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Núcleo Celular: interfásico -presença do núcleo é a principal característica que distingue as células eucariontes. -ocupa 10% do volume total da célula - nele se encontra confinado o DNA, exceto o das mitocôndrias; - delimitado pela carioteca ou envoltório nuclear ; -envoltório nuclear tem inúmeras perfurações - poros - que comunicam o interior do núcleo com o citosol >> reforçada por duas malhas de filamentos intermediários, uma que se apóia sobre a superfície interna do envoltório - a lâmina nuclear e outra que o faz sobre a superfície externa; -O ciclo de vida da célula é dividido em duas fases principais: a mitose e a intérfase >> de acordo com a fase em que a célula se encontra, distinguem-se o núcleo interfásico e o núcleo mitótico; - maioria das células apresenta um único núcleo, apesar de existirem células com dois ou mais núcleos; ex. algumas células hepáticas binucleares; fibra muscular estriada esquelética; - geralmente, localiza-se no centro da célula; ocupa uma posição fixa no citoplasma graças à sua associação com componentes do citoesqueleto; ex. em células que armazenam material a ser secretado, como as células acinosas do pâncreas e as caliciformes do intestino, o núcleo tem posição basal; células vegetais apresentam núcleo periférico em razão do grande vacúolo citoplasmático; -contém a maior parte da informação genética da célula acumulada no DNA (uma parte no cloroplastos, mitocôndrias) - controla o metabolismo celular; -nele estão localizados: 1. 46 cromossomos (humano) >> cada um - DNA + várias proteínas ; 2. vários tipos de RNA ( mensageiro, ribossômicos, de transferência, pequenos ) >> sintetizados no núcleo quando seus genes são transcritos >> dps de seu processamento saem do núcleo pelos poros do envoltório; 3. nucléolo >> onde estão localizados os genes dos RNAr e os RNAr recém-sintetizados; 4. Diversas proteínas >> as que regulam a atividade dos genes, as que promovem o processamento dos RNA, as que se combinam com os RNAr no nucléolo, as DNA polimerases, as RNA polirnerases etc; >> são produzidas no citosol e ingressam no núcleo; 5. elementos mencionados se encontram dispersos na matriz nuclear ou nucleoplasma, cuja composição é escassamente conhecida; -a informação genética armazenada no DNA pode ser duplicada ou decodificada -Geralmente ovóide ou esférico,em geral o formato do núcleo acompanha o da célula; Há também núcleos com forma irregular; ex. achatada: células glandulares mucosas; lobulada: nos glóbulos brancos do sangue; -tamanho pode variar de acordo com o metabolismo e com o conteúdo em DNA da célula; ex. Células com metabolismo intenso apresentam núcleos volumosos; núcleos das aves, por sua vez, com baixo conteúdo de DNA, são, em geral, pequenos; -composto por envoltório nuclear, cromatina, nucléolos e nucleoplasma e matriz; ● Intérfase : é a fase celular entre duas mitoses; núcleo não está em repouso; possui alta atividade metabólica : duplicação do DNA; transcrição de diferentes tipos de RNA; ❖ Envoltório Nuclear (carioteca) -só é visível ao microscópio eletrônico; -separa o conteúdo do núcleo do citoplasma, responsável pela manutenção do núcleo como compartimento distinto; - permite que a célula controle o acesso ao seu material genético -composto por duas membranas concêntricas >> limitam uma cavidade interna (espaço entre a membrana externa e a membrana interna, que comunica-se com a cavidade do RE ) ( espaço perinuclear ) >> se unem ao nível dos poros, que se acham distribuídos mais ou menos regularmente - À face nucleoplasmática da membrana interna associa-se uma rede de filamentos que constitui a lâmina nuclear( um espessamento, parte da matriz nuclear ); -A membrana externa apresenta ribossomos na face citoplasmática e se continua com o retículo endoplasmático >>considerada uma porção especializada do retículo >> proteínas sintetizadas nestes ribossomas são incorporadas às membranas do envoltório ou lançadas no espaço perinuclear. -lâmina nuclear - malha delgada de filamentos laminares (laminofilamentos) entrecruzados e algumas proteínas integrais da membrana nuclear interna servem como pontos de ancoragem para os filamentos laminares; >> confere resistência ao envoltório nuclear e estabelece sua forma , geralmente esférica; -suas membranas são lipoprotéicas > 30% de lipídios e 70% de proteínas > 90% dos lipídios são fosfolipídios e os 10% restantes são triglicerídios, colesterol e ésteres de colesterol; - Algumas ptn, são específicas, como aquelas da família das nesprinas, que interagem com componentes do citoesqueleto e são responsáveis pela ancoragem e pelo posicionamento do núcleo na célula; - proteínas intrínsecas : emerina, receptor para filamentos da lâmina (LBR - do inglês lamina B receptor), LAPl e 2 (do inglês lamina-associated polypeptides), MANl e as Sunl e 2 ; localizando-se na membrana interna, na qual são mantidas graças à sua associação com a lâmina nuclear e/ou com a cromatina; ● Poros -uniformemente espaçados, que estabelecem comunicação entre o núcleo e o citoplasma; -3.000 a 4.000 poros -parcialmente preenchidos por agregados proteicos, os complexos de poro, que permitem e regulam o trânsito de macromoléculas entre o núcleo e o citoplasma; -sua quantidade por unidade de área do envoltório varia com o tipo de célula e com seu estágio funcional; ex. Células com alta atividade de síntese proteica (ex. as células embrionárias), apresentam maior quantidade de complexos de poro por unidade de área da superfície do envoltório; células com baixa atividade metabólica, (ex. eritrócitos nucleados), têm quantidade de complexos de poro significativamente menor; -complexo de poro contém : -ancorado na bicamada lipídica, nos pontos em que as membranas estão fundidas por dois tipos de proteínas intrínsecas, a POM121 e a gp210 ; °um conjunto de proteínas chamadas nucleoporinas (Nupl53, Nup62, Nup54, NupSO, Nup35, entre outras); - A disposição dos filamentos das Nup no interior do canal central fecha parcialmente a abertura do complexo de poro; °Oito colunas protéicas: formam uma parede cilíndrica em torno da qual a membrana externa do envoltório nuclear continua com a membrana interna; No lado citosólico, as extremidades das colunas proteicas