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Brasília-DF. Processos Fermentativos industriais Elaboração Assuero Faria Garcia Produção Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração Sumário APrESEntAção ................................................................................................................................. 5 orgAnizAção do CAdErno dE EStudoS E PESquiSA .................................................................... 6 introdução.................................................................................................................................... 8 unidAdE i Introdução aos processos fermentatIvos IndustrIaIs ............................................................... 11 CAPítulo 1 processos fermentatIvos e engenharIa de bIoprocessos ........................................... 11 CAPítulo 2 Introdução à mIcrobIologIa .......................................................................................... 12 CAPítulo 3 dIversIdade mIcrobIana .................................................................................................... 16 CAPítulo 4 escolhendo mIcro-organIsmos para utIlIzação IndustrIal ........................................ 22 unidAdE ii genétIca mIcrobIana ...................................................................................................................... 23 CAPítulo 1 genétIca de mIcro-organIsmos ...................................................................................... 23 CAPítulo 2 plasmídeos .......................................................................................................................... 25 CAPítulo 3 mutação ............................................................................................................................. 26 CAPítulo 4 recombInação ................................................................................................................... 29 CAPítulo 5 transformação ................................................................................................................. 31 CAPítulo 6 mecanIsmo de transformação ....................................................................................... 33 CAPítulo 7 transdução ........................................................................................................................ 35 CAPítulo 8 conjugação ..................................................................................................................... 38 unidAdE iii aplIcação da genétIca mIcrobIana em processos fermentatIvos IndustrIaIs ........................ 43 CAPítulo 1 manIpulação genétIca de mIcro-organIsmos ............................................................. 43 CAPítulo 2 preservação dos mIcro-organIsmos ............................................................................ 49 CAPítulo 3 crescImento mIcrobIano ................................................................................................. 50 CAPítulo 4 crescImento mIcrobIano em ambIentes controlados ................................................. 56 PArA (não) FinAlizAr ..................................................................................................................... 63 rEFErênCiAS .................................................................................................................................. 64 5 Apresentação Caro aluno A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se entendem necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade. Caracteriza-se pela atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela interatividade e modernidade de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da Educação a Distância – EaD. Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos conhecimentos a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da área e atuar de forma competente e conscienciosa, como convém ao profissional que busca a formação continuada para vencer os desafios que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo. Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo a facilitar sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na profissional. Utilize-a como instrumento para seu sucesso na carreira. Conselho Editorial 6 organização do Caderno de Estudos e Pesquisa Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em capítulos, de forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos básicos, com questões para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam a tornar sua leitura mais agradável. Ao final, serão indicadas, também, fontes de consulta, para aprofundar os estudos com leituras e pesquisas complementares. A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de Estudos e Pesquisa. Provocação Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor conteudista. Para refletir Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e reflita sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio. É importante que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. As reflexões são o ponto de partida para a construção de suas conclusões. Sugestão de estudo complementar Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo, discussões em fóruns ou encontros presenciais quando for o caso. Praticando Sugestão de atividades, no decorrer das leituras, com o objetivo didático de fortalecer o processo de aprendizagem do aluno. Atenção Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a síntese/conclusão do assunto abordado. 7 Saiba mais Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões sobre o assunto abordado. Sintetizando Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos. Exercício de fixação Atividades que buscam reforçar a assimilação e fixação dos períodos que o autor/ conteudista achar mais relevante em relação a aprendizagem de seu módulo (não há registro de menção). Avaliação Final Questionário com 10 questões objetivas, baseadas nos objetivos do curso, que visam verificar a aprendizagem do curso (há registro de menção). É a única atividade do curso que vale nota, ou seja, é a atividade que o aluno fará para saber se pode ou não receber a certificação. Para (não) finalizar Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem ou estimula ponderações complementares sobre o módulo estudado. 8 introdução O presente Caderno de Estudos e Pesquisa foi elaborado com o objetivo de propiciar conhecimentos na área de Processos Fermentativos Industriais, para que estes conhecimentos sejam a base fundamental para seu progresso na área de Engenharia de Bioprocessos. Muitas vezes, relacionamos os micro-organismos apenas a doenças, acreditando que só trazem malefícios à sociedade e que devíamos exterminá-los. Mas, de fato, na grande maioria, os micro- organismos são benéficos e de extrema importância para a sociedade. Neste Caderno, você irá se deparar com as peculiaridades do mundo microbiano, aprenderá as principais características desses seres microscópicos: como se organizam no ambiente e como nós tiramos proveito deles para conseguir produtos de nosso interesse por meio da manipulação genética. Neste Caderno concentramo-nos mais na parte de princípios da microbiologia, a microbiologia básica, que é a base para o bom desenvolvimento de processos fermentativos industriais. Portanto, aproveite para aprofundar seus conhecimentos no interessantemundo dos micro-organismos para que tenha muito sucesso profissionalmente na área de engenharia de bioprocessos. objetivos » Conhecer os fundamentos da microbiologia e sua relação com os processos fermentativos industriais; » Estudar como os micro-organismos são divididos; » Compreender como os micro-organismos se organizam no ambiente e como se inter-relacionam; » Conhecer o modo de reprodução e crescimento dos micro-organismos, saber identificar as fases de uma curva de crescimento bacteriano; » Estudar os principais métodos de preservação de micro-organismos, assim como a eficiência de cada método; » Conhecer os principais elementos de genética microbiana, como os plasmídeos, e suas aplicações em processos fermentativos industriais; » Diferenciar mutação de recombinação gênica; » Distinguir as três formas de recombinação gênica: transformação, transdução e conjugação; 9 » Entender a importância da manipulação genética de micro-organismos para o processo fermentativo industrial; » Conhecer os diferentes tipos de biorreatores utilizados na indústria; » Ter uma visão geral de um processo biotecnológico industrial. 10 11 unidAdE i introdução AoS ProCESSoS FErmEntAtivoS induStriAiS CAPítulo 1 Processos fermentativos e engenharia de bioprocessos Sintetizando e enriquecendo nossas informações O processo fermentativo industrial é parte integrante da engenharia de bioprocessos que por sua vez é uma especialização incomum de duas grandes áreas a microbiologia industrial e a biotecnologia. De uma forma geral o processo fermentativo industrial está baseado na utilização de micro-organismos para atingir objetivo específico, que permita a criação de novos produtos visando desenvolvimento comercial ou melhoramento do ambiente. O processo fermentativo industrial está envolvido com o desenvolvimento de novos fármacos como: antibióticos, hormônios e esteroides transformados; solventes; ácidos orgânicos; aminoácidos; enzimas; dentre outros que tenham um impacto econômico direto. Os micro-organismos utilizados pela indústria foram isolados da natureza, e em muitos casos, foram modificados por meio de realização de procedimentos clássicos de mutação e seleção. Essa nova era da biotecnologia tem se desenvolvido rapidamente nas últimas décadas, esse crescimento está diretamente relacionado com a modificação dos micro-organismos por meio de técnicas de biologia molecular, como a utilização da tecnologia do DNA recombinante. A utilização desta tecnologia permite manipular a informação genética viabilizando a produção de novos produtos como proteínas, ou mesmo modificando a expressão gênica microbiana. Além disso, a informação genética pode ainda ser transferida entre diferentes grupos de organismos, como bactérias e plantas. A seleção e o uso de micro-organismos em processos fermentativos industriais é uma tarefa complexa que requer um conhecimento sólido em microbiologia assim como na manipulação destes organismos. A seleção e a utilização destes organismos seguem uma sequência lógica, em que o primeiro passo é identificar ou criar um micro-organismo que seja capaz de viabilizar a produção do objeto desejado da forma mais eficiente possível. O segundo passo é o cultivo destes micro-organismos em um ambiente altamente controlado como um fermentador ou em sistemas complexos como solos ou em água de acordo com objetivos específicos. 