Avaliação clivagem

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS 
Curso de Ciências Biológicas – Modalidade Médica 
DISCIPLINA INTERAÇÃO CELULAR I 2020.PLE 
 
 
Nomes da dupla: Glenda Domingos Mascarenhas e Isabela Batista Gonçalves 
Moreira 
 
 
Durante o desenvolvimento normal do embrião de camundongos, um dos dois blastômeros tende a 
contribuir predominantemente para gerar a parte embrionária (massa celular interna) e o outro para a 
parte abembrionária (trofoblasto) do blastocisto. No entanto, uma minoria significativa de embriões 
(20-30%) não mostrou esta correlação. Neste estudo, nós traçamos de forma não invasiva as linhagens 
celulares para determinar se o padrão de desenvolvimento do blastocisto mostra alguma correlação 
com a orientação e ordem das divisões na segunda clivagem que resulta no posicionamento específico 
dos blastômeros no estágio de 4 células. Embora, a orientação e ordem das segundas clivagens não são 
pré-determinadas, na grande maioria (80%) dos embriões o arranjo espacial dos 4 blastômeros é 
consistente com uma das duas segundas clivagens ocorrendo meridionalmente e a outra 
equatorialmente ou obliquamente em relação ao corpo polar. Nestes embriões, um dos blastômeros no 
estágio de 2 células tende a contribuir com a parte embrionária enquanto o outro contribui 
predominantemente com a parte abembrionária do blastocisto. Assim, nestes embriões o resultado da 
primeira clivagem tende se correlacionar com a orientação do eixo embrionário-abembrionário do 
blastocisto. No entanto, a ordem das divisões prediz a polaridade especifica para este eixo somente 
quando o primeiro dos dois blastômeros (estágio de 2 células) se divide meridionalmente. Em contraste 
aos dois grupos acima, nos embriões nos quais ambas divisões da segunda clivagem ocorrem na mesma 
orientação, mediorionalmente ou equatorialmente, nós não observamos nenhuma tendência para os 2 
blastômeros contribuírem para partes específicas do blastocisto. Nós observamos que todos esses 
grupos de embriões desenvolvem a termo com sucesso similar, com a excepção daqueles nos quais 
ambas divisões na segunda clivagem ocorrem equatorialmente, tendo sucesso no desenvolvimento 
comprometido. Nós concluímos que as orientações e ordem das segundas clivagens não são pré-
determinadas; elas correlacionam com o desenvolvimento da padronização do blastocisto; e que a 
maioria, mas não todas, desses padrões de clivagem permitem o sucesso no desenvolvimento de 
maneira similar. 
 
Após a leitura do resumo, a dupla deve: 
 
1. Elaborar um desenho experimental que permitiria analisar as clivagens e traçar a progênie dos 
blastômeros no estágio de 2 células; 
2. Elaborar uma sessão de “Materiais e Métodos” descrevendo os materiais e abordagens 
metodológicas utilizadas; 
3. Descrever uma sessão de “Resultados” onde o aluno deverá montar as seguintes figuras com 
suas respectivas legendas: 
- Figura 1: Descrição de onde ocorre a primeira clivagem. Ela é aleatória ou existe alguma 
assimetria no zigoto que favoreça esta clivagem? 
- Figura 2: Experimento traçando o destino da progênie dos blastômeros após a segunda 
clivagem. 
4. Bibliografia: referências utilizadas ao longo do desenvolvimento do trabalho. 
 
Respostas da avaliação de clivagem 
Elaborar um desenho experimental que permitiria analisar as clivagens e traçar a progênie 
dos blastômeros no estágio de 2 células; 
1. Desenho experimental 
Pergunta: O padrão de desenvolvimento do blastocisto mostra alguma correlação com a 
orientação e ordem das divisões na segunda clivagem que resulte no posicionamento específico 
dos blastômeros no estágio de 4 células? 
Metodologia: Traçar de forma não invasiva as linhagens celulares de camundongo até eles 
atingirem o estágio de blastocisto, onde será observado o eixo embrionário-abembrionário. 
- Coleta de embriões 
- Cultura dos embriões e marcação dos blastômeros no estágio de 2 células 
- Time-lapse video microscopy a diferentes padrões de clivagem 
- Transferência de embriões 
 
 
Elaborar uma sessão de “Materiais e Métodos” descrevendo os materiais e abordagens 
metodológicas utilizadas; 
2. Materiais e métodos 
- Coleta de embriões 
Coleta de embriões de F1 (C57BL/ 6xCBA), uma linhagem de camundongos, em que as fêmeas 
são induzidas a superovular por injeção intraperitoneal de gonadotrofina sérica de éguas prenhas; 
como o PSMG, que capacita as fêmeas a desenvolverem a maturação do folículo ovariano e a 
sua ovulação mesmo fora do período reprodutivo convencional. Após 48-56 horas deste 
processo, é administrado gonadotrofina coriônica humana (hCG), um hormônio que irá 
potencializar o estímulo para a ovulação e então, a fêmea se acasala com machos F1. Zigotos e 
embriões de 2 células podem ser coletados, respectivamente, 23 horas e 45 horas após a injeção 
de hCG em M2 cujo meio é suplementado com BSA; soro bovino. 
 