compõem um anel ou boca interna do poro nuclear. No lado externo ocorre algo similar; ° Proteínas de ancoragem: amarram as colunas protéicas ao envoltório nuclear; Cada proteína se liga a uma das colunas, atravessa a membrana do envoltório e sua extremidade se sobressai no espaço perinuclear; ° Proteínas radiais: surgem das colunas e se orientam para o centro do poro; Como se encurtam e se alongam, convertem o complexo do poro em um diafragma; ° Fibrilas protéicas: nascem das aberturas interna e externa do complexo e se projetam para o nucleoplasma e o citosol, respectivamente; uma fibra circular une entre si extremidades distais das fibrilas que partem da abertura interna; -trânsito pode ocorrer por transporte passivo ou ativo; como ocorre? - proteínas próprias do núcleo são sintetizadas no citoplasma com sinais de localização nuclear, que consistem em uma ou duas sequências curtas de aminoácidos, ricas em lisina e arginina (peptídeo sinal); >> reconhecidos pelos receptores de importação ( proteínascitoplasmáticas da família das importinas ) >> se liga à proteína a ser transportada, formando um complexo que, para ser translocado através do poro, deve interagir com as nucleoporinas >> importina do complexo é reconhecida pelas sequências FG das Nup, que compõem os filamentos citoplasmáticos, e pelas sequências FG das Nup, que formam o canal central do complexo de poro >> Após o transporte, a importina se desliga da proteína e retorna ao citoplasma, no qual pode ser utilizada em novo processo de importação. obs: O sinal de localização nuclear não é removido depois que a proteína entra no núcleo, o que permite a reintrodução da proteína quando o envoltório nuclear se refaz após a mitose. -exportação de RNA do núcleo para o citoplasma é semelhante à importação de proteínas, mas atua em direção oposta >> mediado por receptores de exportação específicos ( uma família de proteínas denominadas exportinas ); -direção do transporte de moléculas entre o núcleo e o citoplasma é regulada pela Ran (Proteína nuclear relacionada a RAs ) - pertencente à família das enzimas que quebram GTP ou GTPases; Os receptores de importação nuclear (importinas) e de exportação (exportinas) contam com dois domínios: um que se liga à Ran e outro que se liga à molécula a ser transportada; -Ran hidrolisa o GTP, fornecendo energia para a translocação das moléculas por meio dos complexos de poro; -pode adotar dois estados conformacionais diferentes, dependendo da sua ligação à molécula de GTP ou de GDP, sendo a RanGTP concentrada no núcleo e a RanGDP, no citoplasma. como ocorre? processo de importação inicia-se no citoplasma, quando a proteína que contém o sinal de importação nuclear liga-se à importina. O complexo proteína-importina atravessa o complexo de poro, A passagem exige que a importina seja guiada pelas fibrilas protéicas externas e internas do poro, como visto anteriormente, e, então, no núcleo, a RanGTP liga-se à importina, promovendo uma alteração conformacional no sítio de ligação da importina e causando a liberação da proteína no nucleoplasma. O complexo importina-RanGTP retorna ao citoplasma, no qual outra proteína, chamada GAP ou proteína ativadora de GTPase, induz a atividade hidrolítica da Ran, que quebra o GTP, adotando a configuração RanGDP e liberando a importina no hialoplasma. Na exportação, que se inicia no núcleo, a exportina liga-se, ao mesmo tempo, à proteína que contém o sinal de exportação nuclear e à RanGTP. Esse complexo é translocado através do complexo de poro, e, uma vez no citoplasma, a Ran, ativada pela GAP, hidrolisa o GTP, assumindo a configuração RanGDP, liberando a proteína e a exportina no citoplasma. A exportina retorna ao núcleo, no qual irá participar de um novo processo de exportação. - macromoléculas que saem do núcleo, são proteínas envelhecidas ou que deixaram de funcionar-já que devem se dirigir ao citosol a fim de serem destruídas por proteassomas - e diversos tipos de RNA combinados com proteínas. -as proteínas destinadas ao núcleo ingressam estando pregueadas, já que adquirem suas estruturas terciárias e quaternárias no citosol, após o término de sua síntese; - certas proteínas destinadas ao núcleo - em particular dos receptores dos hormônios esteróides - depois de serem sintetizadas permanecem no citosol até a chegada desses hormônios >> são retidos porque a eles se unem chaperonas da família hsp90 e adquirem formas que lhes impedem de ingressar no núcleo >>> Quando chegam os hormônios esteróides, separam-se das chaperonas e mudam a forma dos receptores, o que lhes permite atravessar os poros do envoltório nuclear; -Saída de proteínas e de moléculas de RNA: As proteínas que saem do núcleo dependem também da Ran e de sinais específicos para poder atravessar os poros do envoltório nuclear. Os peptídeos sinalizadores são denominados NES (Sinal de exportação nuclear) e são reconhecidos por proteínas, exportinas. Além disso, existem NES que são reconhecidos por transportinas processo: sobre envoltório: ● Lâmina nuclear -rede fibrosa com 10- 20 nm de espessura que fica presa à membrana interna do envoltório nuclear; -nela as fibras se cruzam em ângulo reto; -tipos: 3 tipos da proteína Lamina e seus subtipos: • A (A e A delta 10 ) • B (B1, B2 eB3) • C (C e C2); -associam-se ao envoltório nuclear por meio de proteínas intrínsecas à membrana nuclear interna ( LAP 1 e 2, a emerina e a LBR ); - se associam também aos complexos de poro, provavelmente por meio das nucleoporinas; -Durante a mitose, a fosforilação temporária das laminas causa a desorganização da lâmina nuclear. Ao final da mitose, as laminas são desfosforiladas e se associam novamente para refazer a lâmina, levando à reconstituição do envoltório nuclear; - mantém a forma e garante suporte estrutural ao envoltório nuclear, e também é responsável pela ligação das fibras cromatínicas ao envoltório; - participação nos processos de replicação e transcrição do DNA, na expressão gênica, na manutenção do citoesqueleto e na sobrevivência da célula; ● Material genético -na forma de cromatina: designa, com exceção dos nucléolos, toda a porção do núcleo que se cora e é visível ao microscópio de luz; -DNA se complexa com proteínas específicas, constituindo a cromatina; - organização é