12 CAPítulo 2 introdução à microbiologia Os organismos são classificados por uma taxonomia hierárquica. Esta classificação é formada por reino (ou domínio), seguido por filo (ou divisão), classe, ordem, família, gênero, espécie e subespécie. Com base nesta taxonomia a filogenia molecular divide todos os organismos vivos em três domínios (figura 1) – bactéria, archaea e eukarya (eucariotos: protistas, fungos, plantas e animais). Até então o lugar do vírus na árvore filogenética é questionável e alvo de grandes controvérsias. Os domínios de bactéria e archaea englobam uma grande diversidade de organismos que diferem quanto a suas fontes de energia, de carbono ou nitrogênio, suas vias metabólicas, os produtos finais de seu metabolismo e quanto sua habilidade de agir sobre determinados compostos organismos naturais. Estes domínios apresentam organismos adaptados aos mais diversos microambientes e clima da face da terra. Os micro-organismos halofílicos se desenvolvem em ambientes altamente salinos, os termofílicos crescem em ambientes com altas temperaturas, como as que ocorrem em rochas vulcânicas, e por fim os barofílicos que vivem sob altas pressões, como as que ocorrem nas profundezas do oceano. Algumas bactérias são simbiontes de plantas e outras vivem como parasitas intracelulares de mamíferos. Essa grande diversidade microbiana proporciona uma imensa reserva de matéria-prima que pode ser utilizada em processos fermentativos industriais. figura 1. representação da árvore filogenética universal. dentro de cada domínio estão representados o organismo chave de cada linhagem. o círculo na base da árvore representa um ancestral comum hipotético comum a todos as células. fonte: <http://www.acercaciencia.com/2013/05/13/clasificacion-de-los-seres-vivos/, retirado em 27/12/2013>. 13 Introdução aos processos fermentatIvos IndustrIaIs │ unIdade I Taxonomia, a ciência da classificação, frequentemente é desvalorizada e subjulgada como uma gloriosa forma de preencher, com cada espécie em uma pasta, como um selo em um determinado lugar em um álbum; porém a taxonomia é uma ciência fundamental e dinâmica, dedicada a explorar as causas dos relacionamentos e similaridades entre os organismos. Classificações são teorias sobre a base da ordem natural, e não um catálogo chato, feito apenas para evitar o caos. Além dos domínios citados acima temos ainda dos fungos. Os fungos são particularmente especializados em colonizar madeira e são responsáveis pela decomposição de plantas por meio da secreção de poderosas enzimas extracelulares capazes de degradar biopolímeros (proteínas, polissacarídeos e lenhina). Eles produzem um grande número de pequenas moléculas orgânicas, tais como os antibióticos. Ao contrário de bactérias, os fungos não são capazes de realizar fixação de nitrogênio ou mesmo fotossíntese (archaea), e também não são capazes de explorar a oxidação de compostos inorgânicos como fonte de energia. Os fungos são capazes apenas de utilizar oxigênio como aceptor eletrônico final em sua respiração. Os fungos são menos versáteis do que as bactérias no que tange a utilização de compostos orgânicos, pois podem utilizar apenas o carbono celular como fonte de carbono. Frequentemente, fungos e bactérias possuem habilidades complementares no papel de degradação de materiais orgânicos complexos. Muitos processos fundamentais na natureza ocorrem graças às interações entre micro-organismos que influenciam a biosfera como um todo, como por exemplo, a associação entre bactérias e fungos, que desempenham um papel indispensável no clico da matéria orgânica. Por meio da decomposição de produtos orgânicos e restos de plantas e animais, eles liberam nutrientes essenciais para o desenvolvimento de todos os organismos vivos. Na camada de 15cm de solo fértil pode haver cerca de duas toneladas de fungos e bactéria por acre de terra. De fato a respiração de bactérias e fungos ultrapassa 90% da produção de dióxido de carbono na biosfera. A tecnologia, por sua vez, tira vantagem das habilidades especiais de cultura mista destes micro-organismos, utilizando-os na indústria de bebidas, alimentícias, derivados de leite, indústria farmacêutica e mais uma infinidade de campos. A palavra microbiologia deriva de três palavras gregas: mikros (pequeno), bios (vida) e logos (ciência), significando, portanto, o estudo da vida microscópica. Apesar dos micro-organismos terem se originado há cerca de quatro bilhões de anos, sendo considerados ancestrais de todas as outras formas de vida, eles só puderamser observados há 300 anos, com a invenção do primeiro microscópio. Anton van Leeuwenhoek, cientista amador e comerciante alemão, foi o primeiro a observar micro- organismos vivos com um modesto microscópio, confeccionado por ele (Figura 2). Entre 1673 e 1723, van Leeuwenhoek enviou mais de 300 cartas a Sociedade Real Inglesa, em que descrevia cuidadosamente os “animálculos” observados, já que ele acreditava se tratar de pequenos animais vivos. A Figura 3 mostra alguns desenhos de bactérias feitas por van Leeuwenhoek em 1683, as letras representam várias formas de bactérias observadas por ele e o tracejado C-D demonstra a mobilidade das bactérias. 14 UNIDADE I │INtroDUção Aos procEssos fErmENtAtIvos INDUstrIAIs figura 2. (a) - anton van leeuwenhoek usando seu microscópio. (b) – réplica do microscópio construído por ele. fonte: tortora (2005). figura 3. esboços de bactérias da cavidade oral humana desenhadas por van leeuwenhoek. fonte: pelczar (2005). A descoberta destes “animálculos” incitou discussões sobre sua origem. Duas teorias eram debatidas. O conceito de geração espontânea, ou abiogênese, existia desde os tempos bíblicos e até a segunda metade do século XIX; muitos cientistas e filósofos acreditavam que algumas formas de vida poderiam aparecer espontaneamente a partir da matéria morta (a vida surgia a partir de objetos inanimados), este processo hipotético foi denominado geração espontânea. A teoria oposta envolvia o conceito de biogênese, cuja ideia central era que os animálculos, descritos por Leeuwenhoek, deram origem a outros animálculos, ou seja, células vivas poderiam surgir somente a partir de células vivas preexistentes. O debate entre as duas vertentes continuou até 1861, quando Louis Pasteur, um químico francês, demonstrou experimentalmente que micro-organismos estavam presentes no ar e podiam 15 Introdução aos processos fermentatIvos IndustrIaIs │ unIdade I contaminar soluções estéreis, embora o próprio ar não os criasse. A partir daí, deu-se início à chamada Idade de Ouro da Microbiologia, de 1857 a 1914. Nesse período foram feitas muitas descobertas, inclusive a associação de muitas doenças com micro-organismos e o papel da imunidade para a prevenção e cura de doenças; os principais cientistas envolvidos nessas descobertas foram Pasteur e Robert Koch. Robert Koch, um médico alemão, foi o primeiro a provar que as bactérias realmente causam doenças, além de estabelecer quatro critérios necessários para relacionar diretamente um micróbio específico a uma doença particular. Esses critérios são hoje conhecidos como postulados de Koch: 1. O mesmo patógeno deve estar presente em todos os casos da doença. 2. O patógeno pode ser isolado do hospedeiro doente e cultivado em cultura pura. 3. A cultura pura dos micro-organismos causará a doença quando inoculado em animal. 4. É possível recuperar o patógeno inoculado do animal infectado e demonstrar que ele é o organismo original. A denominação micróbios é um termo antigo e se refere a qualquer organismo microscópico, como bactérias, protozoários ou fungos, que podem causar doenças ao homem, aos animais ou as plantas com importância na sua vida. Um vídeo rápido e ilustrativo sobre os principais ícones da história da microbiologia: <http://www.youtube.com/watch?v=G-g6KNGCvK4&feature=related> Uma visão mais detalhada dos marcos importantes da história da microbiologia pode ser encontrada em: <http://users.stlcc.edu/kkiser/history.page.html> 16 CAPítulo 3 diversidade microbiana Os micro-organismos são identificados geralmente por dois nomes em latim, o primeiro identifica o gênero do organismo, e é iniciado com letra maiúscula, e o segundo confere a espécie do organismo e não se inicia com letra maiúscula. Ambos os nomes devem ser escritos em itálico ou sublinhados. Os nomes científicos descrevem alguma característica do organismo, homenageiam um pesquisador ou lugar ou identificam os hábitos de uma espécie. Um exemplo é a levedura Saccharomyces cerevisiae, cujo gênero vem de fungo (-myces) que utiliza açúcar (saccharo-) e a espécie de “faz a cerveja” (cerevisia). Principais grupos de micro-organismos Bactérias As bactérias são organismos procarióticos e unicelulares (exceto actinomicetos, que possuem uma organização filamentosa, semelhante à de fungos). As bactérias apresentam diferentes morfologias, conforme pode ser visto na Figura 4. figura 4. principais formas de bactérias. modificado de <http://education.cambridge.org/la/subject/science/cambridge-advanced-sciences/microbiology-and- biotechnology>, acessado em 28/12/2013. 