Genetic diversity of dengue virus serotypes 1 and 2 in the State of en pt

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Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 45 (3): 297-300, maio-jun, 2012
INTRODUÇÃO
Artigo / Artigo
1. Laboratório de Entomologia Médica e Veterinária, Setor de Ciências Biológicas, Departamento de Zoologia, 
Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR.
Endereço para: Dr. Mario Antônio Navarro-Silva. Lab. EntomologiaMédica e Veterinária / Dept o Zoologia / 
UFPR. Caixa Postal 19020, 81531-980 Curitiba, PR, Brasil.
Fone: 55 41 3361-1640 
e-mail: mnavarro@ufpr.br
Recebido em 26/07/2011
Aceito em 11/10/2011
Diversidade genética dos sorotipos 1 e 2 do vírus da dengue no Estado do 
Paraná, Brasil, a partir de um fragmento da região da junção capsídeo / 
pré-membrana
Diversidade genética dos vírus dengue sorotipos 1 e 2, no Estado do Paraná, Brasil, baseada no 
fragmento da junção do gene capsídeo / pré-membrana
Ana Caroline Dalla Bona 1, Adriana Lacerda Twerdochlib 1 eMário AntônioNavarro-Silva 1
RESUMO
Introdução: A identificação precisa das variantes genéticas do enguevírus é importante para 
entender seus padrões de dispersão e virulência e para identificar as cepas responsáveis por surtos 
epidêmicos. Este estudo investigou as variantes genéticas do fragmento da região da junção 
capsídeo-pré-membrana nos sorotipos 1 e 2 do vírus da dengue (DENV1-2). Métodos:
Amostras de 11 municípios do Estado do Paraná, Brasil, foram fornecidas pelo Laboratório 
Central do Paraná. Eles foram isolados da linha de cultura celular C6 / 36 ( Aedes albopictus)
e foram positivos para imunofluorescência indireta. O ácido ribonucléico (RNA) extraído dessas amostras foi 
submetido à reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) e nested PCR. Resultados: O 
RT-PCR revelou que 4 das amostras estavam co-infectadas com ambos os serotipos. As sequências isoladas 
do DENV-1 foram 95-100% semelhantes às sequências de outras cepas do sorotipo 1 depositadas no 
GenBank. Da mesma forma, as sequências isoladas de DENV-2 foram 98-100% semelhantes a outras 
sequências de sorotipo 2 no GenBank. De acordo com nossa árvore de união de vizinhos, todas as cepas 
obtidas neste estudo pertenciam ao genótipo VofDENV-1. As cepas DENV-2, ao contrário, pertenciam aos 
genótipos americanos / asiáticos. Conclusões: O monitoramento de cepas circulantes é uma ferramenta 
importante para detectar a migração de subtipos de vírus envolvidos nas epidemias de dengue.
Palavras-chave: Infecção concomitante. RT-PCR. Flavivirus. Variação genética.
RETOMAR
Introdução: A identificação da variante genética do vírus da dengue é importante para 
compreender a dispersão, virulência e identificação das cepas responsáveis pelas epidemias. 
O objetivo da pesquisa foi investigar uma variação genética do fragmento da junção do gene 
capsídeo / pré-membrana dos sorotipos 1 e 2. Métodos: Amostras de onze municípios do 
Estado do Paraná, Brasil, foram cedidas pelo Laboratório Central do Paraná e consistiam em 
solicitar a cultura de células da linhagemC6 / 36 ( Aedes albopictus), positivos para técnica de 
imunofluorescência indireta. O Ácido ribonucleico ( RNA) esse agente foi extraído, seguido da 
transcrição reversa, reação em cadeia da polimerase (PCR) e aninhado PCR. Resultados:
Co-infecção por DENV-1 e 2 (vírus da dengue 1 e 2) foi observada em quatro pacientes, através da 
técnica Reação em cadeia da polimerase-transcriptase reversa ( RT-PCR). Para o DENV-1 a 
porcentagem de similaridade variou de 95 a 100% comparando com as cepas do Genbank. Para o 
DENV-2 a porcentagem de similaridade variou de 98 a 100%. De acordo com o cladograma gerado, 
todas as cepas deste estudo se agruparam no genótipo V para DENV-1. Para o oDENV-2 foi 
encontrada uma cepa referente ao genótipo asiático / americano. Conclusões:
Omonitoramento das cepas circulantes torna-se uma ferramenta importante na detecção da 
migração dos subtipos do vírus da dengue afetada em epidemias.