dinâmica, pois se altera de acordo com a fase do ciclo celular e com o seu grau de atividade; -núcleo interfásico : cromatina se apresenta compactada e/ou descompactada; -núcleo mitótico ou meiótico: cromatina está altamente compactada, constituindo os cromossomos; Assim, a cromatina e os cromossomos representam dois aspectos morfológicos e fisiológicos da mesma estrutura - disposição da cromatina no interior do núcleo e o seu grau de condensação variam de um tipo celular para outro e são característicos de cada tipo celular e mesma célula pode apresentar cromatina com vários graus de condensação, de acordo com o estágio funcional e com o estado de diferenciação em que se encontra; -constituída de desoxirribonucleoproteína (DNA + várias proteínas); ex. células nervosas e os espermatócitos (células precursoras dos espermatozoides) : em certa fase, apresentam cromatina pouco condensada; plasmócitos (células produtoras dos anticorpos): núcleos com grumos densos de cromatina; eritroblastos (eritro, vermelho, e blasto, germe): sofrem uma condensação gradual da cromatina durante sua maturação; -cromossomo: constituído por uma molécula muito longa de DNA associada a diversas proteínas; suas estruturas são: ● centrômero ou constrição primária: participa da repartição das células-filha das duas cópias cromossômicas que são geradas como conseqüência da replicação do DNA; ● telômeros: correspondem às extremidades dos cromossomos, cujo DNA se replica de um modo diferente do restante do DNA; o DNA telomérico contém uma seqüência especial de nucleotídeos que se repetem muitas vezes; devido a sua localização, está exposto aos seguintes riscos: pode se fundir com o DNA de outros telômeros ou pode ser degradado por uma nuclease (não ocorrem porque o DNA telomérico se dobra sobre si mesmo (adota a forma de um laço) e é protegido por um capuz de proteínas denominadas TRF (fator de ligação de repetição telomérica); ● origens de replicação: o enorme comprimento do DNA exige que sua replicação tenha início em muitos pontos (origens de replicação) simultaneamente a fim de que sua duração seja relativamente curta; neles o DNA tem sequências de nucleotídeos especiais. Além disso, todas as origens de replicação têm em comum seqüências conservadasde cerca de uma dezena de nucleotídeos, ARS (sequência de replicação autônoma) -cromatina: DNA+ histonas + proteínas não histônicas; , encontra-se pequena quantidade de RNA associado a ela. - proteínas que se associam ao DNA para formar a cromatina (tmb o cromossomo, já que o cromossomo é formado de cromatina) são classificadas em histônicas e não histônicas; -DNA: constituído por duas cadeias de polinucleotídios complementares e antiparalelas, que se associam por pontes de hidrogênio, formando uma dupla hélice ; quantidade (expressa em pares de bases (pb), é chamada de valor C) por núcleo varia de uma espécie para outra e é característica de cada espécie. célula somática, diplóide: 2C; par de cromossomo homólogo; célula haplóide: C (metade); espermatozóides e os ovócitos; o grau de enrolamento varia segundo o momento do ciclo em que a célula se encontra: é mínimo durante a interfase (quando a síntese de RNA é alta) e máximo quando a célula está prestes a se dividir; paradoxo do valor C(exceções): quantidade de DNA nas células dos vertebrados está acima do teor mínimo necessário para armazenar a informação genética da espécie >> levou à proposição de que a maior parte do genoma1 de uma célula eucarionte não é funcional ou tem outras funções que não a codificação de proteínas todas as células têm conjuntos virtualmente idênticos de moléculas de DNA; genoma: totalidade da informação genética depositada no DNA; A capacidade ou incapacidade funcional do DNA para gerar moléculas de RNA ( transcrição do DNA), baseia-se na seqüência de seus nucleotídeos : em alguns setores, o DNA exibe seqüências de nucleotídeos que se transcrevem - chamadas de genes; se acha representado (em 75%) por seqüências de nucleotídeos não repetidas (cópias únicas) ou que se repetem poucas vezes - aí localizam-se os setores funcionais do DNA ou seja, os genes - que englobam cerca de 10% do DNA (representam 13% desses 75%); Os 25% restantes do DNA correspondem a seqüências de nucleotídeos que se repetem muitas vezes (DNA repetitivo); -DNA repetido: funções desconhecidas; 2 tipos: I. o disposto em turnos : o início de uma repetição se acha imediatamente depois do final da outra; pertencem os DNA satélites, microssatélites e os minissatélites. II. o disperso : cópia não se encontram agrupadas e sim dispersas em pontos diferentes dos cromossomos; pertencem os DNAs SINE e LINE (elementos nucleares intermediários curtos e longos ); ** satélites - comprimento da seqüência repetida, o número de vezes que se repete em cada turno e o número de turnos variam; o mais destacado localiza-se nos centrômeros (por isso, é encontrado em todos os cromossomos); Inclui uma seqüência repetida de 171 pares de bases (seqüência alfóide), que varia muito pouco nos diferentes cromossomos; Outros se localizam no braço longo do cromossomo Y e na cromatina distante dos centrômeros dos cromossomos 1, 3, 9, 16 e 19; **microssatélites - seqüências de DNA repetidas muito mais curtas que o anterior; igualmente encontrados em todos os cromossomos; **minissatélites - contêm seqüências de DNA curtas; pertencem o DNA repetitivo dos telômeros e o DNA hipervariável (pq é diferente em cada indivíduo/ localiza-se principalmente nas proximidades dos centrômeros e medicina forense recorre a ele quando necessita realizar estudos de paternidade ou de identidade de pessoas); 1 somatória de todo o material genético; **SINE - mais estudado corresponde à família Alu, da qual existem cercas de 500.000 cópias repartidas em todos os cromossomos. Cada cópia tem cerca de 300 nucleotídeos em um sítio que pode ser cortado pela enzima de restrição Alu I ; **LINE - mais comum é conhecido com a sigla LI (LINE-1); Sua seqüência repetida é relativamente longa e corresponde ao gene de uma transcriptase reversa; - Histonas: proteínas bastante estáveis, não sendo renovadas constantemente; peso molecular baixo; apresentam forte caráter básico, pois são ricas nos aminoácidos básicos (carga positiva), arginina e lisina; se ligam ao DNA