Sinalização das Vias de Cálcio | Bioquímica Celular Fernando Varotti 21/03/2017

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Bioquímica Celular – Fernando Varotti – 21/03/2017 
Sinalização das Vias Cálcio
Esse cálcio interno pode ser definido como a soma do cálcio presente nas organelas + concentração de cálcio presente no citoplasma. E qual é ordem de grandeza disso tudo? 
A concentração de cálcio no meio externo ela é infinitamente maior do que a concentração de cálcio presente nas organelas, que é muito maior que a concentração de cálcio presente no citoplasma, e eu chamo esses dois componentes de cálcio interno. 
1º situação: O cálcio não está distribuído de maneira homogênea. Há uma diferença muito grande, mas você algumas organelas que armazenam ele no interior da célula. 
O que explica a manutenção desse cálcio em determinadas organelas? Você lembra da maquinaria responsável pela manutenção da diferença de concentração em iônica em um neurônio, ou seja, que chamamos hoje de uma maquinaria bioquímica, uma bomba, funcionando, gastando ATP. É o mesmo sistema. Um sistema vesicular onde você tem uma bicamada tentando manter um íon, ora em uma localização ora em outra. Então além da própria constituição da membrana pra o cálcio que fica dentro você tem bomba de Ca expressa na membrana do reticulo que bombeia pro interior Ca com outro gradiente de concentração. Você no lisossomo uma bomba de Ca que bombeia pra dentro Ca contra um gradiente de concentração. ****Mitocôndria é a única que foge dessa regra, na verdade ela vai ter uma canal e essa canal é formado por quando uma célula entra em apoptose.***
Da mesma maneira, temos também uma bomba de cálcio, jogando Ca pra fora da célula. Então essa maquinaria funcionando mantém essa diferença de concentração de Ca. Todas elas, são chamadas de cálcio ATPase, mas uma recebe um nome especial CERCA. Ela foi a primeira Cálcio ATPase estudada, isolada, entendida, e ela foi isolada de uma musculatura de coelho e a sigla vem do Inglês. A CERCA é uma Cálcio ATPase? Sim, mas é uma Cálcio ATPase de retículo. 
SINALIZAÇÃO
Padrão básico. 
Na membrana você tem um receptor com uma porção voltada pro meio externo, uma porção de domínios transmembranicos, uma porção de (?) do tipo serpentina like, configuração desse jeito é receptor associado a Proteína G., que assume uma forma globular. Numa ancora de (?) você tem. 
Qual tipo de ativação clássico para que isso funcione? Ativação de uma GTPase. Então ela está inativa porque no ciclo catalítico dela você tem uma molécula inteira de Guanosina Triposfato ligada no sítio, como é que esse sistema começa a operar? Seu ligante interagindo com a porção externa do seu receptor, essas interações promovem uma mudança na conformação dele, ao haver a alteração da conformação, essa porção dele assume uma função GAF (Guanosina Astrange Factor), fator de troca de Guanosina, ele auxilia a (?) geral a trocar os seus substratos de Guanosina Di para Guanosina Trifosfato. Ela não é fosforilada o substrato que é trocado. Feito isso, uma vez que você trocou o substrato, você tem um rearranjo dessa enzima para ela acomodar esse novo substrato, ao alterações que surgem, que ocorrem no ciclo catalítico ela se desprende da subunidade alfa e beta. Desprendendo dessas subunidades, o que ele faz? Um das vias que ele consegue reativar é de fosfolipase C, subtipo beta que também está ancorada na membrana plasmática. Uma determinada classe de receptor, associado a um subtipo de proteína g é capaz de interagir com um subtipo fosfolipase que está ancorada na membrana. E o que essa fosfolipase faz? Ela cliva o fosfolipídio. Lembrando que a membrana plasmática é assimétrica, e que assimetria de membrana está ligada a sinalização. O que leva essa simetria? A composição do lado externo é diferente do interno e isso traduz em uma serie de situações, entre elas o fosfolipídio, você vai ter um determinado tipo de fosfolipídio interno que chamamos PIP 2, e você não encontra ele na bicamada externa, um dos motivos disso é: ele é o substrato da fosfolipase c quando ela fica ativada, ela reconhece esse tipo especifico de fosfolipídio. Ao reconhece-lo ela criva ele entre a porção hidrofílica e hidrofóbica do fosfolipideo. A porção hidrofóbica (diacil glisterol) desse fosfolipídio por uma questão de interação de natureza química permanece ancorada a membrana. A porção