AUla 4 1 - pseudomonas aeruginosa, acinetobacter e mycobacterium

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Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter baumannii e 
Mycobacterium tuberculosis.
Introdução
• Bacilos Gram-negativos retos ou ligeiramente curvos 
• Separados fenotipicamente em cinco grupos (I a V)
• Grupo fluorescente: Pseudomonas aeruginosa
• Aeróbio estrito – não fermentadores 
• Mobilidade através de flagelo polar monotríqueo. 
• Produzem pigmentos fluorescentes difusíveis no meio de cultura 
(pioverdina e a piocianina)
• Algumas cepas produzem um pigmento avermelhado (piorrubina) ou 
preto (piomelanina)
Introdução
• Amplamente presentes no solo e água;
• São capazes de sobreviver em ambientes inóspitos como sabão, desinfetantes e 
plásticos (produzem biofilme);
• São resistentes a muitos antibióticos e desinfetantes;
• É considerada um agente de infecção oportunista;
• Não resistem ao ressecamento e baixas temperaturas.
Fatores de virulência
• Flagelo
• Alginato – polissacarídeo capsular que inibe a ligação de anticorpos, a fagocitose e a 
morte intracelular em leucócitos;
• LPS – endotoxina – Síndrome de sepse;
• Fímbrias ou pili – aderência a superfície celular da bactéria aos receptores GM-1 
presentes na superfície das células epiteliais do hospedeiro
• Exoenzima S e Exoenzima U: tóxicas para neutrófilos e macrófagos e inibem a síntese 
proteica
• Exotoxina A: inibem a síntese proteica, destruição tecidual e interrompem a 
atividade celular
• Proteases: (elastase A, elastase B e protease alcalina) – Cliva as Ig e anula a atividade 
dos neutrófilos
• Fosfolipase C: inativa opsoninas
Fatores de virulência
Ligação a membrana célula do hospedeiro – produção de alginato - característica que leva ao aspecto mucoide da 
colônia)
Disponível em: http://www.ibb.unesp.br/Home/Departamentos/MicrobiologiaeImunologia/aula-pseudomonas-biomed2014-modo-de-compatibilidade.pdf
Infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa
• Espécie mais isolada em amostras clínicas
• Prevalece em feridas por queimaduras, transplante de órgãos e drogas intravenosas
• Infecções em locais com umidade – traqueostomias, cateteres de demora, feridas cutâneas
• Exsudação de pus azulado com odor de uvas devido a piocianina
• Infecções em vias urinárias, especialmente se houver sonda;
• Infecções em vias aéreas inferiores – Pneumonia - através do uso de respiradores 
contaminados;
• Otite;
• Conjuntivite (usuários de lentes de contato);
• Multirresistência em UTI.
Infecções de pele
Conjuntivite
Diagnóstico microbiológico
Bacterioscópico: bacilos gram negativos finos e delicados
Cultura
Colônias lactose negativas 
(incolores) em meio 
MacConkey.
Notar pigmentação azulada 
no inóculo original. 
(Piocianina)
Pode haver odor típico de 
frutas
Cultura
Colônias mucóides
Ágar cetrimide: seletivo para Pseudomonas aeruginosa
para o aumento da produção de piocianina por parte da Pseudomonas aeruginosa, mas foi 
modificado com a adição de cetrimida para a inibição selectiva de outros organismos além 
da P.aeruginosa.
Cultura
Ágar sangue: 
São beta hemolíticas 
Provas bioquímicas
▪Teste de oxidase positivo. 
▪Aplicar as colônia em um papel de filtro e adicionar o reativo dimetil-p-fenilenediamina. 
P-fenilenodiamina é oxidado pela enzima adquirindo cor roxa
Pseudomonas (+),
Enterobactérias (-)
Provas bioquímicas
• Catalase positivos;
• Utilização do citrato como fonte de carbono;
• Mobilidade positiva;
• Indol negativo;
• H2S negativo;
• Oxidam glicose;
• Urease +/-
• Lisina negativo
Acinetobacter spp.