graças à interação de seus radicais amino com os radicais fosfato do DNA; Nem todos os radicais fosfato estão neutralizados pelas histonas, o que confere à cromatina um caráter ácido (se coram com corante básico/ basofilia); as bases nitrogenadas não se ligam às histonas (as interações DNA-histonas independem da sequência de nucleotídios do DNA); 5 tipos, baseado no teor de lisina e/ou arginina: H1; H2A; H2B; H3; H4; H2A, H2B, H3 e H4: pequenas; as cadeias polipeptídicas constituídas por três sequências dispostas em a -hélice e conectadas por duas sequências filamentosas, que se dispõem como alças; tem um longo segmento N-terminal composto principalmente por aminoácidos básicos; histonas nucleossômicas porque a molécula de DNA se enrola em torno delas para formar os nucleossomas, que constituem as unidades básicas do enrolamento cromatínico; aminoácidos podem ser acetilados, metilados ou fosforilados (levam a uma modificação da carga eletrostática da histona, alterando sua interação com o DNA e influindo na configuração da fibra cromatínica); ex. a correlação entre a fosforilação das histonas e as diferentes fases da mitose; H3 e H4 apresentam sequências idênticas em organismos tão distintos; H1 apresentam três regiões distintas: uma região globular, em razão do enovelamento da cadeia polipeptídica, localizada entre dois segmentos filamentosos, N- e C-terminal ; caracterizadas como histonas de ligação, (elas têm função na compactação das fibras de cromatina); Em eritrócitos nucleados de aves, a histona H5 é encontrada em substituição à H1 e desempenha a mesma função -proteínas não-histônicas: muitas são acídicas; podem estar ligadas ao DNA ou dispersas no nucleoplasma; estão incluídas todas as proteínas nucleares, com exceção das histonas; células metabolicamente mais ativas, como os neurônios e as células glandulares, apresentam alto teor de proteínas não histônicas; De acordo com suas atividades funcionais, tem: I. Proteínas que participam da estrutura dos cromossomos: mais de 30 acídicas e que tmb colaboram na organização e compactação do DNA nos cromossomos; ex. topoisomerase II e a condensina; II. Proteínas relacionadas com os processos de replicação e reparo do DNA: ex. DNA polimerases, helicases, topoisomerases etc; III. Proteínas que participam do processo de ativação e repressão gênica: aquelas pertencentes ao grupo HMG (grupo de alta mobilidade) Essas proteínas se ligam às fibras cromatínicas, reduzindo sua compactação e ativando, portanto, sua atividade transcricional; -Estrutura molecular da cromatina: A unidade estrutural básica da cromatina é o nucleossomo; nucleossoma: partícula com forma cilíndrica achatada, com 1O nm de diâmetro e 6 nm de altura; cada um é constituído por 200 pares de bases (pb) de DNA associados a um octâmero2de histonas; octâmero: formado por duas moléculas de cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4 (núcleo/centro do nucleossomo); as extremidades amina - ou "caudas" - das histonas projetam-se para fora do nucleossoma; envolto por um pequeno segmento de DNA que percorre sua circunferência quase duas vezes; , as duasvoltas do DNA se fixam ao núcleo do nucleossoma graças à histona H1; cromatossoma: complexo nucleossoma + a histona H1; o segmento de DNA que a ele se associa é de 166 pares de nucleotídeos, 20 a mais que o nucleossoma; As H3 e H4 formam um tetrâmero central, enquanto H2A e H2B formam dois dímeros que se associam perifericamente, em cada lado do tetrâmero; existem duas proteínas acessórias - ambas ácidas - que ajudam as histonas para que se liguem entre si. Denominam-se proteína N1 (associa-se a H3 à H4) e nucleoplasmina (associa a H2A à H2B); nucleossomas estão separados por segmentos de DNA espaçadores ou ligação de comprimento variável, que contêm entre 20 e 60 pares de nucleotídeos (dá à cromatina a aparência de um colar de contas); . 2 estrutura ou molécula composta de oito subunidades. -Para que possa ser contida no pequeno espaço que o núcleo lhe oferece, a cromatina de cada cromossomo deve sofrer novos e sucessivos graus de enrolamento, cada vez maiores - por meio de um complexo de ptns nucleares, as condensinas; 1. colar de contas - primeiro nível de compactação da cromatina também chamado de fibra de 10 nm; 2. segundo nível de compactação da cromatina é representado pela fibra de 30 nm - que se forma quando a histona H1 associa-se ao DNA de ligação que chega ao centro do nucleossomo e o deixa. Em um primeiro momento, os cromossomos se enrolam sobre si mesmo e dão lugar a uma estrutura helicoidal chamada solenóide - depende das histonas H1 - que se unem entre si - e cada volta do solenóide contém seis nucleossomas. também contribuem para a compactação e estabilização da fibra - associação entre as caudas filamentosas das histonas que se projetam do octâmero, bem como a presença de água e de cátions divalentes (como íons Mg++ e Mn++) em concentração adequada; **adição de radicais acetila às histonas do octâmero desenrola a fibra de 30 nm e leva à formação da fibra de 10 nm, favorecendo a transcrição e tornando a cromatina ativa 3. em intervalos mais ou menos regulares, o enrolamento das fibras de 30 nm é interrompido, de modo que se observam - entre setores de 30 nm - segmentos de cromatina mais delgada. Neles, o DNA se encontra associado a proteínas não histônicas, em sua maioria reguladoras da atividade gênica; 4. a cromatina cada vez mais se compacta. 5. Assim, a fibra de 30 nm forma laços (ou alças) de comprimento variado, que nascem de um eixo protéico constituído por proteínas não histônicas ( se prendem ao envoltório nuclear através da lâmina nuclear); 6. Visto que o conjunto de cordões protéicos compõe uma espécie de armação, nos extremos de cada laço o DNA associado ao cordão protéico recebe o nome de SAR (regiões associadas a andaimes). Os laços encontram-se firmemente unidos ao cordão. porém não sabemos como as SAR se sujeitam a eles 7. Considera-se que cada laço constituiria uma unidade de replicação do DNA e, provavelmente, uma unidade de transcrição, ou seja, um gene; 8. As histonas Hl e H3 parecem, no entanto, participar também desse processo de compactação, uma vez que a fosforilação de ambas, durante a prófase, determina a condensação dos cromossomos. 