Relatório IC Vinícius PUB-final

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RELATÓRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA 
 
 
 
 
Avaliação de processos de fermentação e co-fermentação em reatores 
de coluna visando à produção de etanol a partir de bagaço de cana-de-
açúcar 
 
 
 
Aluno: Vinícius Pereira Shibukawa 
Orientador: Prof. Dr. Júlio César dos Santos 
 
 
 
 
Lorena 
Agosto 2018 
 
 
 
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RESUMO 
 
A obtenção de etanol 2G a partir de biomassa lignocelulósica é um assunto 
de grande interesse nacional, em especial considerando materiais como o bagaço 
de cana-de-açúcar, o qual é abundante no país e cujo uso possibilitaria aumento na 
produção do álcool sem necessidade de expansão da fronteira agrícola. Nesse 
contexto, é importante o estudo de condução das diferentes etapas do processo em 
biorreatores passíveis de ampliação de escala. Neste trabalho, avaliou-se a 
influência de condições de hidrólise e fermentação ou co-fermentação em reatores 
de coluna, visando à produção de etanol 2G a partir de bagaço de cana-de-açúcar. 
Inicialmente, o bagaço foi pré-tratado com solução de sulfito alcalino e 
posteriormente submetido à hidrólise enzimática em reator de coluna de leito fixo, 
carregado com diferentes teores de sólidos (9%, 12,5% e 16%). O leito do reator foi 
composto por bagaço pré-tratado e uma solução de celulases e xilanases foi 
recirculada através do sistema. Para o maior carregamento de sólidos, obteve-se um 
rendimento de hidrólise de glucana e de xilana de 66 e 62%, respectivamente, 
enquanto que, para o menor carregamento de sólidos, estes valores foram de 72% e 
75%, respectivamente. No processo fermentativo, realizado em coluna de bolhas, 
avaliou-se a influência da aeração no processo, realizando-se experimentos com 
0,3 vvm, 0,5 vvm e 0,7 vvm e empregando-se dois microrganismos distintos, 
Saccharomyces cerevisiae IR2 (cepa floculante) ou Scheffersomyces stipitis NRRL-
Y7124. Os resultados obtidos indicaram que o processo foi favorecido sob aeração 
de 0,5 vvm, para ambas as leveduras empregadas. Usando a levedura S. cerevisiae, 
obteve-se um fator de rendimento (Yp/s) de 0,40 g/g e uma produtividade 
volumétrica (Qp) de 1,58 g.L-1.h-1, em 24h. O uso da levedura S. stipitis resultou, em 
48 h, em Yp/s de 0,31 g.g-1 e Qp de 0,62 g.L-1.h-1. O potencial do sistema foi 
demonstrado, em especial considerando aspectos como a simplicidade de 
construção do biorreator. 
 
 
 
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ÍNDICE 
 
INTRODUÇÃO..........................................................................................................................4 
OBJETIVOS..............................................................................................................................6 
MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................................7 
RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................................11 
CONCLUSÕES.......................................................................................................................16
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................................17 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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1. INTRODUÇÃO 
 
Atualmente, o mercado de biocombustíveis está em expansão, 
particularmente considerando-se fatores como o contínuo aumento do consumo 
energético mundial, a necessidade da redução de emissão de poluentes e 
perspectivas de esgotamento das reservas de petróleo em médio prazo (GAURAV et 
al., 2017). Dentre os biocombustíveis, destaque tem sido dado ao etanol obtido a 
partir de materiais lignocelulósicos, o chamado “etanol de segunda geração”. Este 
tem recebido grande atenção devido a sua importância e valorização por razões 
sociais, estratégicas, econômicas e ambientais (MATTEI, 2017). 
 Os biocombustíveis obtidos a partir de materiais lignocelulósicos 
apresentam vantagens como a grande disponibilidade de matéria prima, 
possibilitando sua produção sem competição com a cadeia de obtenção de 
alimentos ou necessidade de expansão da fronteira agrícola. Além disso, o balanço 
global de carbono demonstra seu elevado potencial para a redução da emissão de 
CO2 na atmosfera (BNDES e CDEE, 2008; GONZALEZ et al., 2012). 
 Nos últimos anos, esforços têm sido conduzidos para viabilização de 
biorrefinarias de produção de etanol e outros compostos a partir de materiais 
lignocelulósicos (SILVA et al., 2010; TETE, 2016). Atualmente, há inclusive algumas 
plantas demonstrativas e empresas iniciando a produção de etanol de segunda 
geração em escala industrial (GRANBIO, 2014; SANTOS et al., 2016). No entanto, 
há muitos gargalos no processo e estudos são necessários para favorecer sua 
viabilidade. 
 As tecnologias em desenvolvimento incluem etapas de pré-tratamento e 
 