- Cultura de embriões e marcação dos blastômeros no estágio de 2 células 
Para a marcação dos blastômeros por moléculas DID, estas que quando excitadas emitem um 
espectro de luz na cor vermelha, podem ser introduzidas na zona pelúcida por meio de 
microinjeção. Entre 45,5 e 47 hrs após a administração do hCG, a marcação de vermelho seria 
feita em um blastômero no estágio de 2 células. Posteriormente a rotulagem, haveria o cultivo 
dos embriões utilizando o sistema de cultura de inclinação do embrião (TECS) que consistiria em 
cultivar os embriões de camundongo em meio de cultura com potássio simplex. Seria utilizado 
óleo mineral para cobrir o meio em que seria incubado os embriões em ambiente com 5% de 
CO2 a 37°C, durante 1 hora, sem interrupções. A fim de mimetizar a movimentação do embrião 
ao longo da tuba uterina, nesse experimento, os camundongos seriam cultivados com inclinação 
de até 20° com 1 minuto de espera. Após o cultivo, a técnica de microscopia fluorescente seria 
utilizada em períodos de aproximadamente 30 min, durante 5 horas. 
Após esse procedimento, os embriões seriam novamente cultivados, com uma duração de 4 h, até 
que todos atingissem o estágio de 4 células. Quando chegassem a esse estágio, os embriões 
seriam agrupados com a posição dos blastômeros de 4 células com relação ao segundo corpo 
polar. 
Posteriormente, ocorreria a marcação com corante azul dos blastômeros ainda não corados mais 
distantes do segundo corpo polar. Os embriões marcados então seriam cultivados in vitro com 
suplementação de KSOM, aminoácidos e BSA, sobre parafina em uma atmosfera de 5% de CO2 
a 37, 5°C. Os embriões então seriam cultivados até o estágio de blastocisto e analisados quando 
a proporção da massa celular interna para a blastocele fosse de aproximadamente 1: 2. 
- Time-lapse video microscopy em diferentes padrões de clivagem 
Microscopia de vídeo de lapso de tempo e imagens foram realizadas, desde a coleta dos embriões 
no estágio de zigoto até a formação dos blastocistos. A análise do estágio de zigoto até o estágio 
de duas células seria realizada em um microscópio invertido Zeiss com uma câmera Hamamatsu 
em que as imagens seriam tiradas de 5 a 10 min durante 12 horas e analisadas usando o software 
Kinetics Imaging. Já do estágio de duas células até a formação do blastocisto seria utilizado para 
análise um microscópio confocal de varredura a laser que é ideal para observar a marcação dos 
blastômeros com molécula DID fluorescente e corante azul.Com isso, além da observação nos 
blastocistos do destino das progênies do estágio de 2 células, poderia se observar também se 
haveria alguma correlação do padrão de clivagem nos estágios de 2 células com esses destinos. 
Os embriões seriam colocados no quarto escuro de uma incubadora integrado confocal a 5% de 
CO2 a 37°C em uma ambientação úmida e os lasers correspondentes às cores vermelha e azul 
seriam aplicados às amostras embrionárias para a obtenção das imagens em 3D. A visualização 
dos blastocistos seria por meio de seções ópticasa cada 7µm. 
- Transferência de embriões 
Os blastocistos que se desenvolveram in vitro a partir do estágio de 2 células seriam transferidos 
para o útero dos ratos fêmeas. As amostras contendo esses blastocisto seriam catalogadas de 
acordo com os resultados de padrão de clivagem no estágio de 4 células previamente analisados 
e, então, inseridos no endométrio de fêmeas F1 por meio de uma seringa para que o blastocisto 
se implante e se desenvolva. Posteriormente, seria analisado se o desenvolvimento embrionário 
desses blastocistos havia sido bem-sucedido ou se seria comprometido na gestação. 
 
3. Resultados 
- Figura 1: Descrição de onde ocorre a primeira clivagem. Ela é aleatória ou existe alguma 
assimetria no zigoto que favoreça esta clivagem? 
 
