Aula BIOQUIM 1

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Aula 23/11/2015 Bioquímica 2
ELETROFORESE
-Princípios de eletroforese: movimento de partículas dispersas em um meio sob influência de um campo elétrico uniforme. Técnicas de eletroforese pode ser utilizada para a análise e purificação de moléculas. Técnica analítica, analisando a composição da molécula.
-Técnica utilizada para analisar e separar moléculas, incluindo ácidos nucleicos e proteínas
-Aplicações em:
-Genômica; proteomica; biomarcadores; desenvolvimento de drogas; etc.
Obs.: Configuração: rompimento de ligações; Conformação: não se necessita romper ligações para modificações na estrutura
-Moleculas em um campo elétrico E -> diferentes mobilidades, dependendo de fatores como:
	-Carga elétrica
	-Relacao carga/massa (muito importante)
	-Forma da molécula
	-Temperatura 
	-Porosidade e viscosidade do meio (matriz de eletroforese)
-Esquema simplificado de um aparato de eletroforese
-Separação eletroforetica: basicamente depende do tamanho e carga elétrica das moléculas
-Uma fonte elétrica formará uma corrente, e consequentemente haverá uma diferença de potencial
-Principios da eletroforese:
-v=E*q/f
-Onde:
	-E= campo elétrico
	-q= carga elétrica liquida da molécula
	-f= coeficiente de fricção/atrito
-Mobilidade especifica (mi(u)) de migração de uma dada molécula é definida como:
	-mi(u)=v/E
	-Onde:
	-v= velocidade de migração
	-E campo elétrico
-Voltagem é definida como: 
	-Lei de Ohm-> V=R*i
	-V= Voltagem
	-R= Resistencia elétrica
	-i= Corrente elétrica
- Maior voltagem -> maior i -> maior T, visto que a potência é dada por:
	-W=i^2*R
-Energia dissipada na forma de calor (maior T) pode provocar:
-Maior difusão das moléculas da amostra e dos ions da solução tampão -> desordem entre as moléculas que devem ser separadas
-Formação de corrente convectivas no meio -> mistura entre as moléculas da amostra
-Instabilidade termal das amostras (ex.: desnaturação das proteínas)
-Diminuição da viscosidade da solução tampão -> diminuição da resistência elétrica do meio (aumenta-se a corrente elétrica)
-Problema da eletroforese em meio liquido (PESQUISAR)
-Meio de suporte para a eletroforese
-Inicialmente as técnicas de eletroforese eram realizadas em meio liquido
-Adoção de meios porosos -> solução dos problemas relacionados com a difusão das moléculas da amostra e correntes convectivas do meio
-Mais usados: géis de agarose e poliacrilamida
-Meio de suporte para eletroforese – agarose
-Formado por unidades de agarobiose (moléculas formadas por unidades (ligações glicosidicas) de galactose e anidrogalactose)
-Utilizado com concentrações de 1% a 3%
-Utilizado para a eletroforese de proteínas e ácidos nucleicos
-Bastante utilizada para separacao e purificação de ácidos nucleicos (géis com temperatura baixa de fusão – 65º)
-Quanto maior a concentração menor os poros
-Meio de suporte para eletroforese – gel de poliacrilamida (PAGE)
-Formado por unidade de acrilamida e bis-acrilamida
-Polimerização de moléculas de acrilamida e bis-acrilamida -> formação da matriz eletroforetica
-Catalizacao resultante da acao de radicais livres -> adição de persulfato de amônio e TEMED leva a formação de radicais livres (eletron desemparelhado – muito reativo)
-Quanto maior a concentração menor o poro 
-Eletroforese de acdos nucleicos – DNA
-Dna: usa-se agarose pois seu fragmentos são maiores que os das proteínas (poros maiores)
-Moleculas menores = maior velocidade
-Eletroforese de DNA é realizada com os géis em posição horizontal
-Utilização de marcadores com peso molecular conhecido para identificação das bandas (ex.: DNA de bacteriófagos)
-Utilização de corantes para visualização das bandas (ex.: brometo de etidio = cancerigeno)
-Princípio de uma eletroforese de DNA em gel de agarose: moléculas de DNA são separados com base em seus pesos moleculares pela matriz eletroforetica (a relação carga/massa não é importante pois não varia)