• Cocobacilos Gram negativos
• Desempenham papel importante de infecções em pacientes hospitalizados;
• Disseminação rápida atribuída parece ter estreita relação com a 
multirresistência antimicrobiana desenvolvida por esse patógeno.
O gênero Acinetobacter surgiu como patógeno hospitalar oportunista,
sendo que numerosos surtos hospitalares têm sido documentados.
Atualmente, o gênero compreende até 31 espécies, entre elas a
espécie Acinetobacter baumannii, a qual pode se espalhar de forma
epidêmica entre os pacientes hospitalizados e gravemente doentes.
http://www.rbac.org.br/artigos/infeccao-relacionada-assistencia-saude-associada-acinetobacter-baumannii-revisao-de-literatura/
Acinetobacter spp.
• Gênero presente e disseminado em diversos habitats:
• Microbiota da pele e orofaringe de indivíduos saudáveis,
• Vegetais, água, solo e animais; 
• Espécie A. baumannii, segundo alguns autores, não tem um 
habitat natural reconhecido fora do ambiente hospitalar.
Acinetobacter baumannii
• Segundo não fermentador mais encontrado em laboratórios clínicos;
• Apresenta relação direta com ocorrência de surtos nos hospitais, 
sendo capazes de colonizar e infectar indivíduos internados.
• habilidade para formação de biofilme em ambientes inertes 
• resistência aos antibióticos, desinfetantes e antissépticos hospitalares.
• Persistem por longo tempo no ambiente hospitalar
Acinetobacter baumannii
• Patologias ocasionadas:
• Infecções graves do trato urinário, de feridas cirúrgicas, de feridas de pele, 
• sepse,
• meningite pós-neurocirurgia
• pneumonia associada ao uso de ventilação mecânica em pacientes de 
unidades críticas
Acinetobacter baumannii
• Aparecem na forma de cocos ou cocobacilos;
• Crescimento em ágar MacConkey;
• Coloração levemente rosada
• Não fermentador;
• Aeróbio estrito;
• Motilidade negativo (Acineto – incapacidade de movimento);
• Citocromo oxidase - negativo;
• Catalase positiva;
• Identificação definitiva com produção de ácido a partir da glicose em meio 
OF (As bactérias não fermentadoras produzem ácidos fracos incapazes de virar o indicador de ph do meio 
precisando de um meio de cultura especial. )
Acinetobacter baumannii
• Teste de OF de Hugh-Leifson
• Os tubos contém meio O/F (oxidação/fermentação), em cuja composição há o 
indicador de pH azul de bromotimol que, apresenta uma coloração amarelada 
em valores de pH abaixo de 6,0, azulada acima de 7,6 e esverdeada no 
intervalo entre esses valores
• Em um dos tubos, adicionar vaselina líquida para criar uma condição 
anaeróbia
• Incubar a 37°C por 24 hrs
Acinetobacter spp
Mycobacterium tuberculosis
• Mycobacterium tuberculosis ou Bacilos de Koch;
• Bacilos delgados e ligeiramente curvos;
• São imóveis, não esporulados e não capsulados; 
• Aeróbios estritos;
• Faixa de temperatura ótima de crescimento é 35-37°C. 
• São álcool ácido resistentes corando-se de vermelho
• Apresentam parede celular lipídica cérea e espessa 
• Formam agrupamento em ramos alongados e tortuosos, conhecidos 
como cordas - fator corda.
Mycobacterium tuberculosis
• Pertencentes ao complexo Mycobactrium tuberculosis junto com as 
espécies M.bovis, M. africanum e M. ulcerans
• A espécie M. tuberculosis é causa mais comum de doença 
micobacteriana nos seres humanos
• causadora da tuberculose pulmonar 
• É um parasita intracelular facultativo capaz de sobreviver e se 
multiplicar no interior de células fagocitárias 
• Transmitida pelo ar
• É resistente à ação de agentes químicos e sensível à ação de agentes 
físicos como o calor e a radiação ultravioleta mas não ao 
congelamento e à dessecação.