9. As fibras cromatínicas organizadas em alças parecem se ligar às laminas e à matriz nuclear por meio de segmentos específicos do DNA ● cerca de 10% da cromatina interfásica está em um estado altamente condensado, chamado heterocromatina; ➢ Cromatina e expressão da informação genética - gene: sequência de nucleotídios do DNA que é expresso em um produto funcional, ou seja, em uma molécula de RNA ou em uma cadeia polipeptídica; - genoma das células eucariontes, apresenta uma grande quantidade de sequências de DNA que não são convertidas em produtos funcionais, que não são codificadoras - Muitas delas estão localizadas entre os genes, separando um gene do seu "vizinho"; - Outras, no entanto, estão presentes nos próprios genes; -Esses genes apresentam segmentos codificadores ( exons ), separados por segmentos não codificadores ( íntrons ); -Todo o gene é transcrito em uma longa molécula de RNA, que é processada, reduzida de tamanho e convertida na molécula de RNA funcional; como ocorre? - processamento das moléculas de RNA ocorre no núcleo e envolve o splicing ( remoção e digestão dos íntrons e na posterior junção dos éxons ) - apenas os éxons são mantidos no RNA maduro; - a molécula de RNA deve ser clivada em locais exatos, e os éxons devem ser ligados também de maneira exata. - O processo de clivagem dos RNA e a posterior ligação das partes que formarão a molécula madura envolvem moléculas de RNA ( snRNA (pequeno RNA nuclear) ), em vez de enzimas (rna tmb tem atividade catalítica); -No splicing do mRNA participam cinco moléculas distintas de snRNA, quais sejam, Ul, U2, U4, U5 e U6; -Os snRNA juntam-se com proteínas, constituindo snRNP (ribonucleoproteínas nucleares pequenas), que, por sua vez, associam-se com outras enzimas e constituem o spliceossomo. 1. O primeiro passo na expressão de um gene é a sua transcrição em uma molécula de RNA; 2. principal enzima responsável pela transcrição é a RNA-polimerase - catalisa a polimerização dos ribonucleosídios trifosfatados (ATP, CTP, GTP e UTP) na presença dos íons Mg2+ e Mn2+; 3. Apenas uma das fitas do DNA é usada como molde; ( molécula de RNA transcrita é complementar à fita de DNA que lhe deu origem e idêntica à outra fita de DNA ) 4. Para um determinado gene, sempre a mesma fita de DNA é copiada, e o crescimento da cadeia de RNA ocorre sempre no sentido 5'-3'; 5. RNA-polimerase não depende de um primer (iniciador) para iniciar a síntese; 6. A sequência (promotor) do DNA na qual a RNApolimerase se liga para iniciar a transcrição de um gene contém cerca de 40 pb; 7. Depois de se ligar ao promotor, a RNA-polimerase abre uma região da hélice para expor a sequência de nucleotídios que irá ser transcrita - Um dos dois filamentos do DNA que estão expostos serve como molde para o pareamento complementar dos ribonucleosídios trifosfatados, que são ligados um a um pela RNA-polimerase; 8. A molécula de RNA-polimerase se move ao longo da molécula de DNA, desenrolando a dupla hélice do DNA e expondo outra sequência de nucleotídios para servir como molde; 9. Dessa maneira, a molécula de RNA é alongada pela adição de um nucleotídio de cada vez na direção 5'-3'; 10. processo de elongação da cadeia continua até que a enzima encontra uma sequência especial de nucleotídios no DNA molde, o sinal de término, quando então a polimerase interrompe a síntese; 11. Terminada a transcrição, a polimerase libera o DNA molde, a dupla hélice se refaz e a recém-sintetizada molécula de RNAm"JA é liberada no nucleoplasma, no qual será processada. ➢ eucromática ou heterocromática -Durante a interfase, a cromatina muito condensada recebe o nome de heterocromatina (DNA inativo do ponto de vista transcricional/ pertencem toda a heterocromatina e o setor da eucromatina onde o enrolamento se acha em um grau intermediário entre a eucromatina transcricionalmente ativa e a heterocromatina.);- já o nome eucromatina é reservado para aquela menos compactada (tem DNA transcricionalmente ativo, quer dizer, o DNA que sintetiza moléculas de RNA/ experimentam ciclos de contração e extensão/10% do genoma/ DNA se expressa na célula/ é a maior porção da cromatina, e se apresenta difusa); transcrição ocorre somente durante a intérfase, sendo interrompido na divisão celular - compactação da cromatina, na prófase, as enzimas envolvidas na transcrição não conseguem ter acesso às moléculas de DNA. A transcrição é retomada no final da telófase, quando ocorre a descondensação -Existe uma relação direta entre o grau de enrolamento e a atividade transcricional do DNA; -heterocromatina: é duplicada mais tardiamente no período S da intérfase; designa as porções da cromatina que aparecem condensadas no núcleo interfásico; 2 tipos - constitutiva e a facultativa; I. Constitutiva- formada por sequências gênicas altamente repetitivas (localizam-se em regiões específicas do cromossomo, principalmente no centrômero, nos telômeros e em torno das constrições secundárias e nas regiões organizadoras do nucléolo (RON)), que nunca são transcritas; não conversível em eucromatina; 10- 25% do DNA nuclear; se encontra de maneira constante em todos os tipos celulares (componente estável do genoma); também chamadas de DNA satélite; ex. cromatina dos setores cromossômicos que têm DNA repetitivo satélite - como o dos centrômeros, o do braço longo do cromossomo Y etc - e a maior parte da cromatina que forma os braços curtos dos cromossomos acrocêntricos3; 3 Cromossomo ou cromátide que possui seu centrômero perto da extremidade. Há evidências de que a atividade transcricional da cromatina é aumentada por modificações que envolvem acetilação e ubiquitinação das histonas. A adição de radicais acetila aos segmentos N-terminais das histonas H2A, H2B, H3 e H4, pre- sentes na região central do nucleossomo, diminui a interação dessas proteínas com o DNA. Assim, a fibra de 30 nrn torna-se mais instável, o que impede uma compactação maior da cromatina e favorece a transcrição. Os radicais acetila são adicionados às histonas durante a fase S da intérfase e são removidos antes do início da mitose. A ubiquitinação envolve a adição da proteína ubiquitina às histonas H2A e H2B. A ubiquitina é uma proteína não histônica, acíclica, que reduz o caráter básico das histonas H2A e H2B, levando a alterações estruturais