17 Introdução aos processos fermentatIvos IndustrIaIs │ unIdade I As células de várias espécies procarióticas permanecem unidas em grupos ou conjuntos após a divisão celular e, geralmente, esses arranjos são característicos de determinados gêneros, Streptococcus, por exemplo, formam longas cadeias. Bactérias podem apresentar mobilidade (presença de flagelos) e alguns gêneros formam endosporos que são estruturas de resistência. As bactérias se reproduzem por fissão binária. Em condições favoráveis seu crescimento é bem rápido, elas podem se multiplicar a cada 20 minutos, enquanto que para muitas espécies para que a divisão ocorra pode levar de 15 a 20 horas, figura 5. figura 5. fissão binária em E. coli. modificado de <http://education.cambridge.org/la/subject/science/cambridge-advanced-sciences/microbiology-and- biotechnology>, acessado em 28/12/2013 As bactérias são classificadas em Gram-positivas ou Gram-negativas, de acordo com sua resposta à coloração pelo método de Gram. Por este método as bactérias são inicialmente coradas com cristal violeta; depois lavadas com acetona ou álcool, que descora as bactérias Gram-negativas, mas não as Gram-positivas. Após a coloração com um segundo corante, como a safranina, os dois tipos de células podem ser diferenciados microscopicamente; as bactérias Gram-positivas coram-se em roxo, enquanto as Gram-negativas em rosa. Esta coloração diferencial se deve às diferenças na estrutura da parede celular dessas células. A classificação de bactérias como Gram-positivas ou negativas é bastante utilizada e você provavelmente já a ouviu, mas quais as diferenças de composição da parede celular de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas? Qual é o principal componente da parede celular responsável pela coloração diferencial pelo método de Gram? Protozoários São organismos unicelulares eucarióticos, figura 6. A maioria possui apêndices (cílios ou flagelos) que auxiliam sua movimentação na água. Ingerem partículas como alimento e não possuem clorofila e parede celular. Alguns protozoários, as amebas, apresentam uma forma de locomoção denominada movimento ameboide, em que se arrastam sobre superfícies pela emissão de uma porção da célula em determinada direção (um pseudópode) e então o restante da célula irá fluir nesta direção. 18 UNIDADE I │INtroDUção Aos procEssos fErmENtAtIvos INDUstrIAIs Os protozoários se encontram principalmente em ambientes aquáticos; alguns causam doenças no homem e em animais, como a malária, enquanto outros são úteis, como os encontrados no estômago do gado, carneiro e cupim, que auxiliam na digestão de alimentos. figura 6. Ilustração esquemática de vários tipos de protozoários. modificado de <http://education.cambridge.org/la/subject/science/cambridge-advanced-sciences/microbiology-and- biotechnology>, acessado em 28/12/2013. Fungos O reino fungi é formado por uma extraordinária diversidade de organismos. Alguns são invisíveis ao olho nu, outros podem atingir um diâmetro de até 60cm. Morfologicamente, podem ser distinguidos 19 Introdução aos processos fermentatIvos IndustrIaIs │ unIdade I em bolores (ou fungos filamentosos) e leveduras (figura 7). As leveduras são micro-organismos ovais, unicelulares, porém maiores que as bactérias. Independente de suas diferenças morfológicas topos possuem importantes propriedades: » Eles sãoeucariotos; » Eles produzem esporos por meio de reprodução sexuada ou assexuada; » Eles crescem como hifa ou levedura, hifa exibe um crescimento apical; » Eles são heterotróficos e não fazem fotossíntese. A maioria dos fungos são saprófitos ou simbiontes, mas alguns são parasitas do homem, outros animais ou plantas; » Eles absorvem nutrientes por meio da membrana plasmática. Em alguns a ingestão de alimentos se dá por fagocitose. Para partículas com grandes (com alta massa molecular) os fungos secretam várias enzimas extracelulares que degradam estas partículas; » Normalmente eles possuem parede celular rígida rica em polissacarídeos. figura 7. (a) levedura S. cerevisiae. fonte: <http://www.instructables.com/id/Kitchen-laboratory-II%3a-the-co2-trap/> retirado em 20/6/2011; (b) micrografia de um fungo típico, as estruturas esféricas localizadas nas extremidades das hifas aéreas são os esporos; (c) colônias de uma espécie de aspergillus (o micélio confere às colônias um aspecto pulverulento); (d) conidióforo (hifas especializadas) e conídios (esporos assexuais) de Aspergillus fumigatus. o conidióforo tem comprimento aproximado de 300 μm e os conídios têm largura aproximada de 3 μm. fonte: modificado a partir de madigan (2010). Como já mencionado a alimentação dos fungos é obtida por absorção de soluções de matéria orgânica de seu ambiente (solo, água, um animal ou planta hospedeira). Possuem o crescimento favorecido em pH levemente ácido (pH variando entre 5 e 6), por isso é comum encontrá-los em latas de molho de tomate, deixadas abertas por alguns dias. 20 UNIDADE I │INtroDUção Aos procEssos fErmENtAtIvos INDUstrIAIs Os fungos podem se reproduzir de forma sexuada ou assexuada. Os esporos fúngicos, além de serem a forma mais frequente de reprodução, são os principais veículos de disseminação. Os esporos podem ter origem sexuada ou assexuada. Os fungos podem atuar como decompositores primários de matéria orgânica, como madeira, papel ou tecidos. São importantes produtores de fármacos, ácidos orgânicos e enzimas, como o Penicillium chrysogenum, que produz a penicilina. Essa classe de organismos está presente também na produção de alimentos e bebidas, ramo em que se destacam as leveduras, como a Saccharomyces cerevisiae, utilizada principalmente na produção de pão e cerveja. Existem ainda os fungos patogênicos como a Candida albicans responsável pela candidíase e ainda àqueles que são comestíveis como o Lentinula edodes (Shiitake). Algas As algas formam um grupo bastante heterogêneo de organismos eucariotos fotossintéticos. Esses eucariotos podem ser unicelulares e microscópicos ou multicelulares com até vários metros de comprimento. A Figura 8 mostra algumas espécies de algas, ilustrando sua grande variedade de tamanhos e formas. As algas são abundantes em água doce ou salgada, no solo e em associação com plantas, assim podem ser aquáticas ou terrestres. Apresentam reprodução sexuada ou assexuada, podem ser unicelulares ou multicelulares. Industrialmente são muito utilizadas para a produção de espessantes, além de possuírem muitas outras aplicações. figura 8. (a) algas do gênero Chlamydomonas; (b) colônia esférica de alga verde volvox; (c) spirogyra, um gênero de algas verdes (recebeu este nome pelo arranjo helicoidal dos cloroplastos, característico deste gênero); (d) euglena, um gênero de algas unicelulares. fonte: tortora (2005) e pelczar (2005). vírus Mas e os vírus, eles não entram na classificação dos micro-organismos, então como são classificados? Eles são considerados seres vivos? 21 Introdução aos processos fermentatIvos IndustrIaIs │ unIdade I Os vírus não apresentam natureza celular, são muito simples estruturalmente, contêm um núcleo formado por um único tipo de ácido nucleico, DNA ou RNA. Esse núcleo é circundado por uma cápsula proteica; algumas vezes, esse envoltório é revestido por uma camada adicional, uma membrana lipídica denominada envelope. Os vírus apenas são considerados vivos quando se multiplicam dentro das células que infectam, já que eles somente se reproduzem pela utilização da maquinária de outros organismos. Diferentemente das células, os vírus não apresentam atividades metabólicas próprias, assim, não são considerados seres vivos, porque fora de seus hospedeiros ficam inertes. Uma representação esquemática da morfologia de vários vírus é mostrada na Figura 9. figura 9. morfologia de alguns vírus bem conhecidos. simetria icosaédrica: (A) pólio, verruga, adeno, rota; (b) herpes. simetria helicoidal: (c) mosaico do tabaco; (d) influenza; (e) sarampo, caxumba, parainfluenza; (f) raiva. simetria incerta ou complexa: (g) poxvírus; (h) fagos t-pares. fonte: pelczar at al., 1996. Este site apresenta algumas das notícias mais recentes do mundo da microbiologia, além de possuir muitas imagens impressionantes: <http://www.microbeworld. org/> Visite também os sites que possuem imagens de colônias bacterianas, do formato das células e destas após a coloração de Gram: <http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3114-colony-morphology> <http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2859-gram-stain-gram- positivecocci> <http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2860-gram-stain-gram- negativerods> <http://www.biology.ed.ac.uk/research/groups/jdeacon/microbes/shape. htm#Top> 22 CAPítulo 4 Escolhendo micro-organismos para utilização industrial Até poucos anos atrás, a maior fonte de culturas microbianas para utilização em processos fermentativos industriais eram amostras de solos, água, pão estragado e frutas. Culturas de todas as partes do mundo foram estudadas com intuito de fazer a identificação das linhagens existentes e distingui-las entre as características desejadas para fins específicos. O interesse pela busca de novos micro-organismos continua inabalado, pois as espécies identificadas até o momento compõe uma parcela reduzida e ínfima frente à imensidão de espécies que ainda não foram descritas e cultivadas. Graças ao surgimento e desenvolvimento contínuo de novas técnicas moleculares a cada dia novas espécies são identificadas e catalogadas (tabela 1). Com o interesse crescente na grande diversidade microbiana, ecologia microbiana e especialmente em micro-organismos provenientes de fontes extremas, o conhecimento dos microbiologistas sobre estes organismos tem expandido rapidamente possibilitando uma vasta gama de micro-organismos com as mais diversas características desejadas e com um alto potencial para utilização na indústria. tabela 1. estimativa do número total de espécies conhecidas dos diferentes grupos de micro-organismos. Grupo Total de espécies estimadasa Espécies conhecidas Porcentagem de espécies conhecidas frente ao total estimado. Virus 130.000b 5.000 4c Archea ?d < 500 ? Bactéria 40.000b 4.800 12 Fungi 1.500.000 69.000 5 Algae 60.000 40.000 67 a estimativa realizada em meiados de 1990, este número deve ter aumentado cerca de 10 – 50 %. bvalores subestimados, cerca de 1 a 2 ordem de magnitude. cestimatica grosseira. tabela adaptada de d.a. cowan. 