AnexoB_Dissertação FabioCLAU4

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ANEXO B
ANÁLISE INTEGRATIVA EM MORCEGOS DO GÊNERO MOLOSSUS (CHIROPTERA, MOLOSSIDAE) DE OCORRÊNCIA NO CERRADO E AMAZÔNIA MARANHENSE, BRASIL
1,3S. B. Mendes, 1,3F. H. S. Cardoso, 2,3A. P. M. Olimpio, 1,2,3,4E. C. Fraga,1,2,3,4M.C. Barros
1 Programa de Mestrado em Ciência Animal – CCMA, Centro de Ciências Agrárias – CCA, Universidade Estadual do Maranhão – UEMA, Cidade Universitária Paulo VI, CP 9, São Luís, MA, Brasil.
2 Programa de Mestrado em Biodiversidade, Ambiente e Saúde - PPGBAS, Centro de Estudos Superiores de Caxias – CESC, Universidade Estadual do Maranhão – UEMA, Praça Duque de Caxias, s/n, Morro do Alecrim, CEP 65604-380, Caxias, MA, Brasil
3Laboratório de Genética e Biologia Molecular – GENBIMOL, Universidade Estadual do Maranhão – UEMA, Praça Duque de Caxias, s/n, Morro do Alecrim, CEP 65604-380, Caxias, MA, Brasil
4 Departamento de Quimica e Biologia, Centro de Estudos Superiores de Caxias – CESC, Universidade Estadual do Maranhão – UEMA, Praça Duque de Caxias, s/n, Morro do Alecrim, CEP 65604-380, Caxias, MA, Brasil
e-mail: mbdene@yahoo.com.br
RESUMO
O gênero Molossus pertence à família Molossidae, subfamília Molossinae, encontra-se distribuído apenas na região Neotropical ocorrendo desde o sul dos Estados Unidos até o sul da Argentina. As espécies desse gênero apresentam crânio com crista sagital anterior geralmente desenvolvida, palato raso e não em domo, incisivos superiores triangulares não caniniformes, incisivos 1/1 e pré-molares ½. As espécies do gênero Molossus são morfologicamente parecidas e apresentam um acentuado dimorfismo sexual, sendo os machos maiores que as fêmeas. Assim, essas características dificultam a diagnose dos táxons e o conhecimento das diferenças inter e intraespecíficas. Neste contexto objetivou-se INVESTIGAR, USANDO ANALISE INTEGRATIVA (caracterizar via caracteres morfológicos, craniométricos e genéticos) AS ESPECIES QUE COMPREENDE O GÊNERO MOLOSSUSas espécies Molossus molossus e Molossus rufus de ocorrência em fragmentos de Cerrado e da Amazônia maranhense. Para tanto foram mensuradas as características morfológicas, aferidas 19 medidas craniométricas e usado 578 pares de bases do gene COI. Foram identificados por caracteres morfológicos 49 espécimes de ocorrência apenas no Cerrado como M. rufus, e 176 espécimes identificados como M. molossus encontrados em ambos os biomas Amazônia e Cerrado. A análise integrativa evidenciaDA pela morfologia e a craniometria A ANALISE MORFOLOGICA SOMADA A observação da variação craniométrica pela análise do componente principal (PCA) comprovou a distinção entre as espécies XXX E XXXX. Os resultados para o gene COI revelOUaram que o gênero Molossus é monofilético, no entanto os resultados não foIram suficientes para discriminar AS ESPECIES como unidades taxonômicas independentes. A análise integrativa evidencia pela morfologia e a craniometria uma clara separação das espécies M. molossus e M. rufus, no entanto os dados moleculares não foram suficientes para discriminar as espécies como unidades taxonômicas independentes apontando a existência de um complexo de espécies PARA ESTE GENERO ocorrendo de ocorrência na Amazônia e Cerrado maranhense. QUE Pode ser explicado PELA a não diferenciação molecular neste estudo é a coabitação entre ESSas espécies sugerindo uma hibridização ENTRE M. molossus e M. rufus já que normalmente ocorre em espécies próximas OU QUE A DEFERENCIAÇÃO GENÉTICA NÃO FOI ACOMPANHADA DA DIFERENCIAÇÃO MORFOLÓGICA E CRANIOMETRICA OU PELO FATO DAS ESPÉCIES DO GÊNERO MOLOSSUS APRESENTARAM MORFOTIPOS DE ACORDO COM A DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA E UM ACENTUADO DIMORFISMO SEXUAL 
Palavras-chave: Morcegos, DNA, taxonomia 
INTRODUÇÃO 