Palavras-chaves: Infecção simultânea. RT-PCR. Flavivirus. Variação genética.
O vírus que causa a dengue pertence ao
o genoma contém uma estrutura de leitura aberta 
(ORF) que codifica 3 proteínas estruturais e 7 não 
estruturais. As proteínas estruturais são: capsídeo (C), 
membrana (M) e envelope (E); e as proteínas não 
estruturais são NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B,
e NS5 1
O vírus da dengue exibe diversidade genética 
substancial, principalmente na existência de 4 sorotipos 
distintos e vários genótipos. As tentativas de identificar essas 
variantes genéticas foram feitas sequenciando certas regiões 
do genoma viral. Por exemplo, a proteína E, que é o principal 
alvo da seleção de vírus na natureza, foi sequenciada com 
frequência 2-4. No entanto, Singh e Seth 5 sugeriram que 
fragmentos da região de junção capsídeo-pré-membrana 
(CprM) podem ser uma alternativa mais rápida e barata para 
sequenciar regiões curtas. Desde então, o CprM tem sido 
usado por vários autores 6-8.
Genes que codificam para proteínas não estruturais 
também foram sequenciados e usados em estudos 
de filogenia 9 Verificar a diversidade molecular do vírus 
da dengue é importante para avaliar o impacto 
dessas variantes genéticas na população humana, 
bem como a virulência, distribuição e origem das 
várias cepas.
Neste estudo, caracterizamos geneticamente o 
fragmento da região da junção capsídeo-pré-membrana 
do vírus da dengue em pacientes com teste positivo para 
dengue em 2010.
o gênero Flavivirus (Flaviviridae). Seu RNA de 11kb
MÉTODOS
As amostras, fornecidas pelo Laboratório Central do 
Paraná, foram isoladas da linhagem de cultivo celular C6 / 36 ( Aedes 
albopictus) e foram positivos para imunofluorescência 
indireta (IFA). As amostras de sangue humano foram 
coletadas de
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RESULTADOS
Bona ACD et al - Diversidade genética do vírus da dengue
TABELA 1 - Amostras de pacientes de 11 municípios do Estado de Paraná, Brasil, com o 
vírus da dengue detectado por RT-PCR e imunofluorescência indireta.
RT-PCR
Região
Norte
Amostras
Maringá
Assaí
Planaltina do Paraná
Sertanópolis
Alvorada do Sul
Pato Bragado
Realeza
Toledo
SãoMiguel do Iguaçu DENV-1 / DENV-2
Nova Aurora DENV-1 / DENV-2
Foz do Iguaçu DENV-1
RT-PCR: reação em cadeia da polimerase-transcriptase reversa; SE UM: ensaio de imunofluorescência;
DENV: sorotipo do vírus da dengue.
não diluído
DENV-2
DENV-1
DENV-1
DENV-1
DENV-2
DENV-1 / DENV-2
DENV-1 / DENV-2
DENV-2
diluído 1/100
DENV-2
DENV-1
DENV-1
DENV-1
DENV-2
DENV-2
DENV-2
DENV-2
DENV-1 / DENV-2 DENV-1
DENV-1 / DENV-2 DENV-1
DENV-1 DENV-1
SE UM
DENV-2
DENV-1
DENV-1
DENV-1
DENV-2
DENV-2
DENV-2
DENV-2
ocidental
Março-maio de 2010, de casos autóctones na
Estado do Paraná, Brasil. Até junho de 2010, 147 (37%) 
municípios apresentavam 15.012 casos autóctones de 
dengue 10 Os municípios foram amostrados na região 
oeste do Estado do Paraná (FozdoIguaçu,
25 ° 32 48 ″ S, 54 ° 35 17 ″ W; São Miguel do Iguaçu, 25 
° 20 ″ 49 ″ S, 54 ° 14 ″ 20 ″ W; Realeza, 25 ° 48 45 ″ S, 53 
° 33 45 ″ W; Toledo, 24 ° 41 15 ″ S, 53 ° 41 15 ″ W; Pato 
Bragado, 24 ° 41 15 ″ S, 54 ° 11 ″ 15 ″ W; e Nova 
Aurora, 24 ° 33 ″ 45 ″ S, 53 ° 18 ″ 45 ″ W) e região norte 
(Maringá, 23 ° 26 ″ 15 ″ S, 51 ° 56 ″ 15 ″ W;
Assaí, 23 ° 18 45 ″ S, 50 ° 48 45 ″ W; Planaltina do 
Paraná, 23 ° 03′45 ″ S, 52 ° 56′15 ″ W; Sertanópolis, 
23 ° 03 ″ 45 ″ S, 51 ° 03 ″ 45 ″ W; e Alvorada do Sul, 
22 ° 48′45 ″ S, 51 ° 11′15 ″ W) ( Figura 1).