2000. microbial genomes – the untapped resource. tibtech 18:14-16. table 1, p. 15. 23 unidAdE iigEnétiCA miCroBiAnA CAPítulo 1 genética de micro-organismos Todas as características dos micro-organismos são controladas pela hereditariedade, como a morfologia, o metabolismo ou a mobilidade. O genótipo se refere ao conjunto completo de genes possuídos pela célula, e o genoma é termo utilizado para se referir a todo o material genético de um organismo; o fenótipo é o conjunto de propriedades manifestadas por uma célula, num dado momento. A molécula de DNA pode ser linear, no caso de eucariotos, ou circular, no caso de procariotos (figura 10), mitocôndria e cloroplasto. O genoma corresponde ao material genético de um organismo. A bactéria E. coli, por exemplo, possui cerca de 4,6 milhões de pares de bases, 1 mm de comprimento, 1000 vezes maior que a célula. Apesar disso,ocupa apenas 10% do volume celular. Então, como esse DNA é estruturado dentro da célula? figura 10. cromossomo procariótico. (a) massa enovelada e os filamentos retorcidos de dna emergindo da célula rompida de e. coli ilustram parte de seu único cromossomo. (b) representação de um cromossomo superespiralado de e. coli. modificado de <http://bio3400.nicerweb.com/locked/media/ch12/12_03-e_coli.jpg>, em 28/12/2013. modificado de <http:// www.nature.com/scitable/content/supercoiled-chromosome-of-e-coli-44517>, acessado em 28/12/2013. 24 UNIDADE II │ GENétIcA MIcrobIANA As bactérias tipicamente possuem um único cromossomo circular constituído de uma única molécula circular de DNA com proteínas associadas. O cromossomo é recurvado e dobrado e está aderido à membrana plasmática em um ou vários pontos. A Figura 11 mostra um mapa genético (uma representação gráfica das distâncias entre os genes, bem como suas posições relativas no cromossomo) do cromossomo da E. coli. As distâncias no mapa são apresentadas em “minutos” de transferência (chamados algumas vezes de centissomos), o cromossomo completo corresponde a 100 minutos. O zero é arbitrariamente definido em thrA-BC, o operon treonina, já que foi demonstrado que estes genes foram os primeiros a serem transferidos por conjugação em E. coli (os operons serão descritos mais adiante). O mapa genético da Figura 11 revela apenas alguns dos milhares de genes do cromossomo de E. coli, indicando também alguns sítios de reconhecimento por enzimas de restrição. figura 11. mapa circular do cromossomo da linhagem K-12 de E. coli. a localização de alguns genes é mostrada no limite externo do mapa, assim como a de alguns operons (as setas indicam a direção da transcrição). fonte: madigan (2010). 25 CAPítulo 2 Plasmídeos Muitas células procarióticas possuem, além do cromossomo, outros elementos genéticos, particularmente, plasmídeos, que se replicam independentemente do cromossomo do hospedeiro. Contrariamente aos vírus, os plasmídeos não apresentam uma forma extracelular, sendo somente encontrados dentro das células na forma de um DNA livre, normalmente circular. Os genes essenciais residem em cromossomos; os plasmídeos possuem genes não essenciais, embora geralmente muito úteis. Em E. coli, mais de 300 plasmídeos diferentes, de origem natural, foram isolados. Um plasmídeo típico corresponde a uma molécula de DNA circular (embora vários plasmídeos lineares sejam conhecidos) de fita dupla, com tamanho inferior a 5% do tamanho cromossomal. A maioria do DNA plasmidial isolado das células encontra-se na forma superenovelada, que corresponde à forma mais compacta do DNA no interior de uma célula. Os genes carreados pelos plasmídeos estão envolvidos principalmente no controle da iniciação da replicação e com a partição dos plasmídeos replicados para as células filhas. Diferentes plasmídeos encontram-se em números distintos; isto é, denominado número de cópias. Alguns plasmídeos são encontrados em apenas uma a três cópias por célula, enquanto outros podem estar presentes em mais de 100 cópias. O número de cópias é controlado por genes plasmidiais e por interações entre o hospedeiro e o plasmídeo. Embora os plasmídeos não possuam genes essenciais às células hospedeiras, eles carreiam genes que exercem profunda influência no fenótipo da célula hospedeira; por exemplo, a capacidade de Rhizobium interagir com as plantas e formar os nódulos radiculares de fixação de nitrogênio requer determinadas atividades plasmidiais. Outros plasmídeos conferem propriedades metabólicas especiais às células bacterianas, como a capacidade de degradar poluentes tóxicos. Entre os grupos de plasmídeos mais estudados e amplamente distribuídos em células, encontram-se os plasmídeos de resistência, geralmente denominados plasmídeos R, que conferem resistência a antibióticos e a vários outros inibidores de crescimento. Se grande parte dos procariotos se reproduz de forma assexuada, como se dá a variabilidade genética nestes organismos? 26 CAPítulo 3 mutação Uma mutação corresponde a qualquer alteração no material genético que seja capaz de ser transmitida aos descendentes. As mutações podem promover alterações (algumas vantajosas, outras prejudiciais) em um organismo. Recebe o nome de mutante uma linhagem de qualquer célula ou vírus que apresenta uma alteração na sequência nucleotídica, diferindo assim, de sua linhagem parental quanto ao seu genótipo, podendo também diferir quanto ao fenótipo; dependendo do tipo de mutação, esse fenótipo alterado é denominado fenótipo mutante. Uma linhagem selvagem é aquela isolada de ambientes naturais; os mutantes podem ser obtidos tanto a partir de linhagens selvagens, quanto a partir de outros mutantes. O genótipo de um organismo é designado por três letras minúsculas, seguidas por uma maiúscula (grafadas em itálico) para indicar um determinado gene. Assim, o gene hisC de E. coli codifica uma proteína denominada HisC, que atua na biossíntese do aminoácido histidina; as mutações nesse gene devem ser designadas com hisC1, hisC2, com os números indicando a ordem de isolamento das linhagens mutantes. Já o fenótipo é designado por uma letra maiúscula, seguida por duas letras minúsculas, com um sinal de (+) ou (-) sobrescrito, indicando a presença ou ausência de determinada característica. Por exemplo, uma linhagem His+ de E. coli sintetiza histidina, enquanto uma linhagem His- é desprovida desta capacidade. Portanto, uma mutação no gene hisC pode levar a um fenótipo His- se eliminar a atividade da proteína HisC. Existem vários tipos de mutações. Alguns tipos consistem em alterações grosseiras, que causam perdas ou adições de grandes segmentos cromossômicos ou ainda inversões ou translocações do material genético. Outros tipos de mutações alteram o número de cromossomos. Um último tipo de mutação menos drástico e mais comum é a mutação gênica ou de ponto, em que ocorrem substituições ou adições ou perda de um ou poucos nucleotídeos no DNA. Assim, as mutações, para um organismo, podem ser úteis, prejudiciais, letais ou silenciosas. O tipo mais comum de mutação, envolvendo um único par de bases, pode ocorrer quando o DNA se replica, o que pode levar a uma substituição de um par de bases; um AT pode ser substituído por um GC, por exemplo. Se a troca ocorrer em um gene que codifica uma proteína, o mRNA transcrito a partir daquele gene transportará uma base incorreta naquela posição, o que pode causar a inserção de um aminoácido incorreto na proteína durante a tradução (pode ser também que a mutação seja silente e que, portanto, não ocorra mudança no aminoácido adicionado, já que o código genético é degenerado). Se a substituição de bases resultar em uma substituição de aminoácidos na proteína sintetizada, esta alteração recebe o nome de mutação missense. Algumas substituições de bases impedem a 27 Genética Microbiana │ UniDaDe ii síntese de uma proteína funcional completa ao criar um códon de parada (antissenso) no meio de uma molécula de mRNA. As inserções e deleções de um ou alguns pares de nucleotídeos no DNA provocam mudanças maiores no DNA, incluindo as mutações de troca de fase de leitura. Esse tipo de mutação frequentemente resulta na completa perda da função gênica, pois pode alterar a fase de leitura da tradução (os agrupamentos de três nucleotídeos reconhecidos como códons pelo tRNA durante a tradução), resultando em uma longa sequência de aminoácidos alterados, e na produção de uma proteína inativa, pois na maioria dos casos um códon antissenso será encontrado, encerrando a tradução. A Figura 12 ilustra o que pode ocorrer no caso da mutação pontual de uma base. Enquanto a Figura 13 mostra o caso de mutações que levaram a inserções ou deleções de bases, levando a uma mudança no quadro de leitura. Observe que a fase normal de leitura é referida como fase zero, enquanto aquela em que houve a deleção de uma base é denominada -1, e aquela em que uma basefoi inserida +1. figura 12. possíveis efeitos de substituições de pares de bases em um gene que codifica uma proteína. fonte: madigan (2010). 