	O gênero Molossus descrito por E. Geoffroy,1805 pertence a ordem Chiroptera e família Molossidae. No Brasil a família Molossidae é a segunda mais diversa, excedida apenas pela família Phyllostomidae, compreende oito gêneros (Molossops Peters, 1865, Eumops Miller, 1906, Cynomops Thomas, 1920, Molossus E. Geoffroy,1805, Neoplatymops (Vieira, 1942), Nyctinomops Miller, 1902, Promops Gervais, 1856, Tadarida Rafinesque, 1814) e 29 espécies (NOGUEIRA et al., 2014). 
	O gênero Molossus encontra-se distribuído apenas na região neotropical, (SIMMONS, 2005; EGER, 2007; COSTA et al., 2013) ocorrendo desde o sul dos Estados Unidos até o sul da Argentina (GAGER et al., 2016). Para o território brasileiro são registradas a ocorrência de seis espécies (M. aztecus Saussure, 1860, M. coibensis J. A. Allen, 1904, M. currentium Thomas, 1901 M. Molossus (Pallas, 1766) M. pretiosus Miller, 1902 M. rufus E. Geoffroy, 1805) (REIS et al., 2011; NOGUEIRA et al., 2014). Para o estado do Maranhão, Reis et al. (2013), registra a ocorrência de duas espécies sendo elas: M. rufus e M. molossus. 
	As especies de morcegos desse gênero apresentam orelhas arredondadas e curtas, tragos curtos, focinho obtuso e largo, lábios sem dobra. As asas são estreitas e alongadas, envergadura aproximada de 280mm e peso de 13g, patas curtas e fortes providas de pelos curtos bem visíveis (REIS et al., 2006). Apresentam crânio com crista sagital anterior geralmente desenvolvida, palato raso e não em domo, incisivos superiores triangulares não caniniformes, incisivos 1/1 e pré-molares 1/2 (REIS et al., 2007).
	Muitas espécies de molossideos são bastantes semelhantes, distinguidas por alguns caracteres morfológicos externos que se sobrepõe, como: o tamanho corporal, extensão da orelha, tamanho do trago, rugas nos lábios, fórmula dentarias, medidas de antebraço entre outros, neste sentido, surgem as incertezas taxonômicas, portanto, torna-se fundamental estudos que façam a combinação de caracteres moleculares e morfométricos para que sejam elucidados os problemas taxonômicos ocorrentes dentro grupo, principalmente no que se refere a complexidade de espécies (VIZOTTO e TADDEI, 1973; FREEMAN, 1981; MCCRACKEN et al., 2008). O gênero Molossus é um exemplo típico de complexidade dentro da família Molossidae. Apesar do amplo acordo entre revisões sistemáticas, os limites taxonômicos e nomes dentro do gênero ainda não são esclarecidos. (GAGER et al. 2016). 
	O estado do Maranhão aparece no cenário nacional como uma das áreas de maior diversidade animal, bem como confluência dos biomas Amazônia, Cerrado e Caatinga, e ainda por apresentar formações típicas como a mata de cocais e baixada (MUNIZ, 2006). No entanto, para o gênero Molossus, objeto deste estudo trabalhos moleculares e morfológicos ainda são bastante escassos, diante disso, o presente estudo usa a análise integrativa (caracteriza via morfologia, craniometria e genética) a fim de diferenciar as espécies Molossus molossus e Molossus rufus de ocorrência em fragmentos de Cerrado e da Amazônia maranhense.
MATERIAL E MÉTODOS 
	Os morcegos foram coletados nos municípios maranhenses: Godofredo Viana; Carutapera, Cândido Mendes, Codó, Chapadinha e Caxias, sendo os três primeiros municípios situados no bioma Amazônia e os três últimos no bioma Cerrado (Figura 1). Os municípios, Godofredo Viana; Carutapera e Cândido Mendes, compreendem a porção da Amazônia legal, estão localizados a oeste do território maranhense, onde a vegetação é ombrófila densa e aberta que reflete a transacionalidade do território (BRASIL, 2015). Os Municípios de Caxias, Codó e Chapadinha estão localizados na porção leste maranhense apresenta fisionomia florestal muito úmida, alta e próximos aos cursos de água. A vegetação forma um gradiente de transição para as fisionomias de Cerrado (BRASIL, 2011; BEZERRA et al., 2012).
 Figura 1. Localização das coletas de M. molossus e M. rufus nos domínios fitogeográficos Cerrado (cinza claro) e Amazônia maranhense (cinza escuro) no estado do Maranhão. Fonte: Adaptado de Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde (2005).