A extração de RNA do sobrenadante celular foi 
conduzida usando um kit QIAmp Viral Mini (Qiagen, EUA), 
seguindo as instruções do fabricante
Lanciotti et al. 11 Para obter cDNA, 2.000ng
de RNA viral e 1μL do primer D2 (50pmol) foram colocados em um 
termociclador por 5min a 70 ° C. A amostra foi mantida em gelo e 
foram adicionados 5µL de tampão 5 ×, 0,5µL de dNTPs (200mM) e 20U 
de transcriptase reversa AMV (Promega). O volume da mistura foi 
aumentado para 25µL com a adição de água tratada com DEPC (0,1%). 
A amostra foi mantida em termociclador por 90 min a 42 ° C e 15 min a 
70 ° C. O controle negativo continha água emvez de RNA.
A reação de amplificação foi conduzida usando 3µL de cDNA,
2,5 µL de 10 × tampão, 1 µL de iniciador D1 (20pmol), 1 µL de iniciador D2
(20pmol), 1,5µL de MgCl 2 ( 25 mM), 0,5 µL de dNTPs (200 mM) e 3U 
de AmpliTaq Gold DNA polimerase (Applied Biosystems). O
o volume da mistura foi levado a 25µL pela adição de água tratada com 
DEPC (0,1%). O seguinte programa de ciclagem foi usado para obter os 
produtos: 35 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 1 min e 72 ° C por 2 min.
Para PCR aninhado, 3 µL da primeira reação de amplificação 
(não diluído e diluído 1/100), 2,5 µL de tampão 10 ×, 1 µL de 
iniciador D1 (20pmol), 1 µL de cada iniciador TS1, TS2, TS3 e TS4
(20pmol), 1,5 µL de MgCl 2 ( 25 µM), 0,5 µL de dNTPs (200 µM) e 
3U de AmpliTaq Gold DNA polimerase (Applied Biosystems)
foram combinados. A mistura foi levada a 25 µl por adição de água 
tratada com DEPC (0,1%). O seguinte programa de ciclagem foi 
usado para obter os produtos: 20 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 
1 min e 72 ° C por 2 min. Os produtos amplificados foram 
visualizados em gel de agarose a 2%.
A reação de purificação foi realizada usando um kit de 
purificação de PCR QIAquick (Qiagen) de acordo com as instruções 
do fabricante. As amostras foram enviadas ao Centro de Estudos do 
Genoma Humano (Universidade de São Paulo-São Paulo / SP) para 
sequenciamento em Analisador de DNA ABI 3730 (Applied 
Biosystems). As sequências de consenso foram obtidas usando o 
pacote Staden versão 1.5 12; alinhamento de sequência e tradução 
para aminoácidos foram realizados na versão BioEdit
7.0.0 13, uma ferramenta ClustalW 14 As sequências obtidas em nossas 
amostras foram comparadas com 39 sequências de várias partes de
theworld disponível no GenBank. As análises filogenética e de 
similaridade de sequência foram realizadas usando o método de 
neighbour-joining implementado pelo programa Mega 4 15, usando o 
modelo de 2 parâmetros Kimura e 1.000 replicações de bootstrap.
protocolo. Os primers eram os mesmos que em FIGURA 1 - Municípios do Estado do Paraná (Brasil) com suspeita de sangue infectado com
o vírus da dengue foi coletado.
A RT-PCR identificou 4 amostras de sangue humano que foram 
co-infectadas com DENV-1 e -2. Quando as amostras foram amplificadas 
com o primeiro produto de PCR sem diluição, 2 bandas de diferentes 
intensidades foram visualizadas no gel, mostrando os sorotipos com maior 
e menor número de cópias. No entanto, quando o primeiro produto de PCR 
foi diluído 100 vezes, apenas uma banda foi detectada, indicando o sorotipo 
predominante ( tabela 1 e Figura 2).