28 UNIDADE II │ GENétIcA MIcrobIANA figura 13. alterações na fase de leitura de um mrna, ocasionadas por deleções ou inserções. fonte: modificado a partir de madigan (2010). As mutações podem ser espontâneas ou induzidas. As mutações espontâneas ocorrem geralmente devido a erros ocasionais feitos durante a replicação do DNA, mas podem decorrer da exposição à radiação natural, que promove alterações na estrutura das bases do DNA. Além disso, radicais de oxigênio podem afetar a estrutura do DNA por meio de modificações químicas; por exemplo, radicais de oxigênio podem converter a guanina em 8-hidroxiguanina, o que provoca mutações espontâneas. As mutações induzidas ocorrem pela ação de agentes mutagênicos, estes podem ser físicos, como a radiação ultravioleta e os Raios X, ou químicos, como acridinas, brometo de etídio, ácido nitroso, 2-Aminopurina, entre outros. 29 CAPítulo 4 recombinação As alterações genéticas também podem ser decorrentes de processos de recombinação, ou seja, a troca de genes entre duas moléculas de DNA, para formar novas combinações de genes em um cromossomo. Enquanto as mutações, geralmente, resultam em pequenas alterações genéticas de uma célula, a recombinação genética, normalmente, envolve alterações mais significativas. Genes completos, conjuntos de genes ou grandes segmentos de DNA podem ser transferidos entre cromossomos ou outros elementos genéticos. Assim, as mutações, em conjunto com a recombinação, contribuem para a diversidade genética de uma população, e consequentemente, para a variação evolutiva. A figura 14 mostra um tipo de recombinação genética entre dois fragmentos de DNA (A e B, apresentados como cromossomos para simplificação). Quando estes dois cromossomos se rompem e se unem novamente (num processo denominado crossing over) alguns dos genes transportados por estes cromossomos serão trocados, de forma que cada um agora transporta uma parte dos genes do outro. figura 14. recombinação genética por crossing over entre dois cromossomos relacionados. fonte: tortora (2005). 30 UNIDADE II │ GENétIcA MIcrobIANA Sendo A e B cromossomos de organismos diferentes, como ocorre o contato entre eles para que ocorra esta recombinação? Em eucariotos, a recombinação genética ocorre, geralmente, como parte do ciclo sexual do organismo, a recombinação ocorre na formação das células reprodutivas, de modo que essas células contenham DNA recombinante. Em bactérias, a recombinação genética pode acontecer de diversas formas. Quando os genes são passados de um organismo para seus descendentes, ocorre uma transferência gênica vertical. As bactérias podem passar seus genes não somente para seus descendentes como também para outras bactérias da mesma geração. Esse fenômeno é conhecido como transferência gênica horizontal; esta ocorre de muitas formas, mas todas envolvem uma célula doadora, que fornece uma parte de seu DNA para uma célula receptora. Depois da transferência, parte do DNA do doador geralmente é incorporado ao DNA do receptor; o restante é degradado por enzimas celulares. A célula receptora que incorpora o DNA doador em seu próprio DNA é denominada recombinante. Embora ocorra, a transferência de material genético entre bactérias não é frequente, ocorrendo em cerca de 1% ou menos de toda uma população. A recombinação genética em procariotos ocorre, após a transferência de fragmentos de DNA homólogo de um doador para uma célula receptora (como já mencionado) e isto pode ocorrer por transformação, transdução ou conjugação. 31 CAPítulo 5 transformação A transformação foi o primeiro mecanismo a ser evidenciado como causador de recombinação genética em bactérias. Vamos descrever brevemente a história desta descoberta, pois foi um dos eventos chave da biologia, já que levou aos experimentos que demonstraram que o DNA era o material genético. O experimento inicial sobre a transformação foi realizado em 1928 por Frederick Griffith, na Inglaterra, enquanto realizava pesquisas com Streptococcus pneumoniae, uma bactéria cuja capacidade de invadir nosso corpo se deve, em parte, à presença de uma cápsula polissacarídica. Mutantes desprovidos da cápsula podem ser isolados, sendo incapazes de provocar infecções; tais mutantes são denominados linhagens R, pois suas colônias apresentam aspecto rugoso em meios sólidos, enquanto as linhagens capsuladas originam colônias lisas (em inglês, Smooth) sendo, assim, denominadas linhagens S. Camundongos, ao serem infectados com células da linhagem S, morriam devido a uma intensa infecção pneumocóccica, um ou dois dias após a inoculação (figura 15). Porém, injeções de células R, em grandes quantidades, não provocaram a morte dos animais. Griffith demonstrou que, quando células S mortas pelo calor eram injetadas juntamente com células R vivas, o camundongo desenvolvia uma pneumonia fatal e as bactérias isoladas do animal morto eram do tipo S. Como as células R isoladas nesse experimento sempre apresentavam o tipo de cápsula presente nas células S mortas pelo calor, Griffth concluiu que as células R haviam sido transformadas em S. figura 15. o experimento de griffith, demonstrando a transformação genética. fonte: modificado a partir de: <http://www.copernicusproject.ucr.edu/ssi/highschoolbioresources/dna/griffithexperiment.jpg>, retirado em 28/12/2013. 32 UNIDADE II │ GENétIcA MIcrobIANA Esse fenômeno foi denominado transformação, mas não foi bem compreendido na época. Apenas em 1944, Avery, MacLeod e McCarty desvendaram o mecanismo; por meio de exaustivos testes, demonstraram que era um componente químico das células virulentas, o ácido desoxirribonucleico ou DNA, o responsável pela transformação das células avirulentas em virulentas. Dessa maneira, foi demonstrado não apenas um sistema de recombinação em bactérias, mas também que o DNA era o material genético das mesmas, o que depois foi generalizado para praticamente todos os seres vivos. Posteriormente, em 1953, James Watson e Francis Crick publicaram seu modelo que descrevia a estrutura do DNA, fornecendo uma fundamentação teórica de como o DNA poderia atuar como material genético. Assim, esses três estudos, os bacteriológicos de Griffith, os bioquímicos de Avery e os estruturais de Watson e Crick, solidificaram o conceito de que o DNA era o material genético, abrindo caminho para novas áreas da biologia: a molecular e a genética. 33 CAPítulo 6 mecanismo de transformação Uma célula capaz de captar uma molécula de DNA e ser transformada é referida como competente, sendo esta capacidade determinada geneticamente ou induzida. A competência depende de diferentes fatores, como a existência de receptores específicos para o DNA, fase de crescimento bacteriano (que produz modificações na membrana) e modificações no meio de cultura, que podem propiciar aumento ou diminuição da competência. Atualmente, técnicas como a eletroporação (abertura de poros da membrana por corrente elétrica), ou a utilização de protoplastos (células sem parede) podem aumentar a frequência de transformação, pois em muitos procariotos, se ocorrer, é muito difícil em condições naturais. A transformação natural com alta eficiência é conhecida apenas em alguns gêneros como Bacillus, Acinetobacter e Neisseria. O mecanismo da transformação é descrito na Figura 16. figura 16. o mecanismo de transformação genética em bactérias. fonte: modificado a partir de: <http://biologiacell.blogspot.com/2010/09/celula.html>, retirado em 28/12/2013. Durante esse mecanismo, deve haver a entrada do DNA exógeno na célula receptora (embora ele precise estar em seu estado nativo de dupla hélice, em algumas exceções apenas uma fita de DNA penetra na célula receptora). Depois da captação, ocorre a incorporação do DNA exógeno no cromossomo da célula receptora: o DNA que penetrou na célula receptoravai se parear com a região homóloga do cromossomo da mesma, então ocorre o mecanismo de permutação ou crossing- over e, consequentemente, a formação de organismos recombinantes, carregando um ou mais genes distintos em relação aos da célula receptora, podendo haver modificação em uma ou mais características das células descendentes. 34 UNIDADE II │ GENétIcA MIcrobIANA Além da entrada de DNA cromossômico nas células receptoras por transformação, pode-se também introduzir elementos extracromossômicos como plasmídeos. Com duplicação independente do cromossomo bacteriano, esses plasmídeos podem permanecer nas células receptoras e em seus descendentes, introduzindo novas características genéticas. Também podem possuir genes provenientes de outras espécies bacterianas ou outros organismos, como plantas ou animais, uma bactéria assim transformada poderá produzir novas substâncias. Dessa maneira certos hormônios, como a insulina, e o hormônio de crescimento humano são produzidos hoje por bactérias como a E. coli. Nesse caso, os plasmídeos funcionam como vetores de genes exógenos. Essa tecnologia de Engenharia Genética propiciou grandes avanços biotecnológicos, permitindo a construção de linhagens bacterianas e de outros organismos transformados, que se tornaram verdadeiras fábricas de fármacos e outros produtos. A descoberta de transformação em outros micro-organismos, como fungos filamentosos e leveduras, e a utilização em larga escala do mecanismo na Tecnologia do DNA recombinante fizeram com que este sistema de recombinação fosse de grande importância para estudos genéticos e para a manipulação de bactérias e outros micro-organismos. É interessante notar como características intrínsecas das bactérias, como a presença de plasmídeos e a capacidade de captação destes por transformação, foram utilizadas em biotecnologia para fazer com que as bactérias produzissem compostos de interesse, como a insulina. 