 
 
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hidrólise das frações carboidrato visando a liberar açúcares para o processo 
fermentativo (AGBOR et al., 2011; GALBE e ZACCHI, 2012). O objetivo do pré-
tratamento é favorecer a hidrólise enzimática da celulose presente no material. A 
hemicelulose, por sua vez, pode também ser hidrolisada na etapa de pré-tratamento 
ou na etapa enzimática, dependendo da tecnologia selecionada. Neste caso, quando 
são usados, como matéria prima, resíduos e subprodutos agrícolas, liberam-se 
pentoses no hidrolisado. Para a fermentação destas, podem-se empregar micro-
organismos geneticamente modificados ou leveduras capazes de fermentar 
pentoses naturalmente, como Candida shehetaee e Scheffersomyces stipitis 
(ANTUNES et al., 2016; BIDEAUX et al., 2016). 
 Diversas opções têm sido avaliadas para a condução das etapas biológicas 
do processo, ou seja, hidrólise enzimática e fermentação (Terán-Hillares et al.,2017). 
Visando a sua aplicação industrial, no entanto, são necessários estudos de opções 
de processo e reatores que favoreçam sua aplicação em larga escala. Entre as 
opções de biorreator, sistemas de colunas são interessantes, apresentando 
vantagens como simplicidade de construção e baixo custo (Terán-Hillares et 
al.,2017). 
 Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo a avaliação da 
influência de condições de hidrólise e fermentação de hexoses ou co-fermentação 
de hexoses e pentoses em reatores de coluna, visando à produção de etanol 2G a 
partir de bagaço de cana-de-açúcar. Hidrólise enzimática foi conduzida em sistemas 
com leito fixo empregando diferentes quantidades iniciais de sólidos no reator e 
fermentação foi realizada em colunas de bolhas empregando células de 
Saccharomyces cerevisiae ou Scheffersomyces stipitis. 
 
 
 
 
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2. OBJETIVOS 
 
2.1 Objetivos gerais 
● Avaliação da produção de etanol a partir de bagaço de cana-de-açúcar pré-
tratado por sulfito alcalino, empregando biorreatores de coluna para a 
hidrólise enzimática e fermentação, utilizando os microrganismos 
Saccharomyces cerevisiae e Scheffersomyces stipitis. 
 
2.2 Objetivos específicos 
● Avaliação da influência do carregamento inicial de sólidos no biorreator de 
coluna com leito fixo na hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar 
pré-tratado por sulfito alcalino; 
● Avaliação da influência da aeração no processo de fermentação de 
hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar empregando células da levedura 
floculante Saccharomyces cerevisiae IR2; 
● Avaliação da influência da aeração no processo de co-fermentação de 
hexoses e pentoses presentes em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar 
empregando células da levedura Scheffersomyces stipitis NRRL-Y7124. 
 