Análise das sequências de 368 pb obtidas a partir das cepas 
CprMrevealed2 do DENV-1 com 14 sítios polimórficos: GenBank: 
JN086990 (Foz do Iguaçu eSertanópolis); GenBank: JN086991 
(Planaltina do Paraná) A análise das sequências de 360 pb obtidas do 
mesmo gene revelou 1 cepa do DENV-2: GenBank: JN086992 (Alvorada 
do Sul e Pato Bragado). As 2 cepas DENV-1 foram distinguidas por 13 
transições e 1 transversão.Transições: G ↔ A (locais 207 e 351); T ↔ C 
(locais 81, 267, 306, 309 e 360); UMA ↔ G (local 180); C ↔ T (locais 69, 
276, 297, 350 e 354). Transversão: G ↔ C (local 264). As alterações foram 
observadas nos códigos 69 (Met → Ile ) e 117 (Ala → Val ) de DENV-1, 
substituições de tonucleotídeo correspondentes
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Rev Soc BrasMed Trop 45 (3): 297-300, maio-junho de 2012
FIGURA 2 - Gel de agarose (2%) M: escada de 100 pb (Amresco); 1-4Amostras de RNA 
não amplificado; 5: não diluído (coinfecção com DENV-1e-2); 6: diluído 1/100 
(DENV-2); 7-8: controle negativo; 9: não diluído (DENV-1); 10: diluído 1/100 (DENV-1); 
11: não diluído (DENV-2); 10: diluído 1/100 (DENV-2). DENV-1 e DENV-2: vírus da 
dengue sorotipos 1 e 2, respectivamente.
em 207 e 350 e 351, respectivamente. As substituições de aminoácidos 
ocorreram entre aminoácidos com propriedades bioquímicas semelhantes.
As sequências do DENV-1 obtidas por nós foram 95-100% semelhantes às 
sequências das outras cepas do sorotipo 1 depositadas no GenBank. Da mesma 
forma, nossas sequências de DENV-2 foram 98-100% semelhantes a outras 
sequências de sorotipo 2 naquele banco de dados. De acordo com nossa árvore 
de união vizinha, todas as cepas obtidas neste estudo pertencem ao genótipo V 
do DENV-1. A cepa DENV-2 pertencia aos genótipos americanos / asiáticos ( Figuras 
3 e 4).
FIGURA 3 - Árvore de união de vizinhos para o fragmento da região de junção 
capsídeo-pré-membrana (CprM) de DENV-1. A árvore foi construída usando o modelo de parâmetro 
Kimura 2 e inclui sequências obtidas por nós e do GenBank. Os valores de bootstrap (1.000 réplicas) 
podem ser encontrados acima dos nós principais.
FIGURA 4 - Árvore de união vizinha do fragmento da região de junção capsídeo-pré-membrana 
(CprM) de DENV-2. A árvore foi construída usando o modelo de parâmetro Kimura 2 e inclui 
sequências obtidas por nós e do GenBank. Os valores de bootstrap (1.000 réplicas) podem ser 
encontrados acima dos nós principais.
DISCUSSÃO
A coinfecção com múltiplos sorotipos do vírus da dengue é 
comum em áreas hiperendêmicas onde múltiplos sorotipos circulam 6,16,
mais especialmente quando há uma alta densidade de vetores e 
pessoas suscetíveis à dengue. Infecção concomitante com DENV-1 e 2 
em sangue humano foi relatada no Brasil por Rocco et al. 17, Santos et 
al. 18, e Cunha et al. 19 Além disso, foram relatadas infecções simultâneas 
por diferentes vírus da dengue em mosquitos 20 Fêmea
A. aegypti pode ser capaz de transmitir os dois vírus simultaneamente 17
Pessanha et al. 21 detectou A. aegypti larvas que eram positivas para mais de 
1 sorotipo, mostrando também que a infecção dupla pode ser passada para 
a prole via transmissão transovariana.
A técnica de RT-PCR utilizada em nosso estudo foi mais eficiente 
do que a IFA para detectar a coinfecção. Testes repetidos confirmaram 
esses resultados obtidos com RT-PCR. Portanto, se tivéssemos usado 
apenas IFA neste estudo, a detecção de sorotipos teria sido 
subestimada.