dos nucleossomos. Essas alterações fazem com que o DNA que envolve o octâmero de histonas fique mais acessível à RNA polimerase. a histona Hl parece estar menos intimamente ligada ao DNA na cromatina ativa II. Facultativa - se apresenta condensada em algumas células e descondensada em outra, como eucromatina; detectada em localizações que variam nos diferentes tipos celulares ou nas sucessivas diferenciações de uma determinada célula; ex. cromossomo X das fêmeas de mamíferos - um dos dois crom. x é inativado ainda durante a vida intrauterina - quando uma ou as duas moléculas de histona H2A do octâmero são substituídas por uma variante da H2A ( macro H2A ) - altera a estrutura do octâmero, aumentando a estabilidade do core nucleossômico e não permitindo o acesso da RNA polimerase II ao DNA, impedindo sua transcrição; - ; em algumas células o cromossomo X condensado é de origem materna e, em outras, de origem paterna. corpo da mulher é um mosaico que contém, possivelmente em todos os órgãos, células com o cromossomo X paterno inativo e outras com o cromossomo X materno inativo - cromossomo X heterocromático é circular e chamado cromatina sexual ou corpúsculo de Barr - presença ou não da cromatina sexual permite o diagnóstico citológico do sexo. acontece ao acaso; ➢ Cariótipo -conjunto de cromossomos ordenados segundo um critério preestabelecido, é o conjunto de características constantes dos cromossomos da espécie, quanto a número, tamanho e morfologia; -homem: 22 cromossomos autossomos + par sexual ( XY , y é curto) -mulher: 22 autossomos + par sexual (XX, idênticos) --grau maior de enrolamento é alcançado na etapa da divisão chamada metáfase, na qual a cromatina dos cromossomos mostra um estado de condensação similar ao da heterocromatina interfásica; -cromossomos metafásicos: compostos por dois componentes filamentosos - as cromátides- irmãs-unidas pelo centrômero (ou constrição primária); -A presença do centrômero divide as cromátides do cromossomo metafásico em dois braços, geralmente um mais longo que o outro (curto - p ; longo - q; ) - extremos dos braços são denominados telômeros; -De acordo com a posição do centrômero, os cromossomos são classificados em três grupos: I. metacêntricos - centrômero em uma posição mais ou menos central, de modo que existe pouca ou nenhuma diferença no comprimento dos braços das cromátides; II. submetacêntricos - centrômero encontra-se afastado do ponto central, de modo que as cromátides têm um braço curto e um longo; III. acrocêntricos - centrômero se encontra próximo de um dos extremos do cromossomo, de modo que os braços curtos das cromátides são muito pequenos; acrocêntricos correspondem aos números 13, 14, 15, 21 e 22 - tem uma pequena massa de cromatina chamada satélite (não deve ser confundida com o DNA satélite ); o braço curto dos cromossomos acrocêntricos é composto por heterocromatina; fibras de cromatina, ou solenóide ● Nucléolo - estruturas nucleares esféricas não envolvidas por membrana; -densas que se coram intensamente; diâmetro de 1 a 3 µm, se alojam dentro do núcleo; - contêm em torno de 60% de matéria seca, principalmente proteínas e RNAr. pequena quantidade de DNA - correspondente à cromatina que contém os genes codificadores dos rRNA, denominado DNA ribossômico (rDNA); -tem proteínas e rRNA que irão compor as subunidades ribossômicas, bem como enzimas, proteínas e RNA que participam da transcrição e das modificações pós-transcricionais dos rRNA; ex. RNA polimerase I, (responsável pela transcrição do rDNA); topoisomerases I e II ( participam da descondensação e do relaxamento do rDNA ); o UBF (um fator envolvido na transcrição do rRNA ); nucleolina, (participa da transcrição do rDNA e do processamento do rRNA) e a fibrilarina. RNA de baixo peso molecular, os snoRNA (RNA nucleolar pequeno), que podem estar complexados com proteínas, constituindo as snoRNP (exemplo de snoRNP, formado pela complexação do snoU3 com a proteína fibrilarina, é responsável pela clivagem inicial do rRNA); -tamanho, que pode variar de 1 até 7 µm, de acordo com o tipo celular e o estado funcional da célula - relacionado com a intensidade da síntese proteica que ocorre no citoplasma; células que sintetizam proteínas ativamente, ou por secretarem proteínas, ou por se reproduzirem frequentemente, têm nucléolos maiores que outros tipos celulares. - forma e organização estrutural variam bastante entre os diferentes tipos celulares e dependem de sua atividade funcional; células que apresentam alta atividade de produção de ribossomos, os nucléolos são geralmente grandes e complexos. Nucléolos pequenos, em forma de anel, são encontrados em células que produzem poucos ribossomos, como os linfócitos e monócitos do sangue -geralmente é único, mas existem núcleos com dois ou mais nucléolos;-geralmente está associado a uma massa de cromatina acoplada à sua superfície – é chamada: Cromatina Associada ao Nucléolo - responsável por formar o nucléolo - local onde esta cromatina está localizada é chamada Região Organizadora do Nucléolo - RON; -estruturas dinâmicas, que se fragmentam na prófase da mitose e se reorganizam na telófase - pela ação de proteínas, que fosforilam alguns componentes do complexo que transcreve as moléculas de rRNA, inativando esse complexo e interrompendo a transcrição - Quando são desfosforilados, a transcrição é retomada, com a consequente reorganização do nucléolo; -componentes, representam os locais de transcrição e processamento do rRNA e de montagem das subunidades ribossômicas: (a) centro fibrilar - elétron-lúcido e frequentemente em forma circular; (b) componente fibrilar denso - contém fibrilas muito finas com 3 a 5 nm de diâmetro, que podem formar uma rede; (c) o componente granular - constituído por grânulos com 15 nm de diâmetro; -maioria dos nucléolos, os três componentes apresentam um arranjo concêntrico - centro do nucléolo aparece pouco contrastado no microscópio el. - localizado o centro fibrilar, que contém o rDNA, as moléculas de RNA-polimerase 1, as DNA-topoisomerases I e II, bem como os fatores de transcrição do rRNA; -centros fibrilares são envolvidos, total ou parcialmente, pelo componente fibrilar denso, no qual são encontradas moléculas de rRNA recém-transcrito e as enzimas envolvidas no