 Os morcegos foram capturados em redes de neblina, para tanto usou-se seis redes de diferentes tamanhos (12 m x 3 m, 9 m x 3 m e 6 m x 3 m). A idade dos espécimes foi estimada com base na ossificação das falanges epífises e a condição reprodutivafoi determinada pela palpação das tetas abdômen na fêmea e a posição dos testículos no macho (Brunet e Austad 2004). Foram fotografadas, sacrificadas, codificadas, pesadas e medidas, mantidos conservados até sua chegada ao Laboratório de Genética Biologia Molecular (GENBIMOL) no CESC / UEMA em Caxias, Maranhão, onde amostras de tecido muscular foram extraídas e armazenadas em etanol a 70% para posterior análises. 
	Foi realizada a retirada da estrutura craniana dos espécimes pela abertura bucal com o rebatimento da pele, a limpeza do crânio com o auxílio de larvas e adultos de insetos do gênero Dermetes (Coleoptera, Dermestidae), em um criadouro no GENBIMOL. Após a limpeza foram clareados com água oxigenada a 10%, posteriormente foram levados a estufa a uma temperatura de 30°C para secagem, em seguida, foram codificados e acondicionados individualmente em frascos limpos. Com auxílio de paquímetro manual, foram aferidas 25 medidas craniométricas conforme Vizzoto e Taddei (1973) e Martins (2008): comprimento máximo do crânio (CMC), comprimento cóndiculo basal (CCB), altura da caixa craniana (ALC), arco da caixa craniana (ANC), arco zigomático (AZ), arco pós orbital (APO), arco dos caninos (CC), arco mastoideo (AMT), comprimento palatal (CP), arco maxilar (AMX), altura do primeiro molar (M1M1), altura do segundo molar (M2M2), comprimento da fileira dentária da maxila (LHMAX), comprimento da fileira de pré-molares e molares superiores (CHMO), comprimento da mandíbula (CMAN), comprimento da fileira de dentes da mandíbula (CFMAN), comprimento do coronoide (CCO), altura da mandíbula (AMAN), arco entre os côndilos mandibulares (ACM), comprimento basal (Cb), largura da caixa craniana (Lcx), comprimento do canino ao incisivo (CC+Inc), comprimento do nasal ao forâmen (NaFo),distância entre incisivo e o caninos (InCa), e a crista sagital (BcCs). Os dados foram tabulados em planilhas de caracteres eletrônicas e via software PAST versão 2.16 (HAMMER,1999) foi realizada uma análise do componente principal (PCA), onde esta permite propor uma hipótese de diferenciação interespecíficas considerando os padrões multivariados de diversidade craniométricas (QUINN; KEOUGH, 2002).
	O DNA total foi obtido a partir do tecido muscular utilizando-se o protocolo Wizard® Genomic DNA Purification Kit-Promega seguindo as orientações do fabricante. O isolamento e à amplificação do gene COI se deu pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando-se primers descritos por Folmer et al. (1994). Em seguida foi realizado o sequenciamento em um sequenciador automático de DNA ABI 3.500 (AppliedBiosystems) seguindo o método de Sanger et al. (1977). Para a identificação e verificação do grau de similaridade, a sequência do marcador molecular COI foi plotada na plataforma bioinformática BOLD Systemsv3 (Barcode of Life Data) (RATNASINGHAM E HEBERT, 2007). Como grupo externo (outgroup), foram usadas as sequências das espécies, Promops centralis (JF449069), Cynomops planirostris (EF080319) Eumops auripendulos (ABGYA890-07) oriundas do Genbank. Para a edição e alinhamento das sequências foi utilizado o programa Bioedit (HALL, 1999). O programa MEGA X (KUMAR et al., 2018) foi usado para obtenção da matriz de distância genética, árvore de Máxima Verossimilhança (MV) e modelo evolutivo Tamura-Nei (TN93+G). A estimativa de significância dos agrupamentos foi verificada pela análise de bootstrap (FELSENSTEIN, 1985). Para verificação do número de haplótipos foi utilizado o programa DnaSP 4.10 (ROZAS; LIBRADO, 2003). 
RESULTADO 
	Foram identificados por caracteres morfológicos um total de 162 espécimes do gênero Molossus de ocorrência nos biomas Cerrado e Amazonia tabela 1.
 Tabela1. Total de espécimes por localidades utilizados nas analises morfológicas
	Especies 
	Localidade
	Bioma
	Total
	M.rufus
	Caxias
	 