A substituição de metionina e alanina (aminoácido 69) por isoleucina e 
valina (aminoácido 117), respectivamente, observada em nossos resultados, 
havia sido identificada previamente na cepa JN086991 do DENV-1 isolada 
em amostras do Rio de Janeiro (GenBank: HQ026762) e São Paulo 
(GenBank: GU131863). As 2 cepas identificadas agrupadas com outras 
sequências do genótipo V, o único genótipo em circulação no Brasil até 
agora 22 Em 2001, Santos et al. 23 também sequenciei uma terceira coloração 
no Estado do Paraná, além das 2 cepas encontradas por nós, totalizando 3 
cepas naquele estado.
Dois subclados, A e B, agrupados na árvore de junção de vizinhos das 
sequências DENV-1 com suporte de bootstrap de 96%. A cepa DENV-1 JN086990 
está mais intimamente relacionada às cepas isoladas na Guiana Francesa 
(GenBank: EU482591), Venezuela (GenBank: EU518605) e Porto Rico (GenBank: 
FJ850103). O JN086991 DENV-1
cepa do subclade B agrupada com as cepas brasileiras isoladas de 
2008-2010. As cepas do genótipo V do DENV-1 são agrupadas em 2 
ramos filogenéticos diferentes, refletindo uma divergência anterior.
A cepa DENV-2 JN086992 agrupou-se com os genótipos 
americanos / asiáticos com 100% de suporte bootstrap e foi a 
mais próxima da cepa da Guiana Francesa (GenBank: EU518604) 
que foi isolada em 2006. O genótipo americano foi associado a 
cepas menos virulentas. Pode ter sido substituído pelo genótipo 
do sul da Ásia, uma vez que não foi isolado onde o genótipo do sul 
da Ásia atualmente circula. TheAmerican / AsianDENV-2
AF311956.1 Brasil 1997
Subclade A
Subclade B
Genótipo V
AF514885.3 Argentina 2000
AF513110.1 Brasil Paraná 2001 
AB519681.1 Brasil Brasília 2001 
GQ868570.1 Colômbia 2008
F937644.1 Nicarágua 2009
HQ166037.1 México 2008
HQ026760.1 Brasil
JN086990 Brasil Paraná 2010 
EU482591.1 Guiana Francesa 2008 
EU518605.1 Venezuela 2008
FJ850103.1 Puerto Rico 2006
AF514878.2 Paraguai 2000
FJ850090.1 Brasil 2007
FJ850084.1 Brasil 2005
JN086991 Brasil Paraná2010
HQ026762.1 Brasil Rio de Janeiro 2010 
GU131863.1 Brasil São Paulo 2008
EF457905.1 Genótipo III
AB195673.1 Genótipo IV
AF180817.1 Genótipo II
AF309641.1 Genótipo I
0,005
50
39
94
71
30
54
96
66
9151
49
63
54
35
42
57
51
44
HQ012528.1 Brasil Rio de Janeiro 2008 
EU076554.1 Paraguai 2007
HQ012526.1 Brasil Rio de Janeiro 2007 
FJ898453.1 Ilhas Virgens 2005
HM181971.1 Brasil São Paulo 2008 
HQ012529.1 Brasil Rio de Janeiro 2009 
AB122022.1 República Dominicana 2001 
GQ199892.1 Jamaica 2007
EU518604.1 Guiana Francesa 2006 
JN086992 Brasil Paraná 2010
HQ012531.1 Brasil Rio de Janeiro 2010
FJ639822.1 Venezuela 2006
EU687216.1 EUA Porto Rico 2005 
FJ024477.1 Colômbia 2004
FJ898439.1 México 2008
HQ541792.1 Nicarágua 2008
AF276619.1 Genótipo cosmopolita
AF100465.1 genótipo americano
Genótipo americano / asiático
AJ487271.1 genótipo asiático
AF204178.1 Genótipo Asian II
0,01
74
88
55
100
20
40
51
86
54
29
25
300
AGRADECIMENTOS
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
CONFLITO DE INTERESSES
AJUDA FINANCEIRA
REFERÊNCIAS
O genótipo predominou no Brasil durante seus 19 anos de 
circulação (1991-2008). Foi sugerida uma associação entre certos 
genótipos DENV-2 e febre hemorrágica da dengue 24,25.
Estudos evolutivos têm mostrado que a diversidade genética do 
vírus da dengue está aumentando e que mutações são responsáveis 
por isso. A diversidade genética nesse vírus também pode ser gerada 
por recombinação. Para que isso aconteça, diferentes genótipos do 
mesmo sorotipo viral toco-infectam o mesmo indivíduo, e os genomas 
que infectam a mesma célula forma híbrida de molécula de RNA. 