hidrofílica, uma vez separada do componente hidrofóbico, no meio aquoso ela solubiliza. Não te mais nada impedido, que a deixa aprisionada a membrana, agora a gente a chama de (?) trifosfato. Onde entra o cálcio? Essa parte hidrofílica, se solubiliza muito rápido, ela vai pro reticulo endoplasmático que é praticamente adjacente a membrana plasmática. Inclusive tem pontos de contato entre elas. Por difusão essa parte hidrofílica chega até a membrana do reticulo. O que está acontecendo com reticulo? O cálcio está ali, você tem uma concentração de Ca muito grande no reticulo, muito maior que no citoplasma. ** esse cálcio não está na forma de íon livre, porque esse tipo de cálcio é extremamente tóxico**, então no interior de retículo eu tenho uma série de proteínas que a célula expressa que funciona como tampões, elas tem sítio de interação para cálcio, uma interação fraca, pq esse Ca é usado em processos de sinalização, ele precisa desligar e ligar com facilidade. Esssas regiões nessas proteínas, que fazem interação com cálcio, elas tem um tipo, o que chamamos de F hand, forma uma espécie de vinco onde o íon cálcio consegue se ligar. Ele viaja e chega até a membrana do retículo, além da CERCA, além da Cálcio ATPase ele expressa um receptor do tipo canal, sensível e IP3. Ip3 é o ligante desse receptor no interior da célula. Por isso que ele é chamado de segundo mensageiro. Uma vez que esse IP3 se liga ao receptor de IP3, que é uma canal, esse receptor se abre. Esse canal é seletivo a cálcio, por diferença de concentração cálcio passa a fazer parte do citoplasma. Há um aumento de Ca citoplasmático, uma das respostas da célula a essa aumento é ativação de um proteína Knase do tipo C, dependente de Ca, ela tem sítio de interação a Ca, então quando ele se liga a essa proteína ela começa a expor seu sítio catalítico, o que uma knase faz? Transfere fosforo de ATP para regiões residuais de (?) em diferentes tipos de proteínas. O que essa (?) faz? Começa a funcionar, mas ela migra pra membrana formando um complexo de diacil glicerol, PKc cálcio, esse complexo formado fosforila uma série de proteínas que são os famigerados fatores de transcrição. Fator de transcrição fosforilado entra no núcleo. Gtpase de clivagem lenta (subunidade alfa). ***1º exemplo de sinalização de Ca*** 
****2º exemplo****
Usando a mesma sequência. O mesmo cálcio que interagiu com a Pkc, vai interagir com outro sistema da cél, também no citoplasma chamado de cálcio calmodulina, que é uma proteína se alto fosforila e também fosforila outras proteínas na presença de Ca. Então ela tem duas alças, dois sítios de ligação de cálcio. Quando esse complexo de Ca e camodulina ela começa fosforilar outras proteínas, também fator de transcrição que vão chegar. 
*** 1º exemplo: esse cálcio estava vindo do meio externo para o interno. ***
***2º exemplo: esse cálcio está sendo mobilizado é de estoque interno. ***
****3º exemplo****
- Modelo hormonal 
- 2º tipo de receptor: rpk, tenho 2 dímeros que ficam separados, sendo que porção interna tem uma função enzimática, ela é uma knase. Quando ele é ativado? Quando seu ligante consegue fazer com ele se aproxime. A proximação dessas duas knases, leva a uma auto fosforilação desses receptores. A auto fosforilação desses receptores pode promover 2 ações: 
- Ativação Down Spin (pra baixo) 1 
- Porção fosforilada funciona como ancorador de uma serie de outras prot. 
Na situação 1 você tem proteínas nesse citoplasma que passa reconhecer substratos fosforilados e se associam agora a esse receptor. Essa proteína chega e tem essa ação, uma knase que vai fosforilar em PIP 2, convertendo em PIP 3. Essa enzima chama PIP3quinase. Então agora a região da membrana adjacente a esse receptor que foi ativado por um ligante, as duas subunidadesdo interior, funcionaram como fosforilação cruzada entre elas. Nessa caso, ele passa a servir de ancorador, para que comece o processo de sinalização. Uma das proteínas que são ativadas por esse sistema é uma knase, que fosforila pip 2 convertendo em pip3. Pip3 também funciona como ancorador, você tem mais 2 proteínas chama de BTK, fosfolipase C, subtipo gama. Eles se ancoram no PIP3, mudam de conformação quando tão ancorados e essa knase fosforila essa fosfolipase subtipo gama, ela fica ativo ela reconhece o pip2 convertendo o pip em diacil glicerol -> ip3 promovendo o aumento de ca citoplasmático. 