M.bovis: tuberculose bovina
M. ulcerans: lesões de pele nas 
regiões tropicais
M.africanum: forma 
intermediária entre bovis e 
tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
• TUBERCULOSE PULMONAR
• Processo inflamatório lento e progressivo caracterizado por intensa inflamação 
granulomatosa crônica com necrose e caseificação.
• Sinais e sintomas de tosse com eliminação de muco ou sangue, perda de peso, 
febre baixa vespertina, sudorese noturna, dispneia e dor torácica.
• Sua ocorrência aumenta entre pacientes imunocomprometidos que podem 
apresentar a forma rápida - tuberculose miliar de progressão rápida (período 
de semanas)
Mycobacterium tuberculosis
• Tuberculose pulmonar primária e secundária
• Atinge os alvéolos pulmonares e glânglios linfáticos chegando desta forma 
a corrente sanguínea.
• As formas extrapulmonares da tuberculose têm seus sinaise sintomas 
dependentes dos órgãos e/ou sistemas acometidos. 
• Órgãos acometidos: pulmão, rins, ossos, baço e cérebro.
• Através da inoculação o Mycobacterium se instala no parênquima 
pulmonar- foco de Ghon
Mycobacterium tuberculosis
http://materiais.dbio.uevora.pt/Micro/slides/06/06.htmlhttp://www.fisioterapiaparatodos.com/p/doencas-respiracao/sintomas-tuberculose/
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2013.00098/full
Figure 1. Typical architecture of a TB granuloma. (A) Representative granuloma with central necrosis from minipig lung tissue. Histological samples were formalin-
fixed, cut, and stained with hematoxylin-eosin. Adapted from Gil et al. (2010). (B) Schematic of the cellular constituents of a TB granuloma.
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2013.00098/full#B22
Mycobacterium tuberculosis
• Manipulação das amostras biológicas
• Utilização de padrões restritos no controle de segurança
• Manipulação das amostras biológicas e manipulação de culturas puras 
realizadas em fluxo laminar com EPI
• Amostras coletadas das vias respiratórias superiores (escarro e lavado 
broncoalveolar)
• Amostras de urina, fezes, sangue e LCR
• As amostras que contenham microbiota normal devem ser processadas 
rapidamente para diminuir o grau de contaminação
Mycobacterium tuberculosis
• Abordagem laboratorial
• Tratamento das amostras para descontaminação e digestão
• Cultura em caldo
• Caracterização fenotípica das colônias em cultura ágar
• Esfregaços com coloração para álcool-ácido resistentes 
• Provas bioquimicas
• Técnicas moleculares
Mycobacterium tuberculosis
• Preparação da amostras que podem ter microbiota contaminante:
• Utilização de agente descontaminante e mucolítico para liberação das 
Micobactérias (ex. NaOH a 2 e 4% e ácido oxálico)
• Amostras isentas de contaminação por outros microrganismo podem 
ser semeadas diretamente 
• As amostras líquidas (LCR, líquido pleural) devem ser centrifugadas para 
realização de coloração álcool ácido resistente e inoculação em meio de 
cultura.
Mycobacterium tuberculosis
• Coloração álcool ácido resistente. 
• Tipos de coloração :
• Ziehl Neelsen e Kinyoun – utilização de carbolfucsina
• Coloração vermelha
• Auramina O – utilização de fluorocromo
• Coloração amarela brilhante com fundo escuro (permanganato de 
potássio
• O ácido micólico, presente na parede celular liga-se ao corante. 
Coloração de Ziehl-Neelsen
Positivo: bacilos coram em rosa 
forte, outras bactérias e células 
coram em azul. 
ـ
Negativo: não são observados 
bacilos em 300 campos 
examinados 
Mycobacterium tuberculosis A: Coloração com Carbolfucsina
pelo método de Kinyoun
Positivo: Bacilos coram em rosa 
forte, outras bactérias e células 
coram em azul. 
Negativo: não são observados 
bacilos após a observação de 300 
campos
B: Coloração com utilização de 
Auramina-rodamina
Disponível em https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405579416300080
A B
Positivo: bacilos coram em 
amarelo alaranjado em fundo 
escuro. 
Negativo: não há presença de 
bacilos em 100 campos 
observados. 