Cerrado
	31
	M.molossus
	Caxias
	
	20
	M.molossus
	Chapadinha
	
	2
	M.molossus
	Codó
	
	10
	M.rufus
	Codó
	
	10
	 
 M.molossus 
	Cãndido Mendes
	 
 Amazônia 
	33
	
	Godofredo Viana
	
	9
	
	Carutapera
	
	47
	Total
	2
	2
	162
 	Os espécimes de M. rufus apesentaram crânios robustos e crista sagital desenvolvida, coloração negra e as medidas do antebraço variando de 47,71 a 50,83 mm, bem maiores que os M. molossus que apresentaram variação entre 39 a 42mm, a caixa craniana apresentou-se alongada e a crista sagital pouco desenvolvida, sua pelagem variou de castanho claro a castanho chocolate estas características morfológicas foram descritas por Freeman (1981); Gregorin (2009) (Figura2).
Figura 2. Espécies de Morcegos pertencentes ao gênero Molossus de ocorrência em biomas maranhenses. (A) M. rufus, (B) M. molossus, (C) Crânio de M. rufus evidenciando a crista sagital e (D) Crânio de M. molossus evidenciando a crista sagital. 
Analise das variações craniométricas
	Foram retirados o crânio de 34 M. rufus, 83 M. molossus a observação da variação craniométrica comprovou a distinção entre essas duas espécies da família Molossidae através da análise de componente principal (PCA) evidenciando os padrões multivariados de diversidade craniométrica (Figura 3).
Figura 3. Ordenação craniométrica das espécies M. rufus, e M. molossus evidenciando a clara separação entre estas espécies.
	A análise do componente principal (PCA) usando o modelo de Var Covar (Variance-Coveriance), apresentou uma maior variação craniométrica no comprimento máximo do crânio (CMC) com o valor de PCA igual a 90,9% e a menor variação craniométrica foi na estrutura altura do segundo molar (M2M2) com o valor de PCA igual a 0,15% (Tabela 2). 
Tabela 2. Variação craniométrica usando o modelo Var Covar.
	 Caracteres variação%
	CMC
	90,9
	CCB
	1,33
	ALC
	0,92
	ANC
	0,68
	AZ
	0,59
	APO
	0,52
	CC
	0,49
	AMT
	0,35
	CP
	0,25
	AMX
	0,23
	M1M1
	0,21
	M2M2
	0,15
	LHMAX
	0,17
	CHMO
	0,18
	CMAN
	0,19
	CFMAN
	0,18
	CCO
	0,17
	AMAN
	0,18
	ACM
	0,20
	CB
	0,50
	CC+INC
LCX 
NAFO 
INCA
BCCS
	0,19
0,40
0,60
0,21
0,21
Dados moleculares
	Foram obtidas 116 sequências do gene COI do DNA mitocondrial, com 578 pares de bases correspondendo a 60 haplótipos (PRECISA VERIFICAR ESSES DADOS. NÃO BATE O QUE TEM EM SAMIRA E NO FABIO, NEM O NUMERO DE SEQUENCIA, NEM DE HAPLOTIPOS). Não foi observado compartilhamento de haplótipos entre espécimes de biomas diferentes. A divergência genética intraespecífica para M. rufus foi de apenas 1,0% enquanto que para M. molossus, variou de 1,0% (Amazônia maranhense) a 2,0% (Cerrado maranhense). Para a divergência interespecífica observou-se que entre M. rufus do Cerrado maranhense e M. molossus da Amazônia maranhense e M. molossus do Cerrado maranhense foi de 2,7% (Tabela 2). O mesmo foi observado por Clare et al. (2007) e Borisenko et al. (2008) que relatam que há alta variação intraespecífica dentro de M. molossus (até 1,8% ISSO É ALTA???) e baixa variação interespecífica (menos de 2,2%) com M. rufus que é morfologicamente distinto.
	Essa característica pode estar relacionada ao fato das espécies do gênero Molossus apresentaram morfotipos de acordo com a distribuição geográfica, um acentuado dimorfismo sexual e ontogenética o que torna a diagnose das várias espécies do gênero insatisfatória (LOUREIRO, 2014). CADE O RELATO DA HIBRIDIZAÇÃO QUE FOI CITADO NO RESUMO??? DE ONDE VEIO ESSA HIPOTESE DE HIBRIDIZAÇÃO????
Tabela 2. Matriz de divergência genética para as espécies M. molossus e M. rufus do Cerrado e Amazônia maranhense com base o gene mitocondrial COI. Os valores em negrito na diagonal correspondem aos valores da divergência intraespecífica.
	Espécie/ Localidade
	Divergência (%)
	