 
 
 
 
Como discutido no artigo Piotrowska, K., & Zernicka-Goetz, M. (2001) a posição de entrada do 
espermatozoide ou cone de fertilização e o segundo corpo polar, podem predizer o plano de 
clivagem inicial do zigoto. O primeiro plano de clivagem do zigoto em mamíferos é, na maioria 
dos casos, meridional em relação ao segundo corpo polar, este estando atrelado ao zigoto devido 
a resquícios da sua própria citocinese. O segundo corpo polar também é conhecido por marcar o 
polo animal, sendo um constituinte extremamente importante durante o período de clivagem. 
Isso se deve, pois mesmo quando a primeira clivagem se inicia mais distante do segundo corpo 
polar, ele tende a se tornar associado ao sulco conforme a citocinese ocorre, tornando-se um 
importante marcador. Além disso, a posição de entrada do espermatozoide ou cone de 
fertilização parecem influenciar na habilidade do fuso mitótico de se orientar em relação a uma 
mudança na forma do óvulo que ocorre durante a fertilização e que está relacionada ao local de 
entrada do espermatozoide. A célula que adquire a posição de entrada do espermatozoide 
durante a primeira clivagem adquire uma vantagem de divisão e tende a se separar antes de sua 
célula-irmã, configurando assim uma assincronia na divisão celular dos blastômeros. 
 
- Figura 2: Experimento traçando o destino da progênie dos blastômeros após a segunda 
clivagem. 
Figura 1: Na imagem apresentada, utilizamos CF para determinar o que seria o cone de fertilização, PB para 
determinar o que seria o segundo corpo polar e ZP a região da zona pelúcida. A linha tracejada representa o plano 
meridional. 
 Bem 
sucedido 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2: É possível observar os destinos dos 2 blastômeros após a segunda clivagem para a formação do blastocisto. 
Assumimos M como plano meridional (risco na vertical) e E como plano equatorial (risco em forma de X). Nesse 
sentido, ME demonstra que o blastômero marcado em verde foi o primeiro a realizar clivagem, pelo plano meridional, 
enquanto o blastômero marcado em rosa (que se dividiu posteriormente) teve sua clivagem pelo plano equatorial. 
Podemos observar a contribuição do blastômero da primeira divisão (verde) para o polo animal. Vale ressaltar que o 
blastômero no estado de quatro células com a cor azul não sofre marcação, sendo sua coloração meramente 
ilustrativa. A região sinalizada em vermelho representa o segundo corpo polar, enquanto a região circular branca 
indica a zona pelúcida. 
De mesmo modo, na divisão EM, o blastômero em verde dividiu-se anteriormente ao rosa, mas agora, pelo plano 
equatorial. A partir dessa orientação não é possível prever qual a contribuição dos blastômeros dentro do blastocisto. 
Na divisão MM, em que ambas são meridionais, também não é possível prever essa contribuição. Em todos os casos 
citados anteriormente, o desenvolvimento pós-transferência embrionária ocorre de maneira bem sucedida. No entanto, 
quando o plano de divisão é do tipo EE, não só não é possível prever qualquer contribuição do blastômero para o 
polaridade específica do eixo embrionário-abembrionário do blastocisto, como também há um comprometimento no 
seu desenvolvimento ao ser implantado no útero dos ratos fêmeas. 
 