35 CAPítulo 7 transdução No processo de transdução, o DNA bacteriano é transferido de uma célula doadora para uma célula receptora dentro de um vírus que infecta bactéria, denominado bacteriófago ou fago. Assim, o vírus serve como veículo para transportar o DNA de uma bactéria para outra. Existem basicamente duas formas de transdução, um exemplo é a generalizada, em que o DNA de qualquer região do genoma do hospedeiro é encapsulado no interior do vírion maduro, substituindo o genoma viral, e a transdução especializada, em que o DNA de uma região específica do cromossomo do hospedeiro encontra-se diretamente integrado no genoma viral, geralmente substituindo um dos genes virais. Na transdução generalizada, o fago injeta seu DNA na célula hospedeira, que replica o DNA do fago rapidamente, enquanto o DNA bacteriano é degradado pelas enzimas do fago. O DNA do fago também direciona a síntese de novas proteínas fágicas pela célula hospedeira. Durante a montagem da progênie do fago dentro da célula hospedeira, pelo menos alguns fragmentos de DNA bacteriano são erroneamente empacotados dentro do revestimento proteico do fago (o DNA de plasmídeos ou de outros vírus que estão dentro da célula podem receber revestimentos de proteína do fago). As partículas de fago resultantes transportam então o DNA bacteriano ao invés do DNA do fago. O vírion resultante é denominado partícula transdutora. Uma vez que as partículas transdutoras são incapazes de promover uma infecção viral (pois não contêm DNA viral), são referidas como defectivas. Já que o bacteriófago transdutor substitui todos ou alguns genes virais pelos genes bacterianos, geralmente não é infeccioso. Vírion é o nome dado à partícula viral quando esta se encontra fora da célula hospedeira. Assim, a célula é lisada, é liberada uma mistura de vírions normais (que contém o genoma viral) e partículas transdutoras. Quando ela infecta uma população de células receptoras, a maioria é infectada pelos vírus normais, mas uma pequena população recebe as partículas transdutoras, que injetam o DNA da bactéria hospedeira anterior. Esse DNA pode sofrer recombinação genética com o DNA da nova célula hospedeira, como na transformação. Nesse tipo de transdução, qualquer gene bacteriano pode ser carregado da célula doadora para a receptora (porém com baixa frequência) e por isso ela é chamada de transdução generalizada. Esse processo é ilustrado na Figura 17. 36 UNIDADE II │ GENétIcA MIcrobIANA figura 17. transdução generalizada. fonte: modificado a partir de: <http://3.bp.blogspot.com/_g1Y3QnjgYra/tIv8ymmjsfI/aaaaaaaaaKI/jpbQg8hgwya/s1600/ trandu%c3%a7%c3%a3o.jpg>, em 28/12/2013. Em outro tipo de transdução, a especializada, somente certos genes bacterianos são transferidos. O primeiro caso descrito de transdução especializada foi de genes de galactose, transduzidos pelo fago lambda (λ). Esse fago é do tipo lisogênico, ou seja, pode ser incorporado ao cromossomo bacteriano. Nesse caso ele não lisa a célula, mas se multiplica junto com o cromossomo dela , protegendo-a do ataque por fagos relacionados. Entretanto, espontaneamente ou induzido por luz ultravioleta, ele pode sair desse estado, liberando-se do cromossomo bacteriano. O DNA do fago se multiplica e são formadas e liberadas centenas de partículas virais com capa proteica. Uma pequena fração dos fagos liberados, quando saem do cromossomo, carrega consigo parte do cromossomo bacteriano. Como o local de ligação do fago no cromossomo bacteriano é sempre próximo ao gene gal (que codifica as enzimas envolvidas na utilização da galactose), este é o gene que será incorporado ao fago. Raramente outro gene, o da deficiência nutricional para a biotina (um pouco mais distante do que o gal no local de incorporação do fago), é também transferido, Figura 18. 37 Genética Microbiana │ UniDaDe ii figura 18. transdução especializada. (a) eventos líticos normais; (b) produção de partículas transdutoras dos genes de galactose em e. coli, contendo um profago lambda. fonte: madigan (2010). Você se lembra das diferenças entre o ciclo lítico e lisogênico? Quais são elas? Como no caso da transformação, a transdução, além de ser uma forma de recombinação gênica, também pode ter aplicações em biotecnologia. Bacteriófagos e outros vírus podem também ser usados, à semelhança dos plasmídeos, como vetores em Engenharia Genética. 38 CAPítulo 8 Conjugação A conjugação consiste em outro mecanismo pelo qual o material genético pode ser transferido de uma célula para outra, mas diferentemente dos mecanismos apresentados até agora, a conjugação requer o contado entre duas células. A conjugação é mediada por plasmídeos. Os plasmídeos conjugativos utilizam esse mecanismo para transferir cópias de seu DNA para novas células hospedeiras. Assim, o processo de conjugação envolve uma célula doadora, que contém o plasmídeo conjugativo, e uma célula receptora, que não o contém. O primeiro plasmídeo observado a ser transferido entre as células durante a conjugação foi o fator F (fator de fertilidade). Doadores transportando fatores F (células F+) transferem o plasmídeo aos receptores (células F–) que, como resultado, tornam-se células F+. Em algumas células transportando fatores F, o fator se integra ao cromossomo, convertendo a célula F+ em uma célula Hfr (alta frequência de recombinação). Quando a conjugação ocorre entre uma célula Hfr e uma célula F–, o cromossomo da célula Hfr se replica, e um filamento parental do cromossomo é transferido para a célula receptora. A replicação do cromossomo Hfr inicia-se no meio do fator F integrado, e um pequeno fragmento do fator F conduz os genes cromossômicos para a célula F–. Geralmente, o cromossomo rompe-se antes de ser transferido completamente. Dentro da célula receptora, o DNA do doador pode se recombinar com o do receptor (o DNA que não se integrar será degradado), mas continuará uma célula F–, pois não recebeu um fator F completo durante a conjugação. As Figuras 19 e 20 ilustram os processos de conjugaçãoF+ x F– e Hfr x F–, respectivamente. 39 Genética Microbiana │ UniDaDe ii figura 19. sequência de eventos de uma conjugação f+ x f–. fonte: pelczar (2005). 40 UNIDADE II │ GENétIcA MIcrobIANA figura 20. sequência de eventos em uma conjugação hfr x f–. fonte: pelczar (2005). O plasmídeo F é, portanto, um epissomo, um plasmídeo capaz de integrar-se ao cromossomo da célula hospedeira e, quando o plasmídeo encontra-se integrado, genes cromossomais podem ser transferidos. A Figura 21 mostra o mapa genético do plasmídeo F. Os números no interior referem-se ao tamanho do plasmídeo, em pares de quilobases. O sítio oriT corresponde à origem de transferência durante a conjugação. A direção da seta indica a direção da transferência. 41 Genética Microbiana │ UniDaDe ii figura 21. mapa genético do plasmídeo f de E. coli. fonte: madigan (2010). Em termos globais, a presença do plasmídeo F resulta em três alterações distintas das propriedades de uma célula: (1) a capacidade de sintetizar o pilus F, (2) a mobilização do DNA e sua transferência para outra célula, e (3) a alteração dos receptores de superfície, de modo que a célula deixa de atuar como receptora na conjugação, sendo incapaz de captar uma segunda cópia do plasmídeo F ou de plasmídeos geneticamente relacionados. O pilus F, codificado pelo plasmídeo F e plasmídeos relacionados, permite a ocorrência de pareamento específico entre as células doadora e receptora. O pilus estabelece um contato específico com um receptor na célula, sendo então retraído pela despolimerização de suas subunidades. Esse processo aproxima as duas células (figura 22). 42 UNIDADE II │ GENétIcA MIcrobIANA figura 22. micrografia mostrando o pilus sexual conectando duas células que estão sofrendo conjugação. fonte: tortora (2005). A transferência do DNA plasmidial é eficiente e rápida; em condições favoráveis, todas as células receptoras que formam pares com as doadoras adquirem um plasmídeo. A transferência do plasmídeo F, contendo cerca de 100 kb, leva por volta de cinco minutos. Se os genes plasmidiais forem expressos na célula receptora, ela se torna uma célula doadora, podendo transferir o plasmídeo a outras células receptoras. Dessa forma, os plasmídeos conjugativos têm a capacidade de disseminar-se em populações bacterianas, o que possui grande importância ecológica, já que a introdução de um pequeno número de células portadoras de plasmídeos em uma população de células receptoras poderá converter toda a população em células portadoras de plasmídeo em um curto período de tempo. Os vídeos a seguir ilustram os processos descritos acima: <http://www.youtube.com/watch?v=-QeMZQCD22w> <http://www.youtube.com/watch?v=hSbTWaR6Lzk> <http://www.youtube.com/watch?v=XkPDk1lbflY> <http://www.youtube.com/watch?v=O-EdX4MaMFE> <http://www.youtube.com/watch?v=EtxkcSGU698> 43 unidAdE iii APliCAção dA gEnétiCA miCroBiAnA Em ProCESSoS FErmEntAtivoS induStriAiS CAPítulo 1 manipulação genética de micro-organismos A manipulação genética atualmente é muito utilizada para produzir micro-organismos com características novas e desejadas para fins específicos. Uma vez que se tenha uma cultura promissora, uma variedade de técnicas pode ser utilizada para melhoramento da cultura, incluindo mutação induzido por alguma química ou radiação ultravioleta. Um bom exemplo são as primeiras culturas de Penicillium notatum, que pode crescer apenas em condições estáticas, gerando baixas concentrações de penicilina. Em 1943, uma linhagem de Penicillium chrysogenum foi isolada (linhagem NRRL 1951) e posteriormente melhorada por meio de mutações químicas e radiação ultravioleta. Atualmente, grande parte de penicilina é produzida com a linhagem P. chrysogenum, com crescimento em meio aeróbico em fermentadores sob agitação, o que proporciona um rendimento superior de cerca de 60% em relação ao formato de cultivo original de forma estática e com as linhagens selvagens (sem qualquer mutação induzida), figura 23. Descreva o que é mutação sítio dirigida e qual a utilidade desta metodologia nos processos fermentativos industriais. 