	1
	2
	3
	4
	1
	M. rufus/ Cerrado maranhense
	1,0
	
	
	
	2
	M. molossus/ Amazônia maranhense
	2,7
	1,0
	
	
	3
	M. molossus/ Cerrado maranhense
	2,7
	1,5
	2,0
	
	4
	Outgroup
	17,4
	17,1
	17,2
	17,0
	As divergências são refletidas na árvore filogenética onde o gênero Molossus mostrou-semonofilético para as espécies M. molossus e M. rufus agrupando com 100% de bootstrap. No entanto é observado duas linhagens uma formada por os espécimes de M. rufus do bioma Cerrado (85% de bootstrap) e outra formada por M. molossus, no entanto M. molossus do Cerrado não se distingue de M. Molossus do bioma Amazônia (Figura 4). 
	Isto sugere indicativo de que o bioma não é um fator separador/individualizador para a espécie M. molossus. Como consequência as relações dentro do gênero permanecem indefinidas apresentando politomias (GAGER et al. 2016) com clados fracamente suportados (LOUREIRO et al. 2018). Por esse e outros motivos a taxonomia e as relações filogenéticas de Molossus são altamente debatidas como afirma Lindsey; Ammerman (2016).
	
Figura 4. Árvore de Máxima Verossimilhança gerada usando o modelo Tamura-Nei para o gene COI das espécies Molossus molossus e Molossus rufus dos biomas Cerrado e Amazônia maranhense. Os valores nos ramos corresponde aos valores de bootstrap. Os valores apresentados são apenas os que foram maiores que 40% de bootstrap.
	A análise integrativa evidencia pelos padrões morfológicos e craniométricos uma clara separação entre as espécies M. molossus e M. rufus, no entanto os dados moleculares não foram suficientes para discriminar como unidades taxonômicas independentes apontando a existência de um complexo de espécies de ocorrência na Amazônia e Cerrado maranhense. Uns dos fatores que podem explicar a não diferenciação molecular neste estudo é a coabitação entre as espécies sugerindo uma hibridização já que normalmente ocorre em espécies próximas (COYNE; ORR, 2004). Este possível cruzamentos interespecíficos foi encontrado por Coutinho (2007) usando DNA Barcoding onde observou que espécimes L. dekeyseri não se diferenciava geneticamente da espécie Glossophaga soricina.
Os resultados da análise craniométrica indicaram a separação por características cranianas entre as espécies corroborando com Moratelli (2011); Loureiro (2014); Pavan; Marroig (2016).
Agradecimentos: Somos gratos à Fundação Estadual de Tecnologia e Pesquisa Científica do Maranhão (FAPEMA), a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal CCA/UEMA.
REFERENCIAS
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