***** os 3 exemplos até agora aumentam a concentração de ca citoplasmátio****
Como que a célula determina o caminho desse aumento de ca citoplasmático? 
· 1980-90 – Japão: Eles começaram pegando moléculas de EGTA, um ácido que tem 4 sítios de ligação a Ca, por afinidade. Ele era bastante conhecido como quelante de cálcio (se você tivesse uma solução de determinada concentração de íon Ca. E você quisesse que esse ca ficasse indisponível nessa solução, bastava você adicionar a ela esse ácido. Ele começa a forma complexos com Ca, tornando esse íon indisponível a solução.). “Se eu pegar uma mol que tem um núcleo de alta afinidade a Ca, e começar a multiplicar essa mol, tentando incorporar uma porção fluorescente, de modo que essa porção assuma uma conformação sem ca, onde ela fica protegida e quando eu adc ca ao sistema, ele se liga a mol de egta essa porção fluorescente passa a ficar exposta. Por que eu faço isso? Que naquela época já domina o uso de laser para determinar situações, então eu tenho uma lanterninha, quando eu jogo isso numa solução sem ca e emito um comprimento de onda especifico para essa porção fluorescente isso não acende, mas quando eu pego essa mesma sol e adc ca e emito esssa luz, ela brilha. Essa ferramenta permite identificar oscilação de Ca., usando florescência. 
· Em 90, eles dizem que essa é uma ferramenta para id ca. Mas seria interessante se de alguma maneira a gente colocasse isso aqui EGTA com essa porção fluorescente dentro da cel, e a cel continuasse funcionado. O EGTA é uma ácido, ele não atravessa, ele tem um problema lipofelicidade. Então eles começaram a testar diferentes caudas a porção, tudo pra mudar a lipofelicidade. Até que eles chegaram a situação extremamente interessante. 
· 1995 – Pegou a mol de egta, porção fluorescente escondida, e colocou uma cauda lipofílica. Aumentou absurdamente a lipofeliciade. Ai ele começou a pegar cel, e os colocou me contato. O que acontecia era o seguinte, ele entrava pq tinha uma alta lipofelicade, mas da mesma maneira que ela atravessa a membrana ela pode sair de novo. Eles começaram a perceber que esse material ficava aprisionada na cel, que quando ele entrava ele perdia essa calda. Você tinha uma maquinaria bioquímica na cel que funcionava pra outras situações que acabava reconhecendo essa porção como potencial substrato e atacava ela. Quando você tirar essa porção que confere lipofelidade. O que acontece? Ele fica no citoplasma, ele não consegue atravessar e ir pra outra organela!! Essa mol não é mais de EGTA, ela tem o nome Fluoroforo. 
- Membrana (meio interno/externo): to com fluoroforo no citoplasma. A cel sem receber o ligante, sem ter ativação de ca ativada. Qual vai ser a concetração de Ca no citoplasma? Baixíssima. Significa que numa determinada quantidade do seu indicador, poucos deles estarão associados ao Cálcio. E nesse caso, o fluorofo. Se eu tenho um equipamento capaz de detectar a fluorescência e vou começar a fazer um gráfico (fluorescência x tempo). Na situação inicial como são poucos indicadores que estão associados ao ca eu tenho nesse momento uma baixa emissão fluorescência. Então o gráfico fica perto da linha. Se por algum momento eu tenho uma elevação de ca no meu sistema ou ele vem do meio externo pra interno. Ou ele sai de organela chegando o citoplasma. O que aconteceu com a minha fluorescência quando o ca entrou ou foi mobilizado o gráfico sobe. No primeiro traz uma maquinaria que tenta compartimentalizar essa Ca de novo, expulsa ele do citoplasma, ora compartimentalizando com uma organela ele de novo ora mandando pro meio extracel. Uma vez que eles identificaram esse padrão de comportamento, “brincando” com diferentes vias de sinalização de Ca. (vide gráfico) Esse movimento ondulatório a gente chama de cinética de ca, produz efeitos diferentes. Um faz a cel dividir, outra cel secretar. A cel codifica a liberação de ca.