44 UNIDADE III │ AplIcAção DA gENétIcA mIcrobIANA Em procEssos fErmENtAtIvos INDUstrIAIs figura 23. a realização de mutações torna possível aumentar o rendimento de um processo fermentativo. a representação da “genealogia” de mutações realizadas em Penicillium chrysogenum por meio de raios-X, tratamento com uv e gás mostarda, para aumentar o rendimento na produção de penicilina. modificado de prescott, 2002. Fusão do protoplasma Grande parte destes micro-organismos é assexuada ou se reproduzem por conjugação, o que reduz as chances de mutações aleatórias. Nos estudos genéticos com estes micro-organismos os protoplastos são preparados por meio do crescimento das células em uma solução isotônica, enquanto são tratadas com enzimas como celulase e β-galacturonidase. Os protoplastos são então regenerados usando estabilizadores osmóticos como sucrose. Caso ocorra a formação de híbridos, os micro- 45 AplicAção dA genéticA microbiAnA em processos fermentAtivos industriAis │ unidAde iii organismos recombinantes são identificados por meio de técnicas de plaqueamento seletivo. Após a regeneração da parede celular, o novo produto da fusão do protoplasma pode ser usada para os estudos posteriores. A grande vantagem desta técnica de fusão do protoplasma é a possibilidade de fusioná-lo de diferentes espécies microbianas, mesmo se não forem taxonomicamente próximos. Como exemplo pode-se citar o caso do protoplasma da Penicillium roquefortii que foi fusionado ao da P. chrysogenum. Até mesmo o protoplasma de leveduras e alguns eucariotos podem ser fusionados. inserção de pequenas sequências de dnA Pequenas sequências de DNA sintetizadas quimicamente podem ser inseridas em micro-organismos por meio de mutações dirigidas. Estas técnicas permitem a criação de pequenas alterações genéticas que podem alterar desde um ou mesmo vários aminoácidos em uma determinada proteína de interesse. Tais mutações podem induzir alterações inesperadas nas características proteicas, podendo proporcionar produtos recombinantes com novas propriedades, como enzimas mais resistentes ao microambiente ou mesmo com novas funções catalíticas, ou ainda uma otimização de sua função catalítica. transferência do material genético entre diferentes organismos Novas alternativas têm surgido por meio da transferência de ácidos nucleicos entre diferentes organismos, esta abordagem envolve a transferência de genes para síntese de um produto específico de um organismo em outro. Essa metodologia permite fazer a transferência de genes envolvidos na produção de um determinado antibiótico para outros micro-organismos capazes de produzir outro tipo de antibiótico ou mesmo que não tenha essa habilidade. Por exemplo, os genes que estão envolvidos na síntese do antibiótico bialaphos (um herbicida) foram transferidos da cepa de Streptomyces hygroscopicus para S. lividans. Outros exemplos são a expressão em E. coli, da enzima creatininase de Pseudomonas putida, a produção de pediocina, uma bacteriocina, em um levedura utilizada na fermentação de vinho com intuito de controlar contaminantes bacterianos. A expressão de DNA exógeno em diferentes organismos pode melhorar a eficiência na produção e minimizar alguns passos de purificação necessários até a obtenção do produto final. Por exemplo, baculovirus recombinantes podem replicar em larva de insetos permitindo uma rápida produção em larga escala de proteínas de interesse. Plantas transgênicas podem ser utilizadas na produção de grandes quantidades variedadas de produtos metabólicos. A informação genética pode ser inserida em um determinado micro-organismos graças a tecnologia do DNA recombinante utilizando vetores de clonagem e de expressão heteróloga. Esses vetores podem incluir cromossomos artificiais como os YACs para leveduras, os BACs para bactérias, os cromossomos derivadosdo bacteriófago P1 (PACs) e os cromossomos artificiais para mamíferos os MACs. Os YACs são especialmente valiosos, pois grandes sequencias de DNA (acima de 100 kb) podem ser inseridas e mantidas nestes vetores separadamente do cromossomo do organismo 46 UNIDADE III │ AplIcAção DA gENétIcA mIcrobIANA Em procEssos fErmENtAtIvos INDUstrIAIs hospedeiro. A utilização desta tecnologia viabiliza que determinada informação genética, de um antígeno de um dado vírus, possa ser inserido em linhagens de E. coli, por exemplo, permitindo a expressão da informação genética e posterior síntese do produto gênico que poderá vir a ser utilizado como uma vacina. A transferência da informação genética permite a produção de proteínas e peptídeos específicos com um melhor e alto grau de pureza, assim como em maior quantidade e similares aos produtos obtidos dos organismos de origem. Esta abordagem pode diminuir o tempo e custo da produção do produto de interesse. Outra vantagem da produção destes produtos heterólogos é que em cerca de 90% das vezes estes produtos são biologicamente ativos. Em resumo a utilização de técnicas de clonagem proporciona várias alternativas possíveis para a produção de uma determinada biomolécula, podendo-se utilizar desde micro-organismos até plantas, animais ou suas células como fonte produtora para expressão do DNA recombinante e seus produtos gênicos. figura 24. produção de vacina de forma recombinante. genes que podem codificar produtos gênicos de interesse podem ser expressos em diferentes organismos. utilizando a tecnologia do dna recombinante é possível, por exemplo, produzir uma vacina para uma determinada doença clonando este gene em E. coli e induzindo a expressão do produto gênico para a produção da proteína de interesse. modificado de prescott, 2002. 47 AplicAção dA genéticA microbiAnA em processos fermentAtivos industriAis │ unidAde iii modificação da expressão gênica Além da inserção de genes exógenos em diferentes tipos de organismos, é possível ainda realizar a modificação da regulação gênica alterando diversos fatores como a transcrição gênica, a fusão de proteínas, criando promotores híbridos ou ainda removendo controles de regulação da expressão gênica. Estas técnicas podem melhor e induzir a superprodução de uma grande variedade de produtos gênicos. Esta abordagem de modificação da expressão gênica pode ser utilizada para alterar intencionalmente vias metabólicas pela inativação ou desregulação de genes específicos. Rotas alternativas podem ser utilizadas para adicionar grupos funcionais a uma determinada molécula, por exemplo. Algumas destas vias podem ser mais eficientes que outras. O entendimento destas vias metabólicas torna possível a elaboração de uma via que será mais eficiente evitando vias mais demoradas e ou energeticamente desfavoráveis. Esta abordagem tem sido bastante utilizada para melhorar a produção da penicilina, por exemplo. A capacidade de se conseguir alterar a expressão gênica deu origem a uma nova área conhecida como engenharia do controle metabólico, que viabilizou a manipulação e alteração do controle da síntese de biomoléculas como licopeno, um importante antioxidante, normalmente presente em tomate e seus derivados. Neste caso, um novo controle regulatório foi desenvolvido para controlar a síntese de licopeno para a maquinaria celular de E. coli. Este controle regulatório foi desenvolvido baseado em uma região construída artificialmente que controla duas enzimas chaves na síntese do licopeno, e que podem ser estimuladas pelo excesso de atividade glicolítica e influenciar nos níveis de acetil fosfato, permitindo um aumento considerável na produção de licopeno e ao mesmo tempo reduzindo os impactos negativos do desequilíbrio metabólico. Outra aplicação recente utilizando alteração da expressão gênica foi a produção de variantes do antibiótico eritromicina. Esta alteração pode ser induzida bloqueando passos bioquímicos específicos na via da síntese de um precursor do antibiótico resultando em um produto final modificado, figura 25. Este produto final apresentou pequenas diferenças estruturais, porém com melhora significativa em sua ação antimicrobiana. A utilização desta abordagem possibilita um melhor entendimento da relação estrutura e função destes antibióticos. Além destas possibilidades, a viabilidade de se realizar alteração nas vias metabólicas permite, ainda, a utilização de micro-organismos para a produção de matéria-prima para determinados compostos químicos. Um bom exemplo é a utilização de E. coli na produção de um composto químico, o propanediol, muito utilizado como matéria-prima na fabricação de poliéster e em inúmeros outros produtos. figura 25. alteração da via metabólica para criação de antibióticos modificados. (a) representação dos passos convencionais que ocorrem durante a síntese do antibiótico 6-deoxyerythronolide b (deb), um precursor do antibiótico eritromicina. (b) representação das alterações na estrutura do deb induzidas devido ao silenciamento da enzima enol redutase que atua na quarta etapa da síntese do deb. (c) representação das alterações estruturais que ocorrem quando a enzima que atua no quinto passo é silenciada. estas alterações obtidas pelo silenciamento de algumas enzimas pode proporcionar a produção de antibióticos mais eficientes. 