*Um resultado negativo no exame direto do material clínico não exclui a possibilidade 
de infecção por M. Tuberculosis. A cultura é necessária para confirmação do 
diagnóstico. 
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_6_2004.pdf
Mycobacterium tuberculosis
• Coloração de Ziehl Neelsen
• Cobrir o esfregaço seco e fixado pelo calor com o corante Carbolficsina
• Aquecer a lâmina até a emissão de vapores
• Lavar
• Descorar com álcool ácido
• Contra corar com azul de metileno – 1-2min
• Lavar
• Observar em objetiva de imersão
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis: coloração de Ziehl-Neelsen evidenciando disposição de 
crescimento em cadeias paralelas formando cordões (expressão do fator corda).
Na leitura de todas as baciloscopias devem ser lidos no mínimo 100 campos úteis de 
microscópico.
http://www.jornaldepneumologia.com.br/detalhe_artigo.asp?id=135
Mycobacterium tuberculosis
Iniciar a leitura pelo quadrante superior direito, 
entre os números 12 e 3. Utilizar o
botão micrométrico para verificar a presença 
de BAAR na superfície e em
profundidade.
Mycobacterium tuberculosis
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_6_2004.pdf
Mycobacterium tuberculosis
• Meios de cultura 
• Contém verde de malaquita para inibir o crescimento de 
contaminantes
• À base de ovos
• Lowenstein Jensen
• Petragnami
• À base de ágar
• Middlebrook 7H10 e 7H11
Incubação ótima a 37°C (35 °C)
Com atmosfera de 2% a 11% de CO2
Mycobacterium tuberculosis
• Morfologia das colônias:
• Aspecto seco, rugoso, acamurçado e sem produção de pigmento.
• Período de incubação prolongado (21 dias).
• Microcolônias em 5 a 10 dias em ágar Middlebrook
• Colônias em 14 a 28 dias a 37°C
• Apresenta coloração creme no crescimento em meio Lowenstein-
Jensen
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis inoculadas em 
meio Lowenstein Jensen incubadas com CO2
por 21 dias à 35ºC.
Meio Lowenstein Jensen 
Disponível em https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/Content/hugo/LJMedia.htm
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis inoculadas 
em meio Middlebrook 7H10 incubadas 
com CO2 por 21 dias à 35ºC.
Meio Middlebrook 7H10 
Disponível em https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/Content/hugo/Middlebrook7H10.htm
http://www.ibb.unesp.br/Home/Departamentos/MicrobiologiaeImunologia/aula_myc
obacterium.pdf
Mycobacterium tuberculosis
• Análise bioquímica
• Acúmulo de Niacina no meio (M. tuberculosis +)
• Redução de nitrato a nitrito
• Catalase termoestável negativa a 68°C -
• Urease positiva (hidrolisar a uréia)
M.Tuberculosis - forma bolhas a TA mas não 
à 68°C. 
M. Fortuitum - forma bolhas a T A e à 68°C. 
Positivo: rosa forte ou vermelho 
ƒNegativo: sem mudança de cor. 
Se ficar levemente rosado repetir o teste, se o 
resultado persistir, reportar como negativo. 
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo3/identificacao7.htm
Redução de nitrato:
•O teste é revelado através da 
adição de 3 gotas do reativo de 
Griss A com 3 gotas do reativo de 
Griss B no caldo nitrato.
•O desenvolvimento de uma 
coloração vermelha dentro de 1 a 2 
minutos indica a presença de 
nitrito e, portanto, um teste 
positivo
Mycobacterium tuberculosis
• Detecção e identificação de micobactérias por métodos moleculares
• Utilizados para confirmação de isolados em cultura obtido de amostras 
utilizando sondas de DNA.
• Sondas de ácidos nucleicos: substitui as provas bioquímicas convencionais
• Filamentos simples de DNA marcados que hibridizam com RNA liberado da bactéria 
através da ação de uma agente lítico
• Identificação através da determinação da sequência de DNA
• Detecção direta de M.tuberculosis em amostras com ensaios de amplificação 
de ácido nucléico
• Fingerprinting do DNA e tipagem de cepas de espécies de M. tuberculosis