processamento pós-transcricional do rRNA; - porção mais externa contém o componente granular, em que ocorre o processamento final do rRNA e é, portanto, constituído por grânulos de rRNA complexados com proteínas; -genes que codificam os rRNA estão localizados e são transcritos nos centros fibrilares ou no limite entre os centros fibrilares e o componente fibrilar denso; -processamento do rRNA e a sua complexação(união) com proteínas inicia-se no componente fibrilar denso, continuando no componente granular, no qual as subunidades ribossômicas estão em processo final de montagem. ➔ Formação dos ribossomos -Os genes que codificam o rRNA estão localizados em porções de fibras cromatínicas que, após sua compactação, irão constituir as constrições secundárias de cromossomos específicos. Essas regiões foram denominadas regiões organizadoras do nucléolo RON ou NON; - os genes que codificam os rRNA estão presentes em múltiplas cópias por genoma - As várias cópias do gene estão arranjadas in tandem, ou seja, repetidos em sequência, estando cada gene separado do próximo por um segmento de DNA não transcrito ou NTS (sem espaçador transcrito); -Assim, o rDNA apresenta sequências transcritas alternadas com sequências não transcritas; ** genes que codificam o rRNA são transcritos pela RNA polimerase 1, e cada gene produz o mesmo transcrito primário; células de eucariontes superiores, esse transcrito primário é uma molécula de rRNA com cerca de 13.000 nucleotídios e coeficiente de sedimentação de 45S, denominada pré-rRNA; O pré-rRNA contém, nas extremidades 5' e 3', dois espaçadores transcritos externos, ETS, e dois espaçadores transcritos internos, ITS 1 e ITS2. Antes de sair do núcleo na forma de subunidades ribossômicas, o pré-rRNA é clivado para retirar esses espaçadores e produzir uma cópia de cada uma das moléculas finais de rRNA: o rRNA 28S, o rRNA 18S e o rRNA 5,8S; sequências de nucleotídios que são retiradas de cada molécula de rRNA são degradadas no núcleo. À medida que a RNA-polimerase I transcreve o rDNA (DNA que codifica rRNA), proteínas são adicionadas às moléculas dos pré-rRNA nascentes, formando partículas de préribonucleoproteínas (pré-rRNP). A molécula de rRNA 45S presente em cada partícula de pré-rRNP é então clivada, pelas snoRNP, em sequências específicas para formar as moléculas maduras de rRNA; A molécula de rRNA 45S (transcrito primário) é, inicialmente, quebrada em duas, uma com 32S e a outra com 20S. A molécula de rRNA 20S é clivada, originando o rRNA 185, enquanto a clivagem da molécula de rRNA 32S origina as moléculas de rRNA 28S e 5,8S. Esse padrão de processamento é observado em células humanas, enquanto, em outras espécies, existem diferenças na ordem de algumas clivagens. Além da clivagem, durante o processamento ocorrem também metilações nas riboses dos pré-rRNA e a isomerização de uma centena de moléculas de uridina, que são convertidas a pseudouridina Todos esses radicais metil são preservados durante o processamento, de maneira que eles podem ser detectados nas moléculas maduras dos rRNA. A metilação provavelmente protege o rRNA das clivagens, de modo que o rRNA em processamento só é clivado em pontos não metilados. Essas modificações dos pré-rRNA têm também, provavelmente, alguma função na montagem dos ribossomos. - genes que codificam o rRNA SS (com 120 nucleotídios) não estão presentes no rDNA, ou seja, esses genes estão localizados em outra região do DNA, que não a NOR. Assim, esse rRNA é transcrito fora do nucléolo e separadamente das outras moléculas de rRNA -genes que codificam o rRNA SS são transcritos pela RNA-polimerase III; -O rRNA SS não é processado, como os outros rRNAs. Esse rRNA, depois de transcrito, migra para o nucléolo, onde é complexado com os rRNAs 28S e 5,8S e proteínas para formar a subunidade maior do ribossomo; -montagem das subunidades ribossômicas envolve a complexação das moléculas dos rRNAs 18S, 28S, 5,8S e SS com proteínas; Os genes que codificam as proteínas ribossômicas são transcritos fora do nucléolo pela RNA-polimerase-II; -Essas proteínas são sintetizadas no citoplasma e importadas pelo núcleo -Mais da metade das proteínas ribossômicas associa-se ao pré-rRNA no momento de sua transcrição; proteínas restantes, bem como o rRNA SS, são incorporadas nas pré-subunidades ribossômicas à medida que ocorrem as clivagens; -a exportação das subunidades ribossômicas para o citoplasma envolve o sistema Ran-GTPase e proteínas do complexo de poro; ➔ Participa da maturação da partícula reconhecedora do sinal (PRS) (complexo de RNA de baixo peso molecular com proteínas); -no nucléolo ocorre a complexação do RNA pequeno com proteínas para montar a partícula; não se sabe quem é responsável! ➔ envolvido na complexação de RNA e proteínas na montagem da telomerase e no processamento de alguns tRNA; ● Nucleoplasma -solução aquosa de proteínas, RNA, nucleosídios, nucleotídios e íons, na qual estão mergulhados os nucléolos e a cromatina. -os RNA são heterogêneos, pois apresentam diferentes tamanhos pesos moleculares; -Dispersos no nucleoplasma tmb tem proteossomos ( agregados proteicos envolvidos com a degradação de proteínas envolvidas no controle do ciclo celular ) - localizam-se nas regiões eucromáticas tanto quanto na periferia da heterocromatina e dos nucléolos; - Muitas das proteínas presentes nele são enzimas envolvidas com a transcrição e com a duplicação do DNA, como as RNA-polimerases, DNA-polimerases, topoisomerases, helicases, entre outras; ● Matriz Nuclear -Constitui uma estrutura fibrilar formando um endoesqueleto nuclear (equivalente ao citoesqueleto); -função de ancoraras alças cromatínicas, as enzimas envolvidas na replicação e transcrição do DNA e também as proteínas envolvidas no transporte dos RNA; -constituída por três componentes: a lâmina nuclear, a estrutura nucleolar e a matriz nuclear; -Várias proteínas: exemplo : laminas A, matrinas, metaloproteínas (que se ligam a metais), actina e um tipo especial de miosina I; - laminas A do endoesqueleto são mais estáveis e ocorrem em menor quantidade, quando comparadas com as laminas associadas à lâmina nuclear; -núcleo interfásico é estruturado em compartimentos distintos, conhecidos como domínios nucleares; ex. matriz participaria - no espaço