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Bruno Borges Deminicis Carla Braga Mar tins Tópicos especiais em Ciência Animal III Editora CAUFES 2014 Bruno Borges Deminicis & Carla Braga Mar tins Bruno Borges Deminicis Carla Braga Martins (ORGANIZADORES) Tópicos especiais em Ciência Animal III 1ª Edição Alegre, ES CAUFES 2014 ©Copyright by Autores e Organizadores, Alegre (ES), 2014. Todos os direitos reservados. Revisão de Texto: Bruno Borges Deminicis & Carla Braga Martins. Editora: CAUFES. Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP) (Biblioteca Setorial de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil) T674 Tópicos especiais em Ciência Animal III / Bruno Borges Deminicis, Carla Braga Martins, organizadores. – Alegre, ES : CAUFES, 2014. 366 p. : il. ; 21x29,5 cm. ISBN: 978-85-61890-56-8 1. Espírito Santo (Estado). 2. Medicina Veterinária. 3. Zootecnia. 4. Simpósio. 5. Pós-graduação. 6. Ciência. I. Deminicis, Bruno Borges. II. Martins, Carla Braga. CDU: 619 VENDA PROIBIDA 201 Deminicis & Martins Tópicos especiais em Ciência Animal III Capítulo 19- Princípios da nutrigenômica e seu emprego na nutrição animal do futuro Bonaparte, T.B. 1 ; Vargas Junior, J.G. 1 ; Bizarria, D.G. 1 ; Barata, A.L. 1 ; Nascimento, H.S. 1 ; Silva, B.M.F. 1 ; Carvalho, R.B. 1 ; Mesquita, C.B. 1 ; Oliveira, L.R.S. 1; Soares, R.T.R.N. 2 INTRODUÇÃO A Nutrigenômica é o estudo da relação entre os nutrientes e os genes, ou seja, como interações entre a dieta e a genética podem alterar o metabolismo ocasionando desequilíbrio até levar à saúde e doença. A herança genética pode interferir de formas diferentes no uso dos nutrientes em cada animal (Hannas, 2009). A genômica é o estudo de estrutura genética ao nível molecular e sua relação com processos biológicos. A estrutura genética, o DNA, pode ser transcrita para RNA e esta traduzida em proteina no nível ribossômico. A regulação ou controle do fluxo desta via determina todos os processos biológicos e os traduz em índices zootécnicos e podem ser influenciadas por nutrição, doença, toxinas, etc (Rutz et al, 2009). Através da transcrição é feito o processo regulatório do fluxo de informações desde a base genética até a síntese proteica, definindo os processos metabólicos e a estrutura celular. Alterações nos níveis de RNAm, bem como de proteínas, incluindo transportadores, enzimas e receptores, sã,o essenciais na determinação do fluxo de nutrientes ou metabólitos pela via bioquímica (Rist et al., 2006). Nutrientes e compostos bioativos dos alimentos (CBAs), por exemplo, podem atuar em diferentes alvos moleculares (Moreno et al., 1995). Ong et al. (2006) modificando etapas da expressão gênica (Rist et al., 2006). Assim como as vitaminas A e D, e os ácidos graxos, que apresentam ações diretas ao ativarem receptores nucleares e induzirem a transcrição gênica (Kaput & Rodriguez, 2004). Com o sequenciamento do genoma é possível elucidar as funções de todos os genes e suas interações com fatores ambientais (Lieble, 2002; Simpson, 2003) tornando a nutrigenômica área-chave para a nutrição nesta década (Fairweather- 2003) ao possibilitar a determinação do estado nutricional de um animal, considerando um determinado nutriente presente no organismo e sua ação sobre a funções biológicas consideradas fundamentais no metabolismo (Hannas, 2009). Apesar dos grandes avanços proporcionados pela genética, sabe-se que a nutrição pode alterar o fenótipo ao regular a expressão gênica. Isto é extremamente significativo, uma vez que sugere uma função extra dos nutrientes. Harvenstein et al. (2003), ao avaliar a contribuição da genética e da nutrição, demonstraram que 80% do desempenho dos frangos atualmente se deve a genética, enquanto que a nutrição correta de leitões apresenta consequências adversas a médio e longo prazo no desempenho zootécnico. Ao considerar que a nutrição influencia a síntese de muitos hormônios envolvido com o metabolismo e o desempenho, Dauncey et al. (2001) propuseram que a nutrição poderia influenciar a expressão genética através de ação hormonal sobre os seus receptores através de nutrientes específicos, o estado nutricional energético e alterações no consumo alimentar. 