Infecção simultânea de A. aegypti por diferentes vírus durante surtos e 
epidemias, resultando em uma alta taxa de replicação viral, permitem 
o surgimento de alterações genéticas. O aumento da diversidade 
genética do vírus da dengue pode ter consequências graves, como 
vírus com uma gama ampliada de propriedades patogênicas e maior 
transmissibilidade e virulência 26-28.
A incidência de subtipos do vírus da dengue, combinada com vários 
sorotipos circulando em um determinado local, pode gerar variação 
genética dentro dos sorotipos do vírus da dengue. Estudos que monitorem 
e sequenciem os sorotipos circulantes são importantes para rastrear esses 
eventos genéticos, a fim de diagnosticar as principais epidemias e a 
migração geográfica dessas cepas.
Agradecemos a Anaclete Fellini, Secretaria de Estado da Saúde do 
Paraná, Laboratório Central do Paraná, para fornecer o indireto
isolados de cultura de células positivas para fluorescência.
ConselhoNacional dePesquisa eDesenvolvimento ( CNPq), processo
Tecnologia e Ensino Superior ( SETI).
# 305038 / 2009-5 e # 140231 / 2008-0 e Secretaria da Ciência,
1 GuzmanMG, HalsteadSB, ArtsobH, BuchyP, Farrar J, GublerDJ, et al. Dengue: uma 
ameaça global contínua. Nat RevMicrobiol 2010; 8: 7-16.
Pandey BD, Morita K, Hasebe F, Parquet MC, Igarashi A. Evolução molecular, 
distribuição e relação genética entre os vírus da dengue 2 isolados de 
diferentes gravidades clínicas. Sudeste Asiático J Trop Med Public Health 
2000; 31: 66-72.
AraújoJM, NogueiraRM, SchatzmayrHG, ZanottoPM, BelloG. Filogeografia e 
história evolutiva do vírus da dengue tipo 3. Infect Genet Evol 2009; 9: 
716-725.
Ito M, Takasaki T, Kotaki A, Tajima S, Yuwono D, Rimal HS, et al. Análises 
moleculares e virológicas do vírus da dengue responsável pelo surto de dengue no 
leste de Timor em 2005. Jpn J Infect Dis 2010; 63: 181-184.
SinghUB, SethP. Uso do sequenciamento de nucleotídeos dos fragmentos de cDNA 
genômico da região da junção capsídeo / pré-membrana para epidemiologia 
molecular do vírus da dengue tipo 2. Sudeste Asiático J Trop Med Public Health 
2001; 32: 326-335.
WangWK, ChaoDY, LinSR, KingCC, ChangSC. Infecções simultâneas por dois sorotipos do 
vírus da dengue entre pacientes com dengue em Taiwan. JMicrobiol Immunol Infect 2003; 
36: 89-95.
2
3
4
5
6
7 Kukreti H, Chaudhary A, Rautela RS, Anand R, Mittal V, Chhabra M, et al. 
Surgimento de uma linhagem independente do vírus da dengue tipo 1 (DENV-1) e 
sua co-circulação com o DENV-3d predominante durante o surto de febre da 
dengue de 2006 em Delhi. Int J Infect Dis 2008; 12: 542-549.
AnoopM, IssacA, MathewT, PhilipS, KareemNA, UnnikrishnanR, et al. Caracterização 
genética de sorotipos do vírus da dengue causando infecção simultânea em um 
surto em Ernakulam, Kerala, sul da Índia. Indian J ExpBiol 2010; 48: 849-857.
Zhang JL, Jian R, Wan YJ, Peng T, An J. Identificação e análise filogenética do 
vírus DENV-1 isolado em Guangzhou, China, em 2002. Dengue Bulletin 2004; 
28: 135-144.
Secretaria de Estado da Saúde do Paraná (SESA). Boletim informativo dengue
n.º 6/2010. Curitiba: Superintendência de Vigilância em Saúde. [Citado em 25 de 
julho de 2011] Disponível em: http://www.paranacontradengue.pr.gov.br/modules/ 
conteudo / conteudo.php? Conteudo = 3 /
Lanciotti RS, Calisher CH, Gubler DJ, Chang GJ, Vorndam AV. Detecção e tipagem 
rápidas de vírus da dengue a partir de amostras clínicas por meio da Reação em 
Cadeia da Transcriptase Reversa-Polimerase. J ClinMicrobiol 1992; 30: 545-551.