nuclear; fibras cromatínicas - territórios cromossômicos; eucromatina - centro do núcleo; heterocromatina - periferia favorece o silenciamento dos genes da heterocromatina, bem como a atividade gênica da eucromatina ❖ Cromossomo metafásico - cromossomos são resultantes da condensação da cromatina que ocorre durante a divisão mitótica ou durante a meiose; -são o estado mais condensado da cromatina ; -grau de condensação é máximo na metáfase; ➢ Estrutura duplicação do DNA é condição determinante para que a célula entre em divisão; Em consequência, o cromossomo metafásico é composto por duas moléculas de DNA, cada qual presente em uma das duas cromátides que constituem o cromossomo (duas cromátides-irmãs); cada cromátide é resultante da compactação da fibra cromatínica de 30 nm; sugere que o cromossomo metafásico seja formado por um esqueleto central de proteínas não histônicas, ao qual a fibra cromatínica de 30 nm se associa como alças - As sequências de DNA que se associam ao esqueleto foram denominadas SAR ( regiões de fixação de andaime ), ou regiões de ligação ao esqueleto; -Embora a matriz nuclear e o esqueleto metafásico sejam constituídos por proteínas diferentes, eles apresentam alguns componentes em comum, como é o caso da topoisomerase II. -SMC ( manutenção estrutural dos cromossomos ) : família de proteínas envolvidas com a organização estrutural dos cromossomos; Pertencem a essa família dois grandes complexos de proteínas: complexo condensina e o complexo coesina (relacionados, respectivamente, com a condensação do cromossomo e com a manutenção da união entre as cromátides-irmãs de um cromossomo); -Com a participação das proteínas do complexo coesina, as duas cromátides de um cromossomo se unem por meio de uma região de estrangulamento, ( constrição primária ou centrômero ). Nessa região, a cromatina está bastante condensada e as sequências de DNA são altamente repetitivas (DNA satélite); -geralm. cada cromossomo contém apenas 1 centrômero e a posição deste permite a classificação morfológica dos cromossomos: 1. cromossomos metacêntricos : centrômero central, dividindo o cromossomo em dois braços com tamanhos iguais. 2. submetacêntricos : cromossomos com braços de tamanhos desiguais; 3. Cromossomos acrocêntricos : apresentam centrômero subterminal, deslocado para uma das extremidades. 4. cromossomos telocêntricos : apresentam centrômero terminal; -Cada cromátide apresenta uma estrutura proteica associada lateralmente ao centrômero: o cinetócoro - forma de disco; constituído por três discos empilhados. disco mais interno contata com o centrômero, enquanto no mais externo se ligam os microtúbulos que compõem o fuso de divisão. Os cinetócoros dirigem a migração dos cromossomos durante a divisão celular cinetócoro é a parte rosa; - determinados cromossomos tem constrições secundárias : estreitamentos que aparecem sempre no mesmo lugar, muito utilizadas na caracterização dos cromossomos; RON está presente nele - observa-se frequentemente, os nucléolos associados às constrições secundárias desses cromossomos; -telômeros: constituídos por sequências especiais de DNA ( bastante conservadas durante a evolução ) nas extremidades do cromossomo metafásico; impedem a adesão dos cromossomos entre si, mantendo assim sua estabilidade; sequências teloméricas são replicadas por uma enzima específica: a telomerase - capaz de manter constante o tamanho e as propriedades do telômero; ** em células transformadas ou em processo de envelhecimento: telomerase é alterada, os telômeros se modificam e encurtam; **Outro tipo de caracterização dos cromossomos é feito por técnicas especiais de tratamento e coloração, que levam ao surgimento de um padrão definido de segmentos ou bandas diferencialmente coradas ao longo do cromossomo: podem evidenciar diferenças na distribuição de componentes da cromatina ou, ainda, na composição química da cromatina, que ocorrem ao longo do cromossomo; ➢ Complemento cromossômico de uma espécie -Toda espécie animal e vegetal tem um complemento cromossômico característico, o qual se denomina cariótipo; -cariótipo: é o conjunto de características constantes dos cromossomos da espécie, quanto a número, tamanho e morfologia; -cromossomos são ordenados aos pares; -Nas células somáticas (diplóide/2n=varia muito entre as espécies) dos eucariontes, os cromossomos ocorrem aos pares, sendo um cromossomo do par de origem paterna e o outro de origem materna - Cada cromossomo de um par é homólogo ao outro - apresentam o mesmo tamanho, a mesma morfologia e a mesma sequência gênica. - número de cromossomos de uma espécie é constante e mantido durante os ciclos de divisão pelos quais a célula passa (Apenas durante a meiose, quando se formam os gametas (haploides), ocorre a redução à metade no número de cromossomos da célula ) ➢ Cromossomos gigantes -São os cromossomos politênicos, encontrados em células de larvas de insetos dípteros, e os cromossomos plumosos, encontrados em ovócitos de anfíbios - alguns tecidos que contêm em seus núcleos interfásicos - politênicos: encontrados em diferentes tecidos, como túbulos de Malpighi, glândulas salivares, trato digestivo, músculos, entre outros. - grandes- conteúdo em DNA é muito alto, podendo ultrapassar mil vezes o conteúdo do cromossomo normal do mesmo animal; -é formado por um grande número de filamentos paralelos, daí o nome de politênicos (polis = muito; tainia = fio, fita); -plumosos: se formam na prófase da meiose dos ovócitos de determinados animais, como anfíbios, alguns peixes e répteis - no diplóteno, quando os homólogos pareados estão se repelindo, mas ainda estão unidos pelos quiasmas -Cada cromossomo é constituído por duas cromátides, e, ao longo de cada cromátide, aparecem regiões de maior compactação da fibra, formando os cromômeros, que se alternam com regiões de menor compactação, intercromoméricas. -aspecto de uma pluma ou de uma escova para limpar tubo de ensaio; -Depois da prófase meiótica, os cromossomos plumosos voltam à sua morfologia meiótica normal -- Nesse sentido, diferenciam-se dos cromossomos politênicos, que são estáveis morfologicamente, apenas desintegrando-se, da mesma maneira que todo o tecido, durante a metamorfose do inseto;
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