1Universidade Federal do Espírito Santo/CCAUFES 2Universidade Estadual do Norte Fluminense/UENF 202 Deminicis & Martins Tópicos especiais em Ciência Animal III A nutrição pode modificar a ação hormonal ao regular os receptores do hormônio, alterando a interação hormônio-receptor. O hormônio do crescimento e a insulina, ao interagir com o receptor molecular influenciam a atividade de vários genes que atuam sobre o metabolismo e desenvolvimento do animal (Dauncey et al., 2001). A interação gene-nutriente pode ocorrer quando nutrientes e compostos bioativos dos alimentos (CBAs) influenciam o funcionamento do genoma, e, através das variações no genoma que influenciam a forma pela qual o indivíduo responde à dieta (Kapu & Rodriguez, 2004; Kussmann et al 2006) o que leva a necessidade de dietas personalizadas, com base no genótipo, para a promoção da saúde e a redução do risco de doenças (DeBusk et al., 2005; Zhang et al., 2008). Componentes nutricionais como ácidos graxos influenciam o metabolismo lipídico no fígado e no estado imunológico (Roche et al., 2001). As vitaminas e minerais terão efeito direto na transcrição genética, influenciando o metabolismo e alterando, consequentemente, a saúde e o desempenho dos animais (Rutz et al., 2009). Para maior entendimento de como a carência de um nutriente altera a expressão gênica é preciso unir o conhecimento fisiológico e bioquímico existentes e conhecimentos mais profundos da ação dos nutrientes a nível molecular. Através da homeostasia no nível celular, tecidual, e entre os órgãos com as interações dos nutrientes no nível do gene, é possível prevenir doenças redefinindo a saúde animal e a nutrição no futuro (Rutz et al., 2009). Dentre as ferramentas de genômica funcional na área de nutrição destacam-se as que possibilitam a análise do transcritoma (transcritômica), proteoma (proteômica) e metaboloma (metabolômica). O transcritoma, o proteoma e o metaboloma sofrem alterações em função de diferentes fatores ambientais e alimentação (Rist et al., 2006). 1. Proteômica Através da Proteômica é possível identificar e quantificar as proteínas, além de determinar sua localização, modificações, interações, atividades e funções no organismo (Fields, 2001). As Proteínas respondem diferentemente dependendo da localização celular, sofrem proteólise, se desestruturam e rearranjam de acordo com o ligante, como ácidos nucléicos, proteínas, lipídeos, e moléculas de baixo peso molecular (Gygi et al., 1999). As proteínas podem estar envolvidas em diferentes processos e exercer diferentes funções (Fields, 2001). O proteoma apresenta maior complexidade comparado ao genoma e, de maneira geral, um genoma pode apresentar muitos proteomas (Fialho et al., 2008). 2. Metabolômica Diante das alterações na expressão gênica pode-se apenas indicar possíveis alterações fisiológicas. Por isso, é importante entender as consequências metabólicas de alterações na síntese de RNAm e proteínas (Astle et al., 2007). Na Metabolômica é realizada a análise qualitativa e quantitativa dos metabólitos do sistema biológico em momento específico (Astle et al., 2007; Trujillo et al., 2006). Os metabólitos incluem carboidratos, vitaminas, ácidos nucléicos, peptídeos, aminoácidos, ácidos orgânicos, vitaminas, minerais, polifenóis, alcalóides, bem como qualquer outra substância ingerida ou sintetizada pelas células ou organismo (Wishart, 2008). O metaboloma pode variar em função de sua localizaçãobiológica, do tempo, atividade física, estresse, sexo, hormônios, alimentação e genótipo, o que pode levar à células e órgãos apresentarem metabolomas distintos (Rist et al., 2006). 203 Deminicis & Martins Tópicos especiais em Ciência Animal III 3. Transcritômica A transcritômica é uma ciência que permite avaliação inicial a respeito da expressão genética, através da elucidação de processos de regulação metabólica ou de resposta imunológica (Rutz et al., 2009). A tecnologia de DNA microarrays (microarranjos de DNA) é a principal ferramenta para análise transcritômica, que possibilita avaliar simultaneamente até 50 mil transcritos (Zhang et al., 2008). As moléculas de DNA em fita simples se hibridizam com sequências complementares de DNA, o que possibilita o conhecimento das sequências de DNA permitindo a quantificação da abundância de transcritos específicos em determinada amostra biológica (Spieubauer & Stahl, 2005). A técnica de microarranjo de DNA consiste na produção do microarranjo, na extração de RNA da amostra biológica, na hibridização