 
 
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3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
3.1 Bagaço de cana-de-açúcar 
 
 O bagaço de cana-de-açúcar utilizado neste trabalho foi doado pela Usina 
Vale Onda Verde, localizada no município de Onda Verde/SP. A matéria-prima foi 
seca ao sol para reduzir a umidade até cerca de 10% e assim evitar contaminação 
microbiana durante o período de estocagem. Na etapa subsequente, o bagaço foi 
moídoem moinho de martelo marca Benedetti, modelo Dupla 270 (Moinho Benedetti 
Ltda., Pinhal-SP). A granulometria do bagaço foi analisada por meio de um conjunto 
de peneiras padrão da série Tyler montadas em um agitador de peneiras da Bertel 
Indústrias Metalúrgicas Ltda.(Caieiras-SP), sendo utilizadas nos experimentos 
partículas maiores que 0,60mm (28 MESH). O bagaço moído foi caracterizado com 
relação a sua composição em celulose, hemicelulose, extrativos, lignina e cinzas. 
 
3.2 Pré-tratamento 
 
 O pré-tratamento foi realizado em um reator de coluna com 460 mm de 
altura e 220 mm de diâmetro interno, seguindo a metodologia estabelecida por 
Mendes et al. (2015). 
 
 
 
 
 
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3.3 Hidrólise enzimática 
 
 A hidrólise enzimática das frações carboidrato do bagaço de cana-de-açúcar 
foi realizada em biorreator de coluna com diâmetro interno igual a 2,5cm e altura de 
50 cm, em um sistema montado conforme o esquema simplificado apresentado na 
Figura 1. 
O biorreator foi preenchido com diferentes razões sólido/líquido iniciais (9%, 
12,5% e 16%). O meio reacional (volume total de 250 mL) era constituído de solução 
de preparações comerciais de celulases e foi recirculado no sistema com uma vazão 
de 23 mL/min com auxílio de uma bomba peristáltica. A solução de enzimas era 
composta por tampão citrato de sódio 50 mM pH 4,8 e uma preparação comercial de 
celulase de Trichoderma longibrachiatum (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil), com 
uma carga enzimática de 16,4 FPU/g de bagaço, além de 4,4 U/g de bagaço de uma 
preparação de β-glicosidase (NS50012, Novozymes Latin America Ltda., Araucária, 
PR, Brasil). O processo foi mantido por 24 h a 50 ºC, sendo retiradas amostras 
periódicas para análise do teor de açúcares por HPLC. 
 
Figura 1: Esquema simplificado do sistema com reator de coluna empregado na hidrólise enzimática 
do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por sulfito alcalino. 
 
 
 
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3.4 Fermentação 
 
 Os microrganismos utilizados foram Saccharomyces cerevisiae IR2 e 
Scheffersomyces stipitis NRRL-Y7124, ambos disponíveis no Departamento de 
Biotecnologia da Escola de Engenharia de Lorena-Universidade de São Paulo, e 
armazenados em Ágar extrato de malte a 4ºC. O preparo do inóculo foi feito em 
frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 200 mL de meio composto por 30 g/L de 
glicose (para S. cerevisiae) ou xilose (para S. stipitis), 10 g/L de peptona 
bacteriológica e 10 g/L de extrato de levedura. O cultivo foi realizado em um agitador 
rotativo por 24h a 30 ºC e 200 rpm. Posteriormente, as células foram recuperadas 
por centrifugação a 2000g por 15 min, lavadas e ressuspensas em água destilada 
para obtenção de uma suspensão com elevada densidade celular, a qual foi utilizada 
como inóculo. 
O processo fermentativo foi conduzido na mesma coluna utilizada na etapa de 
hidrólise, porém com as devidas adaptações necessárias para a realização da 
fermentação (assepsia e aeração). O meio de fermentação foi composto por 
hidrolisado obtido a partir do processo de hidrólise enzimática descrito previamente 
e nutrientes (5 g/L peptona bacteriológica, extrato de levedura 3 g/L, extrato de malte 
3 g/L e sulfato de amônio 0,25 g/L). As fermentações ocorreram em biorreatores de 
coluna de bolhas durante 48h a 30ºC, com amostras sendo retiradas periodicamente 
para quantificação de açúcares e etanol. Os experimentos foram realizados em 
triplicata empregando diferentes vazões de aeração (0,3 vvm, 0,5 vvm e 0,7 vvm). 
 
