células (Cabrera e Beare, 1993; Mulvaney, 1996; Miranda et al., 2001). Para a determinação de NH4+, pipetou-se 150 μL do extrato das amostras para cada uma das 96 células da microplaca, adicionou juntamente 15 μL da solução complexante (0,6g de ácido etilenodinitrilotetracetico sal sódico (NaEDTA – C10H14N2Na2O8 2H2O) em 10 mL de água deionizada), com posterior homogeneização das soluções com agitação por 15 s. Em seguida, foi adicionado 60 μL da solução de salicilato-nitroprussiato (dissolução de 1,562 g de salicilato de sódio (C7H5NaO3) e 0,0025 g de nitroprussiato de sódio dihidratado (C5FeN6Na2O 2H2O) em 20 mL de água deionizada), assim repetindo o processo de agitação por 15 s para homogeneização. Por fim, foi adicionado 30 μL da solução tampão (dissolução de 0,296 g de hidróxido de sódio (NaOH) e 0,996 g de fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) em uma mistura de 4 mL de água deionizada e 6 mL de hipoclorito de sódio), repetindo o processo de agitação por 15 s. Após esses processos, se aguardou 30 min para o desenvolvimento da coloração verde-azul e realizou-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro automatizado Tecan® modelo Sunrise TM em comprimento de onda de 667 nm. 
Para a determinação de NO3- e NO2- baseado em Miranda et al. (2001), também em microplaca, pipetou-se 100 μL da solução extraída do solo, adicionando-se 100 μL de solução redutora (dissolução de 0,16g de cloreto de vanádio (VCl3) em 20 mL de solução de HCl 1,0 mol K-1), com agitação por 15s em agitador para a homogeneização. Em seguida, adicionou -50 μL da solução de acoplamento (dissolução de 0,02 g de dicloridrato alfa-naftil-etilenodiamina (NEDD – C10H14N2 2HCl) em 20 mL de água deionizada, repetindo agitação por 15s para a homogeneização. Posteriormente adicionou 50 μL da solução de sulfanilamida (dissolução de 0,4 g de sulfanilamida (C6H8N2O2S) em 20 mL de solução ácida de HCl 5 % (v/v), realizando nova agitação por 15 s e após 30 min os extratos na microplaca apresentaram coloração rosa intensa. A leitura de absorbância foi realizada no comprimento de onda de 540 nm no espectrofotômetro automatizado Tecan® modelo Sunrise. 
Para o cálculo dos teores de NH4+ e NO3- + NO2- foi utilizada a seguinte equação: 
Onde, Cc = concentração de N mineral (mg L-1) pelo método colorimétrico; a/b = coeficiente angular/linear da equação gerada a partir da curva padrão; A = absorbância (leitura do equipamento); F = fator de multiplicação da diluição.
Para obter os terrores de NOD, foi determinado os teores de Nitrogênio dissolvido total (NDT), que foi realizado pelo procedimento de oxidação com persulfato, conforme descrito e otimizado por Cabrera e Beare (1993), no qual todo N do extrato é convertido em NO3-. Resumidamente, 5 mL de solução de K2S2O8 0,5 M + NaOH 0,375 M + solução de H3BO3 a 3% foram adicionados a 5,0 mL de extrato, mantendo a proporção 1:1 (v/v), em tubos de vidro de 20 mL, selados firmemente, com tampas de rosca contendo vedações moles de Teflon internas, foram pesados e autoclavados a 120 °C por 30 min. Após o resfriamento, os tubos foram pesados ​​novamente para verificar a necessidade de correção da concentração devido às perdas de água. A determinação da concentração de NDT foi realizada seguindo a metodologia de NO3- descrita acima. Para a representação dos valores, foi somado os teores de NH4+, NO3- e NO2- e chamados de Nitrogênio inorgânico dissolvido (NID) enquanto que NOD foi obtido pela subtração dos teores de NID presentes em NDT.