dos ácidos nucléicos marcados com o microarranjo, na detecção do sinal e visualização dos dados e no processamento e análise dos dados obtidos (Pozhitkov et al., 2007). O valor de RNAm do tecido ou células reflete diretamente o nível de regulação genética, permitindo a determinação do gene ativado ou desativado devido manipulação biológica ou durante o desenvolvimento dos tecidos. (Rutz et al., 2009). Com o desenvolvimento da técnica de microarranjo, após o entendimento da sequência de nucleotídeos e avanços no projeto genoma, foi possível examinar especificamente a expressão genética em tecidos de suínos e de aves. Os microarranjos específicos (gen chip) podem ser usados para avaliar 23.256 transcrições correspondentes a 20.201 genes do genoma de suínos (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA). Arranjos menores e bem definidos são usados na regulação de resposta em tecido específico. (Rutz et al., 2009). A capacidade de entender e relacionar as funções metabólicas básicas nos suínos e em outras espécies será maior através do desenvolvimento de microarranjos menores e mais definidos, para examinar a regulação de respostas especificas em tecidos (Rutz et al., 2009). Vários estudos tem usado esta tecnologia do microarranjo para descrever processos metabólicos específicos como a diferenciação na transcrição genética do músculo esquelético em duas linhagens de suínos (Lin & Hsu, 2005), definição de genes envolvidos na susceptibilidade de suínos a infecções comuns (Moser et al., 2004) e determinação de efeitos de proteína da dieta sobre a expressão de proteína hepática (Junghans et al., 2004). Apesar das vantagens e na exatidão dos dados pela técnica de microarranjos de DNA, existem ainda algumas desvantagens, uma delas se refere à quantidade significativa de tecido para o isolamento do RNAm. A necessidade de repetições para confiabilidade dos dados e o alto custo da técnica (Fialho et al., 2008). 4. Nutrigenômica aplicada à nutrição animal Com o esclarecimento da interação entre genes e nutrição é possível utilizar uma das técnicas mais poderosas para manipular os sistemas de produção animal. A nutrigenômica fornece o entendimento de os nutrientes afetam todo desempenho e saúde por meio da alteração da expressão genética ou a manifestação fenotípica do indivíduo (Rutz et al., 2009). O maior desempenho e melhoria na saúde dos animais são através do uso de estratégias nutricionais e de manejo para o controle de processos associados com a expressão genética. Como exemplo de estratégia nutricional está a prescrição de nutrientes, nos quais o animal é deficiente, para alertar possíveis enfermidades genéticas e para prevenir ou amenizar o aparecimento de alterações metabólicas relacionadas à doenças ou a idade, melhorando a saúde e a produtividade animal (Rutz et al., 2009). 204 Deminicis & Martins Tópicos especiais em Ciência Animal III As pesquisas com o uso da nutrição interferindo na expressão gênica ainda são escassos em suínos e aves, mas tornar-se-ão importantes à medida que houver maior entendimento entre a nutrição, a genética e o desempenho produtivo e reprodutivo dos animais (Rutz et al., 2009). Pesquisas com diferentes fontes proteicas na alimentação relacionadas à expressão de genes estabeleceram uma relação entre nutrição e expressão genética no fígado (Junghans et al., 2004). Entretanto, estes estudos estão ainda confirmando conceitos básicos e não são completamente confiáveis para recomendações práticas para melhoria da dieta. A interação entre nutrição e processos fisiológicos é complexa e será gradativamente vencida, na medida em que novas informações sobre sequencias genéticas possam ser obtidas a partir do genoma animal (Rutz et al., 2009). O uso da transcriptômicas através dos microarranjos tem permitido desenvolver um entendimento básico de fertilidade em suínos. E, como foco do estudo está o entendimento de alterações fisiológicas em suínos selecionados para melhora do desempenho reprodutivo (Caetano et al., 2004, Gladney et al., 2004). Estes trabalhos revelaram novos potenciais para o conhecimento da fisiologia ovariana e controle genético da reprodução. Para seleção de longo prazo de características como tamanho da leitegada, os genes podem estar envolvidos com a síntese de esteróides, modelação de tecidos e apoptose (Caetano et al., 