48 UNIDADE III │ AplIcAção DA gENétIcA mIcrobIANA Em procEssos fErmENtAtIvos INDUstrIAIs modificado de Industrial microbiology and biotechnology. Uma revisão dos mecanismos de troca de informação genética e de regulação da expressão gênica pode ser encontrada em: <http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/genetic%20ex.htm> <http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/geneticreg.htm> Uma animação do mecanismo de transformação pode ser vista em: <http://www.dnalc.org/resources/animations/transformation1.html> 49 CAPítulo 2 Preservação dos micro-organismos Em processos fermentativos industriais a utilização de micro-organismos para a produção de um determinado produto torna necessária a obtenção destes de fontes altamente confiáveis, ou seja, de culturas autênticas. Em todo o mundo, há mais de 500 coleções de cultura de linhagens bacterianas e de fungos, normalmente disponíveis por uma pequena taxa. Estas coleções são obtidas na maioria das vezes de microbiologistas que trabalham em universidades e institutos de pesquisa; outras linhagens vêm de indústrias que não as utilizam mais, atualmente a lei exige que quando um processo utiliza um determinado micro-organismos é patenteado, a cultura de micro-organismos deve ser depositada junto a uma coleção reconhecida. Somente no Reino Unido a coleção de cultura nacional tem mais de 27.000 entre bactérias e fungos. A coleção de cultura americana incluem mais de 35.000 linhagens de bactérias, fungos, leveduras, vírus e plasmídeos. Não há um único procedimento adequado e universal para todos os organismos. Ao invés disso há quatro procedimentos básicos que diferem em custo e conveniência. As células microbianas podem ser mantidas por um curto período de tempo em placas com meio agar contendo nutriente adequado, ou estocadas por longos períodos a baixas temperaturas (-80 °C) na presença de um agente criogênico apropriado. Já organismos que produzem esporos, podem ser preservados em suportes na sua forma seca. » O procedimento mais simples é transferir as culturas periodicamente para placas frescas em um meio de cultura apropriado e incubá-las a temperatura adequada para o crescimento. Uma vez que as colônias cresceram, as placas são mantidas em refrigerador a 5 °C, armazenadas em conteiners fechado para evitar a dessecação. Este procedimento é o mais barato e mantém as células viáveis por muitos meses. A desvantagem deste procedimento é que pode haver acúmulo de mutantes e contaminantes nas culturas; » Liofilização é um método particularmente conveniente de preservação. A células microbianas são misturadas ao meio contendo leite em pó(20% m/v) ou sucrose (12% m/v) e congeladas, depois a água é removida por meio de sublimação sob aplicação de um vácuo parcial. Amostras liofilizadas permanecem viáveis por muitos anos e podem ser transportadas sem a necessidade de refrigeração; » As células podem ser estocadas por longos períodos de tempo a temperaturas baixas como a do nitrogênio líquido. Neste procedimento, as células são colocadas em pequenos tubos contendo 10% de glicerol ou 5% de dimetilsulfoxido e então são congeladas lentamente; sua temperatura é diminuída a uma taxa de 1°C a 2°C por minuto até atingir temperaturas da ordem de -80°C e então são estocadas em refrigeradores potentes que chegam a esta temperatura; » Muitas bactérias e fungos em sua forma de esporos podem ser ressecados a temperatura ambiente e preservados em superfícies estéreis como solo, sílica gel ou contas de vidro. Qual a função de aditivos como glicerol ou dimetilsulfóxido no processo de preservação de micro-organismos a temperaturas criogênicas? 50 CAPítulo 3 Crescimento microbiano O estudo do crescimento bacteriano é importante tanto no sentido de se obter estratégias para aumentá-lo, como no caso do crescimento de micro-organismos de interesse, ou como uma forma de controlar este crescimento, no caso de micro-organismos indesejáveis, patogênicos ou deteriorantes. O crescimento bacteriano é considerado o aumento do número de indivíduos e não o aumento das dimensões celulares. A reprodução bacteriana ocorre, geralmente, por fissão binária transversa, um processo de reprodução assexuada, na qual uma célula se divide em duas, após desenvolver uma parede celular transversal, figura 26. figura 26. multiplicação bacteriana por fissão binária transversa. fonte: pearson education, Inc. 2006. <http://biology-pictures.blogspot.com.br/2011/11/binary-fission-in-bacteria.html>, retirado em 26/12/13. 51 AplicAção dA genéticA microbiAnA em processos fermentAtivos industriAis │ unidAde iii Alguns procariotos reproduzem-se assexuadamente por modelos de divisão celular diferentes da fissão binária. Algumas espécies bacterianas, como a Rhodopseudomonas acidophila, reproduzem- se por brotamento, um processo no qual uma pequena protuberância cresce em uma extremidade da célula, formando uma pequena região que inicia um crescimento, um broto, que depois de um período de aumento de tamanho, torna-se uma nova célula e se separa da célula original. Bactérias do gênero Nocardia produzem extenso crescimento filamentoso, reproduzem-se pela fragmentação dos filamentos em pequenas células bacilares ou cocoides, cada uma das quais dá origem a um novo crescimento. As espécies do gênero Streptomyces e outros actinomicetos produzem cadeias de esporos externos (exósporos), chamados conídios, e estes se desenvolvem em novos organismos. Como o oxigênio, essencial para a maioria das formas de vida, pode ser tóxico para bactérias anaeróbicas obrigatórias? O crescimento microbiano é influenciado por fatores físicos (temperatura, pH e pressão osmótica) e químicos (fontes de carbono e nitrogênio, enxofre, fósforo, oxigênio, oligoelementos etc.). temperatura Já que todos os processos de crescimento dependem de reações químicas e estas são influenciadas pela temperatura, o crescimento microbiano pode ser profundamente afetado por este fator. A temperatura irá também determinar, em parte, o ritmo e a quantidade total do crescimento do organismo. Cada espécie de bactérias cresce sob faixas de temperaturas específicas. Os micro-organismos psicrófilos, crescem em baixas temperaturas, sendo capazes de crescer a 0 ºC ou menos, embora sua temperatura ótima seja de 15ºC. Os psicrotrófilos também são capazes de crescer a 0ºC, mas possuem temperatura ótima de crescimento entre 20-30ºC, estes aparecem mais frequentemente que os psicrófilos, e como podem crescer em temperaturas de refrigeradores, são comumente encontrados em alimentos estragados. Os mesófilos crescem em temperaturas moderadas, de 25-40ºC. Enquanto os termófilos crescem em altas temperaturas, de 45-60ºC. Alguns membros do grupo Archae apresentam uma temperatura ótima de crescimento a 80ºC ou superior, são os hipertermófilos ou termófilos extremos, a maioria vive em fontes de água quentes associadas à atividade vulcânica. PH e pressão osmótica O pH ótimo de crescimento, para a maioria das bactérias, está entre 6,5 e 7,5. Algumas bactérias, chamadas acidófilas, apresentam alto grau de tolerância à acidez. Os fungos filamentosos e as leveduras são capazes de crescer em uma variação maior de pH, mas o valor ótimo de pH para fungos é inferior, entre 5 e 6. 52 UNIDADE III │ AplIcAção DA gENétIcA mIcrobIANA Em procEssos fErmENtAtIvos INDUstrIAIs É bastante conhecido o mecanismo do aumento da pressão osmótica para diminuir o crescimento microbiano, como no caso da preservação de alguns alimentos, como peixe salgado e mel, pois quando uma célula microbiana é inserida em um meio hipertônico (concentração de soluto superior àquela do interior da célula) a célula perderá água para o meio, essa perda de água por osmose causará a plasmólise ou diminuição do citoplasma da célula e, consequentemente, haverá inibição do crescimento microbiano, no momento em que a membrana plasmática se separa da parede celular. A maioria dos micro-organismos cresce em um meio que contenha quase que somente água. Entretanto, existem os halofílicos obrigatórios, que necessitam de alta concentração de sal para seu crescimento, como é o caso de organismos que vivem no mar morto e que precisam de aproximadamente 30% de sal para crescerem. Fatores químicos Os elementos essenciais para o crescimento microbiano incluem carbono (essencial para a síntese de todos os compostos orgânicos necessários para a viabilidade celular), nitrogênio, enxofre, fósforo (necessários para a síntese de proteínas, DNA e RNA) e oligoelementos, ou elementos traços, que são pequenas quantidades de elementos minerais, como ferro, cobre, molibdênio e zinco, que geralmente atuam como cofatores, essenciais para a atividade de algumas enzimas. Quanto às exigências atmosféricas, existem os organismos que necessitam de oxigênio para sua sobrevivência; são denominados aeróbicos estritos ou obrigatórios. Aqueles que podem utilizar oxigênio quando este está disponível, mas, na sua ausência, são capazes de continuar seu crescimento por meio da respiração anaeróbica ou da fermentação, são os anaeróbicos facultativos. Os anaeróbicos obrigatórios não utilizam oxigênio para as reações de produção de energia, e, para muitos destes organismos, o oxigênio pode ser um produto danoso. Os anaeróbicos aerotolerantes toleram a presença do oxigênio, mas não podem utilizá-lo para seu crescimento. E os microaerófilos crescem na presença de quantidades pequenas de oxigênio, inferiores àquelas encontradas no ar. Como o oxigênio, essencial para a maioria das formas de vida, pode ser tóxico para bactérias anaeróbicas obrigatórias? tempo de geração Considerando que o método de reprodução mais frequente é a fissão binária, a partir de uma única bactéria, o aumento populacional se faz em progressão geométrica: 21 22 23 24 25 .... 2n, em que n reflete o número de gerações que ocorreram. O tempo necessário para que a célula se divida, ou para que a população duplique, é denominado tempo de geração, que é diferente de acordo com o tipo de bactéria e com as condições de cultivo. Para algumas, como a E. coli, pode ser de 15 a 20 min; para outras pode ser de várias horas. 53 Introdução aos processos fermentatIvos IndustrIaIs │ unIdade I Dessa forma, podemos expressar o crescimento bacteriano pela seguinte equação: b = B x 2n b = número de bactérias ao fim de um dado período de tempo B = número de bactérias inoculadas no meio n = número de gerações São utilizadas escalas logarítmicas para representar graficamente o crescimento microbiano, já que a representação gráfica de populações tão grandes, utilizando numeração
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