 
 
 
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3.5 Métodos analíticos 
 
Para a determinação da umidade do bagaço de cana-de-açúcar utilizou-se 
uma balança de infravermelho Mark M163 (BEL Engineering, Piracicaba-SP). A 
caracterização do bagaço foi realizada antes e após o pré-tratamento, seguindo a 
metodologia padrão NREL - National Renewable Energy Laboratory (SLUITER et al., 
2011). As concentrações de etanol, açúcares e ácido acético foram medidas em um 
cromatógrafo líquido de alta eficiência Agilent Technology 1200 series (Agilent, 
Estados Unidos), conforme Medina (2013). Determinou-se a concentração celular 
por turbidimetria utilizando um espectrofotômetro (Beckman DU640B, USA), sendo 
correlacionada a leitura de absorbância a 600 nm com a concentração celular por 
meio de uma curva de calibração previamente determinada. 
 
 
 
 
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
Procedeu-se à caracterização do bagaço de cana-de-açúcar, obtendo-se 
como resultado, antes do pré-tratamento, 41,4 % de glucana, 19,7% de xilana, 3,8% 
de arabinosil, 0,5% de acetil, 23,2% de lignina e 3,2% de cinzas. Após o pré-
tratamento, a composição do bagaço incluiu: 47,1 % de glucana, 23,3% de xilana, 
2,9% de arabinosil, 0,2% de acetil, 13,2% de lignina e 3,6% de cinzas. 
Com o material pré-tratado, foram realizadas as reações de hidrólise enzimática em 
reator de coluna com leito fixo. A Figura 2 apresenta o perfil cinético da formação de 
açúcares devido à hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por 
sulfito alcalino. 
Conforme mostrado na Fig. 2, a velocidade da hidrólise foi maior durante as 
duas primeiras horas de processo, devido à maior disponibilidade de frações 
carboidrato de baixa recalcitrância no início da reação e à baixa concentração de 
produtos de hidrólise inibidores da ação das enzimas. Após 24h de processo, 
obteve-se uma concentração de glicose de 41,41 g/L, 47,17 g/L e 51,38 g/L nos 
experimentos com carregamento de sólidos de 9%, 12,5% e 16%, respectivamente. 
Apesar da maior concentração de glicose obtida com elevado carregamento de 
sólidos, obteve-se maior rendimento de hidrólise da celulose com baixo 
carregamento, conforme mostrado na Tabela 1. 
 
 
 
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Figura 2. Perfil cinético da formação de açúcares no processo de hidrólise enzimática de bagaço de 
cana-de-açúcar em reator de coluna com leito fixo empregando carregamento inicial de sólidos de: a) 
9%; b)12,5%; c)16%. 
 
 
 
 
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Tabela 1. Digestibilidade enzimática de bagaço de cana-de-açúcar sob diferentes carregamentos de 
sólidos. 
Carga inicial de sólidos Rendimento de hidrólise 
da glucana 
Rendimento de hidrólise 
da xilana 
9% 86,73 ± 1,78 74,96 ± 2,52 
12,5% 77,42 ± 7,47 79,14 ± 6,86 
16% 65,11 ± 7,48 71,84 ± 7,37 
 
O maior rendimento de hidrólise da celulose com baixo carregamento de 
sólidos pode estar associada a fenômenos como a inibição das celulases por 
produtos de hidrólise (celobiose e glicose) e adsorção improdutiva de enzimas nos 
sólidos presentes (GAN; ALLEN; TAYLOR, 2003). 
 