2004). Alguns alimentos poderão ser utilizados na dieta por possuírem componentes bioativos, que podem alterar a expressão gênica, para proteção do organismo contra enfermidades que possam acometer os rebanhos (Afman & Muller, 2006; Ferguson, 2006), sendo que alguns elementos como, selênio, vitamina E, ácido ascórbico e carotenos, já foram identificados como agentes protetores. Os mananoligossacarídios são utilizados com propósito de melhorar a saúde animal, Iji et al. (2003) avaliaram a resposta da célula intestinal ao uso de mananoligossacarídio na dieta de aves a base de sorgo, que resultou em maior desenvolvimento da vilosidade do jejuno e maior conteúdo de RNA da mucosa ileal. Entretanto, isto não foi traduzido em crescimento da mucosa ou em diferenças na atividade enzimática da mucosa do íleo. Uni e Smirov (2006) investigando a influência do mananoligossacarideos sobre a biossíntese de mucina e secreção no intestino delgado, observaram que os mananoligossacarideos apresentam efeito estimulador da mucina, propiciam aumento no desenvolvimento das células caliciformes, que produzem mucina, resultando em maior camada de muco, aumentou a expressão do mRNA do gene MUC 2. Os autores concluíram que os mananoligossacarídeos interagem com as lectinas presentes na membrana celular, o que regula o crescimento celular e a sobrevivência ao interagir com proteínas nucleares e do citoplasma, afetando o sistema de comunicação intracelular. 5. O projeto genoma de aves No mapeamento genético das aves domésticas já foram descritas várias diferenças no pareamento de bases (2,8 milhões) entre linhagens (International Chicken Polymorphism Map Consortium, 2004), colocando em evidência a ampla diversidade genética de uma mesma espécie e de um mesmo gênero. O melhoramento genético dos frangos de corte e de aves de postura avançou muito (Burt, 2002), entretanto, algumas características indesejáveis apareceram como “efeito colateral” devido ao selecionamento dos animais. Em frangos de corte há aumento na incidência de enfermidades metabólicas, tal como ascite, redução de fertilidade e redução da resistência a doenças infecciosas enquanto em poedeiras ocorre aumento na incidência de osteopenias associado a um aumento na produção de ovos (Rutz et al., 2009). 205 Deminicis & Martins Tópicos especiais em Ciência Animal III A prioridade na indústria avícola é a redução de custose desenvolvimento de novos produtos, resultando em produtos de alta qualidade, e, isso requer maior uniformidade e estimativa na produção. A redução do uso de substâncias químicas e antibióticos e o aumento na resistência genética a patógenos são o caminho para a segurança alimentar e podem ser alcançados mais rapidamente e de forma menos onerosa através do desenvolvimento em genômica das aves (Rutz et al., 2009). A primeira versão do genoma de aves foi publicada em 2004, proporcionando aos pesquisadores uma ferramenta a mais para desvendar razões ligadas a problemas de saúde e produção avícola (International Chicken Genome Sequancing Consortium, 2004; Wallis et al., 2004). O mapa publicado pela International Chicken Polymorphism Map Consortium (2004) permite aos pesquisadores identificar os genes e as combinações nas variações dos genes, que produzem características desejáveis na população de aves (Rutz et al., 2009) e permitiram o desenvolvimento de microarranjos baseados no genoma completo de aves. O entendimento do grande volume de microarranjos relacionados ao desenvolvimento de modelos para reconstruir a rede complexa de genes funcionais e setores marca-passo é o grande desafio dos pesquisadores (Rutz et al., 2009). 6. Efeito do selênio na expressão genética Estudos conduzidos por Rao et al. (2001) avaliando os efeitos do selênio da dieta sobre a expressão genética em camundongos, utilizaram um microarranjo de 12.000 genes e demonstraram que camundongos deficientes em selênio apresentam alteração no padrão de síntese proteica. As alterações na expressão gênica em função da ausência de selênio na dieta ocorreram ao nível de transcrição genética. Os genes observados pelos autores que foram ativados por deficiência de selênio incluem aqueles associados com resposta a estresse e “turnover” ou renovação celular e crescimento. Os genes que foram desativados incluíram aqueles relacionados a mecanismos de desintoxicação, produção