-Azul de bromofenol: indica que a eletroforese pode ser parada
-DNA = carga elétrica negativa uniforme
-v = depende somente do peso molecular (numero de bases)
-Outros exemplos de metodoes de eletroforese de ácidos nucleicos (dna)
	-Eletroforese em gel de campo pulsado
		-Alternancia de dois campos elétricos com direções diferentes 
		-moleculas migram em diferentes direções de acordo com seu peso molecular
		-Permite separacao de moléculas com peso molecular superior aqueles típicos da eletroforese convencional em gel agarose
		-Utilizada para diagnostico de doenças
-Outros exemplos de métodos de eletroforese de ácidos nucleicos RNA
-Geralmente realizada em gel de agarose
-utilizada para checar integridade do RNA (conversação de estrutura secundaria)
-Determinacao de peso molecular RNA e blotting -> utilização de agente desnaturantes (ex.;: formaldeído, glioxal)
-Eletroforese de proteínas
-proteínas-> usado gel de poliacrilamida
-posicao vertical
-metodo geralmente analatico, mas pode ser utilizado para purificar proteínas
-Baseado em propriedades elétricas e peso molecular das proteínas
-Pode ser usado para fins diagnósticos (ex.: analise das poteinas presentes no soro sanguíneo)
-Eletroforese de proteínas – SDS PAGE
-Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio
-utilizada para a analise quantitativa de misturas de porteinas e monitoramento de processos de purificação
-Proteinas são aquecidas na presença de 2-mercaptoetanol -> ocorre desnaturação das proteínas pelo calor e pela redução das pontes dissulfetos promovida pelo mercaptoetanol
-O SDS se liga a proteína para ela não renaturar, há a presença de SDS a cada dois resíduos de aminoácidos (carga negativa), tornando a relação carga massa igual (constante), sendo a proteína apenas separada por peso molecular
-Usa-se o corante azul de Coomasie, ou nitrato de prata (enxergando mais bandas)
-Eletroforese de proteinas – Gel nativo
-Utilizado para detectar proteinas com base em suas atividades biológicas (ex.: enzimas)
-Não ocorre desnaturação
-Separacao de cargas pela carga elétrica nativa (depende do ph do mieo) e peso molecular das proteinas
-enzima pode ser detectada pela incubação com seu respectivo substrato
-Eletroforese de proteinas –geis com gradiente
-SDS PAGE realizada com géis que não tem concentração fixa de poliacrilamida
-ex.: faixa de contração de 5% no inicio e 25% no final
-Permite maior resolução na separacao de proteinas em relação a géis de concentrações uniformes
-Eletroforese de proteinas – Focalizacao isoelétrica
-separacao de acordo com seus pontos isoelétricos (pIs)
-geis horizontais pouco densos com gradiente determinados de pH
-metodo com maior resolução -> proteinas podem ser separadas a artir de diferenças da ordem de 0,01 no gradiente de pH
-utilizada para determinar o pI de proteinas
-particulamente útil para analise de isoenzimas e em aplicações forenses
-Pode-se se diferenciar proteinas com diferença de um aminoácido
-Anfolitos: forma um gradiente de ph
-Eletroforese de proteinas – gel de poliacrilamida 2-D
-metodo combina focalização isoelétrica e SDS PAGE
-separacao por pI e peso molecular, respectivamente
-Analise proteomica
-Alta resolução
-Eletroforese de proteinas Wester blotting
-metodo baseado na transferência de proteinas de um gel de eletroforese para uma membrana de nitrocelulose
-transferencia ocorre por meio de electroblotting
-identificacao da proteinas é realixaa através da utilização de anticorpos primários específicos e de anticorpos secundários conjugados que reconhecem os anticorpos primários
-Metodo altamente sensível que pode detectar muito pequenas de uma dada proteína
-O anticorpo secudnario com alguma enzima, pode liberar uma luz como reacao
-Conceito de um chip para eletroforese
-Passagem de moléculas é percebida por um gerador de sinal.