Os hidrolisados obtidos foram empregados para o processo fermentativo. A 
fermentação ou co-fermentação foram realizadas empregando, respectivamente, 
Saccharomyces cerevisiae IR2 ou Scheffersomyces stipitis NRRL-Y7124. Para 
ambas avaliou-se a influência da aeração (0,3 vvm, 0,5 vvm e 0,7 vvm) sobre o 
desempenho do processo fermentativo. 
Conforme mostrado na Fig. 3, a cinética de fermentação do processo com S. 
cerevisiae foi favorecida empregando aeração de 0,7 vvm, atingindo-se uma 
concentração de etanol de 32 g/L com uma eficiência de 69% e Yp/s de 0,36 g/g e 
uma produtividade volumétrica (Qp) de 1,36 g.L-1.h-1 ; porém, usando aeração de 
 
 
 
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0,5 vvm, apesar de mais lento, o perfil de formação de etanol resultou em 
concentração mais elevada após 24 horas, de 38 g/L e uma produtividade 
volumétrica (Qp) de 1,58 g.L-1.h-1, correspondendo a uma eficiência de 79% e Yp/s 
igual a 0,402 g/g. Para a aeração de 0,3 vvm, observou-se uma cinética de formação 
de produto ainda mais lenta, atingindo-se 35,7 g/L de etanol após 72 horas , 
correspondendo a uma eficiência de 65% e Yp/s igual a 0,33 g/g e um (Qp) de 0,67 
g.L-1.h-1. 
 
 
Figura 3: Perfil cinético da formação de etanol e consumo de glicose no processo fermentativo 
empregando reator de coluna de bolhas e Saccharomyces cerevisiae IR2 como levedura, sob 
diferentes vazões de ar: a) 0,3 vvm; b) 0,5vvm; c) 0,7 vvm. 
 
 
 
 
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A Figura 4 apresenta o perfil cinético da co-fermentação de hidrolisado com a 
levedura Scheffersomyces stipitis empregando diferentes aerações. 
 
 
Figura 4: Perfil cinético da formação de etanol e consumo de glicose e xilose no processo de co-
fermentação empregando reator de coluna de bolhas e Scheffersomyces stipitis como levedura, sob 
diferentes vazões de ar: a) 0,3 vvm; b) 0,5 vvm; c) 0,7 vvm. 
Conforme pode ser observado, a aeração de 0,3 vvm resultou em 16 g/L de 
etanol em 48 horas de reação, com eficiência de 58% e Yp/s de 0,29 g/g e uma 
produtividade volumétrica (Qp) de 0,35 g.L-1.h-1 . Maiores concentrações de etanol 
foram obtidas empregando maior vazão de ar, atingindo-se cerca de 30 g/L de 
etanol em 48h de processo empregando-se 0,5 vvm ou 0,7 vvm, porém a 
produtividade volumétrica (Qp) de foi maior empregando a aeração de 0,5 vvm (0,64 
g.L-1.h-1). A levedura S. stipitis começou a consumir a xilose depois de toda a glicose 
ser consumida, entretanto esse consumo é mais lento em relação glicose, sendo 
necessário estender o tempo da reação para que toda a xilose seja consumida, isso 
resulta em uma diminuição da produtividade volumétrica de etanol. 
0
50
100
150
0 20 40 60
Glicose
Xilose
Etanol
B
 
 
 
16 
 
 
5. CONCLUSÕES 
 
Nas reações de hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-
tratado por sulfito alcalino em reator de leito fixo obteve-se uma maior digestibilidade 
da celulose com menor carregamento de sólidos (9%), enquanto que a hidrólise com 
elevado carregamento de sólidos (16%) resultou em maior concentração final de 
açúcares. No processo fermentativo realizado com meio baseado em hidrolisado de 
bagaço de cana-de-açúcar conduzido no reator de coluna de bolhas, obteve-se, de 
uma forma geral, melhores desempenhos com aeração de 0,5 vvm para ambas as 
leveduras avaliadas. A cepa de S. stipitis apesar de consumir xilose, não aumentou 
significativamente a concentração final de etanol, resultando em uma menor 
produtividade volumétrica em comparação com a S. cerevisiae. 
 
 
 
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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
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