de selenoproteinas, proteção a estresse oxidativo e carreadores de lipídios (Rao et al., 2001). Os camundongos submetidos ao estresse e deficientes em selênio apresentaram alterações ao nível de transcrição com aumento no estresse oxidativo e na lesão do DNA devido a redução na produção de selenoproteínas e na desintoxicação enzimática (Rao et al., 2001). A pesquisa com camundongos demonstrou claramente como um único nutriente (selênio) ou uma classe inteira de nutrientes podem apresentar efeitos tão amplos na expressão genética. Através deste estudo informações sobre marcadores específicos ou metabolismos bioquímicos que podem ser usados para monitorar efeitos nutricionais nos componentes da dieta e relacionar com o papel de nutrientes na regulação da saúde animal e no seu desenvolvimento foram revelados (Rao et al., 2001). Dawson (2006) indicou que o selênio orgânico pode influenciar aspectos metabólicos envolvidos com a fertilidade. É possível que alterações similares na expressão genética sejam observadas em suínos e aves e possam ser usadas para definir o efeito da nutrição sobre a fertilidade (Rutz et al., 2009). O selênio está relacionado com o hormônio da tireoide, triiodotironina (T3) que apresenta muitas funções que podem estar relacionadas com o desempenho reprodutivo. Estimula a transcrição, fase importante no desenvolvimento embrionário, sendo essencial para a sobrevivência embrionária e para o crescimento de animais jovens (Edens & Gowdy, 2004). A forma ativa deste hormônio ocorre pela ação da enzima deiodinase, dependente de selênio. O atraso na conversão do hormônio T4 para T3 por deficiência em selênio está associado com aumento da mortalidade embrionária de embriões de aves (Christensen, 1985). 206 Deminicis & Martins Tópicos especiais em Ciência Animal III A eficiência reprodutiva depende das proteínas associadas ao sistema antioxidante que são influenciadas pelo selênio. O estresse oxidativo sobre o tecido reprodutivo e durante o desenvolvimento embrionário é o principal determinante do sucesso na reprodução (Edens & Gowdy, 2004). Com o uso de microarranjos em camundongos foi possível identificar que a atividade das glutationas peroxidase I e II foram estimuladas quando os camundongos receberam selênio orgânico ou inorgânico (Rao et al., 2001). Power trabalhando com poedeiras alimentadas com diferentes níveis de selênio observou maior ativação dos genes que codificavam para componentes do sistema antioxidante e menor expressão no gene que codifica para lesão do DNA no oviduto de poedeiras que receberam selênio orgânico. Ao et al., (2006) examinaram o efeito materno de aves ao suplementar selênio orgânico e inorgânico na dieta sobre a transferência de selênio aos pintos. Os dados evidenciaram que pintos oriundos de matrizes recebendo selênio orgânico apresentaram maior atividade de glutationa peroxidase no plasma, cérebro, fígado e coração ao nascimento e aos 14 dias de idade. 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS A nutrigenômica é uma nova ciência que explica como os nutrientes de uma dieta influenciam a expressão genética, elucidando a importância de determinados nutrientes na dieta e a partir daí, estabelecer estratégias nutricionais que venham a trazer significativa melhora na saúde e produtividade animal. Em um futuro próximo, serão acumulados dados suficientes e novas ferramentas serão necessárias para facilitar as análises das disciplinas ômicas e interpretar os resultados levando a novas descobertas e aplicabilidades na ciência da nutrição. 8. REFERÊNCIAS AFMAN L & MULLER M. Nutrigenomics from molecular nutrition to prevention of disease. Journal of the American Diet Association, 106, 569-576. 2006. AO, T., CANTOR, A.H., POWER, R.A., PIERCE, J.L., PESCATORE, A.J. AND FORD, M.J. Maternal dietary Sel-Plex® (Selenium Yeast) supplementation increases tissue and glutathione peroxidase activity of broiler chicks. Poultry Science Poscal (Supplement 1), 112, 2006. ASTLE J, FERGUSON JT, GERMAN JB, HARRIGAN GG, KELLEHER NL, KODADEK T, et al. Characterization of proteomic and metabolomic responses to dietary factors and supplements. J Nutr. 137(12): 2787-93, 2007. BURT, D.W. Applications of biotechnology in the poultry industry. Worlds Poultry Science Journal 58: 5- 13. CAETANO, A. 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