Staden R, Juiz DP, Bonfield JK. Métodos de montagem sequencial e acabamento. 
Methods BiochemAnal 2001; 43: 303-322.
Hall TA. BioEdit: um editor de alinhamento de sequência biológica amigável e 
programa de análise para Windows 95/98 / NT. Nucleic Acids Symp Ser 1999; 41: 
95-98.
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. Clustal W: melhorando a sensibilidade do 
alinhamento de sequência múltipla progressiva por meio de ponderação de sequência, 
penalidades de gap específicas da posição e escolha de matriz de peso. Nucl Acids Res 
1994; 11: 4673-4680.
TamuraK, Dudley J, NeiM, Kumar S.MEGA4: software MolecularEvolutionaryGenetics 
Analysis (MEGA) versão 4.0. Mol Biol Evol 2007; 24: 1596-1599.
Gubler DJ. Dengue e febre hemorrágica da dengue. Clin Microbiol Rev 1998; 
11: 480-496.
Rocco IM, Barbosa ML, Kanomata EHN. Infecção simultânea por dengue 1 e 
2 em paciente brasileira. Rev Inst Med Trop São Paulo 1998; 40: 151-154.
SantosCLS, BastosMAA, SallumMAM, Rocco IM. Caracterização molecular de 
vírus da dengue tipo 1 e 2 isolados de infecção humana concorrente. Rev 
Inst Med Trop São Paulo 2003; 45: 11-16.
Cunha AMM, Caiaffa WT, Oliveira CDL, Kroon EG, Pessanha JEM, Lima JA, et al. 
Fatores associados à infecção pelo vírus dengue no município de Belo Horizonte, 
estadodeMinasGerais, Brasil: características individuais ediferenças intra-urbanas. 
Epidemiol Serv Saude 2008; 17: 217-230.
Cáceres RO. Detecção rápida de serotipos do vírus da dengue no mosquito
Aedes aegypt eu. Rev PeruMed Exp Salud Publica 2003; 20: 156-158.
Pessanha JEM, Caiaffa WT, Cecílio AB, Iani FCM, Araújo SC, Nascimento JC, et al. 
Cocirculação de dois sorotipos do vírus da dengue em amostras individuais e 
agrupadas de Aedes aegypti e Aedes albopictus larvas. Rev Soc Bras Med Trop 
2011; 44: 103-105.
Goncalvez AP, Escalante AA, Pujol FH, Ludert JE, Tovar D, Salas RA, et al. Diversidade 
e evolução do gene do envelope do vírus da dengue tipo 1. Virology 2002; 303: 
110-119.
SantosCND, RochaCFS, CordeiroM, FragosoSP, ReyF, DeubelV, et al. A análise 
genômica do vírus da dengue tipo 1 isolado entre 1990 e 2001 no Brasil revela uma 
notável conservação das proteínas estruturais, mas diferenças de aminoácidos nas 
proteínas não estruturais. Virus Res 2002; 90: 197-205.
Rico-Hesse R, Harrison LM, Salas RA, Tovar D, Nisalak A, Ramos C, et al. Origens dos 
vírus da dengue tipo 2 associados ao aumento da patogenicidade nas Américas. 
Virology 1997; 23: 244-251.
CruzACR, GallerR, SilvaEVP, SilvaMO, CarneiroAR, RosaEST, et al. Epidemiologia 
molecular dos sorotipos 2 e 3 do vírus da dengue isolados no Brasil de 1991 a
2008. Rev Pan-Amaz Saude 2010; 1: 25-34.
WorobeyM, RambautA, HolmesEC. Recombinação intra-sorotípica generalizada em 
populações naturais do vírus da dengue. PNAS 1999; 96: 7352-7357.
Holmes EC, Burch SS.As causas e consequências da variação genética no vírus da 
dengue. Trends Microbiol 2000; 8: 74-77.
Weaver SC, Vasilakis N. Evolução molecular dos vírus da dengue: Contribuições da 
filogenética para compreender a história e epidemiologia da doença arboviral 
preeminente. Infect Genet Evol 2009; 9: 523-540.
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
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27
28
Bona ACD et al - Diversidade genética do vírus da dengue