O experimento se inicia após a primeira clivagem quando o embrião atinge o estágio de 2 
células, a partir deste estágio ocorre uma assincronia nas divisões dos blastômeros. Geralmente, 
o blastômero que herda o local de entrada do espermatozoide no óvulo passa a se dividir 
antecipadamente em relação ao outro blastômero. Outro fator crucial desta fase é que a partir 
desse estágio, os blastômeros adquirem a capacidade de rotacionar, o que implica em diferentes 
planos de clivagem no decorrer da segunda clivagem. Os blastômeros no estágio de 2 células 
foram marcados por cores diferentes, sendo o primeiro a se dividir pintado de verde e o outro de 
rosa. A segunda clivagem pode resultar em quatro tipos de progênie: a primeira, em que o 
segundo corpo polar encontra-se próximo a todos os quatro blastômeros, indicando que a 
clivagem ocorreu nos dois blastômeros no plano meridional (MM); a segunda, em que o segundo 
corpo polar encontra-se próximo a dois blastômeros e distante dos outros dois restantes, 
indicando que ambos os blastômeros no estágio de 2 células foram clivados no plano equatorial 
ou oblíquo (EE); e os últimos dois tipos de progênie formam uma conformação tetraédrica 
semelhante, devido a proximidade de três blastômeros ao segundo corpo polar e um longínquo, 
indicando que os planos em que os blastômeros no estágio de 2 células foram clivados são 
distintos, sendo um blastômero, no estágio de 2 células, clivado no plano meridional e o outro 
no plano equatorial, podendo o primeiro a se dividir ser clivado no plano equatorial (EM) ou 
clivado no plano meridional (ME). Após o estágio de 4 células ter se consolidado, suas progênies 
foram analisadas até o estágio de blastocisto. 
A primeira análise feita está relacionada ao grupo de blastocistos que se desenvolveram a partir 
de embriões ME, em que uma relação foi estabelecida entre a alocação das progênies dos 
blastômeros de 2 células e a fronteira entre as partes embrionárias e abembrionárias do 
blastocisto. Constatou-se que a maioria dos embriões ME cujo blastômero no estágio de 2 células 
se dividia antecipadamente tinha uma tendência a sua progênie contribuir mais com a parte 
embrionária do blastocisto, ou seja, tornar-se-ia embrioblasto que futuramente daria origem ao 
desenvolvimento do embrião em si; já a progênie do outro blastômero do estágio de 2 células 
contribuiria mais com a parte abembrionária do blastocisto, ou seja, tornar-se-ia trofoblasto que 
futuramente daria origem ao desenvolvimento dos anexos embrionários/ tecidos extra-
embrionários. 
A segunda análise feita está relacionada ao grupo de blastocistos que se desenvolveram a partir 
de embriões EM, em que assim como ocorrido com os embriões ME, houve uma tendência da 
progênie de um dos blastômeros no estágio de 2 células contribuir com uma parte embrionária ou 
abembrionaria do blastocisto mais do que a outra. Contudo, a ordem de divisão, neste caso, não 
se relaciona com a polaridade específica do eixo embrionário-abembrionário, e, então, esta 
polaridade específica para este eixo somente é vista quando o primeiro dos dois blastômeros no 
estágio de 2 células se divide meridionalmente. 
A terceira análise e a quarta estão relacionadas respectivamente ao grupo de blastocistos que se 
desenvolveram a partir de EE e MM, em que não foram constatados nenhuma tendência para a 
alocação das progênies dos blastômeros no estágio de 2 ou 4 células para as partes embrionária 
ou abembrionária do blastocisto, sendo suas alocações consideradas aleatórias. 
Contudo, se os embriões forem transferidos de volta para as fêmeas de ratos para continuarem a 
se desenvolver após o estado de blastocisto através da sua implantação no endométrio desses 
animais, somente os blastocistos desenvolvidos a partir de EE tem seu desenvolvimento 
comprometido, os demais são similarmente bem sucedidos em seu desenvolvimento.4. Bibliografia: referências utilizadas ao longo do desenvolvimento do trabalho. 
1. Piotrowska-Nitsche K, Zernicka-Goetz M. Spatial arrangement of individual 4-cell stage 
blastomeres and the order in which they are generated correlate with blastocyst pattern in the 
mouse embryo. Mech Dev. 2005;122(4):487-500. doi:10.1016/j.mod.2004.11.014 
2. Piotrowska, K., & Zernicka-Goetz, M. (2001). Role for sperm in spatial patterning of the early 
mouse embryo. Nature, 409(6819), 517–521. doi:10.1038/35054069 
3. Piotrowska-Nitsche, K. (2005). Four-cell stage mouse blastomeres have different 
developmental properties. Development, 132(3), 479–490. doi:10.1242/dev.01602 
4. Wang, Q. T., Piotrowska, K., Ciemerych, M. A., Milenkovic, L., Scott, M. P., Davis, R. W., & 
Zernicka-Goetz, M. (2004). A Genome-Wide Study of Gene Activity Reveals Developmental 
Signaling Pathways in the Preimplantation Mouse Embryo. Developmental Cell, 6(1), 133–144. 
doi:10.1016/s1534-5807(03)00404-0 
5. Matsuura, K., Hayashi, N., Kuroda, Y., Takiue, C., Hirata, R., Takenami, M., … Naruse, K. 
(2010). Improved development of mouse and human embryos using a tilting embryo culture 
system. Reproductive BioMedicine Online, 20(3), 358–364. doi:10.1016/j.rbmo.2009.12.002 
6. Attik GN, Gritsch K, Colon P, Grosgogeat B. Confocal time lapse imaging as an efficient 
method for the cytocompatibility evaluation of dental composites. J Vis Exp. 2014;(93):e51949. 
Published 2014 Nov 9. doi:10.3791/51949 
7. SCHOENWOLF, G. C.; BLEYL, S. B.; BRAUER, P. R.; FRANCIS-WEST, P. H. Larsen 
Embriologia Humana. 4 a edição, Editora Elsevier, Rio de Janeiro, 2010. 704p. 
8. CARLSON, B. M. Embriologia Humana e Biologia do Desenvolvimento. Editora 
GuanabaraKoogan, Rio de Janeiro, 1996. 408p.