Aula 1 - Metodos de estudo em Histologia

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Histologia 
Por José Rivaldo de Lima 
Introdução 
A Histologia no sentido da palavra. Histo 
(tecidos) e Logia (estudo), sendo, portanto, o 
estudo dos tecidos. Se detendo no estudo das 
células e tecidos do corpo e de como essas 
estruturas se organizam para formar um órgão. Em 
razão da dimensão do material de estudo, a 
utilização do microscópio é fundamental. 
A Histologia veio a partir de várias ciências, 
seja a Química (ver histoquímica); Imunologia (ver 
Imuno-histoquímica); Patologia (ver 
histopatologia). 
O que veremos nessa disciplina? 
 Nessa disciplina, veremos os seguintes 
tecidos: Tecido Epitelial, Tecido Conjuntivo, Tecido 
Adiposo, Tecido Cartilaginoso, Tecido Ósseo, Tecido 
Nervoso, Tecido Muscular e Células do Sangue. 
Para estudarmos os tecidos, temos que 
enfrentar as lâminas. Que podem ser de dois tipos: 
 Lâmina Histológica (corte de um 
órgão, células e a matriz). 
 Lâmina Citológica (contém apenas 
células). 
Métodos de estudo em Histologia 
 A pequena dimensão das células e dos 
componentes da matriz extracelular (MEC), faz com 
que a histologia dependa do uso de microscópio. 
 Na técnica histológica de rotina usa-se 
lâminas histológicas e microscópio de luz. 
 Uma coisa muito importante para se 
prestar atenção, são as unidades de medida. 
Micrometro: 1µm equivale a 0,0001mm 
Nanômetro: 1nm equivale a 0,0001 µm 
 
 O microscópio óptico é capaz de ampliar 
até 2µm. *Resolução mais importante que a 
objetiva, ampliação. 
1º Coleta do Material 
 Quanto mais espesso o corte mais difícil a 
visualização da lâmina no microscópio. Geralmente 
a espessura ideal das lâminas está entre 2-9µm. 
 Geralmente o material vem de uma biopsia, 
e é necessário ter bastante cuidado com o material 
para não ocorrer problemas, como: apoptose 
devido a falta de irrigação. Por isso é necessário 
todo um procedimento para fazer uma lâmina 
histológica. Além disso, é usado geralmente apenas 
2cm no experimento, amostras muito grandes 
dificultam os processos com os reagentes. 
 
O Histotecnico, é um processador de 
lâminas automático. Muito importante para 
facilitar e otimizar as pesquisas na histologia. 
 
2º Fixação 
 Logo após a coleta, a amostra deve ser 
submetida ao processo de fixação, que tem por 
finalidade evitar a digestão dos tecidos por enzimas 
existentes nas próprias células (autólise) ou em 
bactérias. 
 A fixação pode ser feita por métodos físicos 
e químicos (mais frequente). Na fixação química o 
tecido é imerso em soluções para desnaturar 
agentes ou estabilizar agentes, criando pontes. 
Essas soluções são chamadas de fixadores. 
Isso demora um tempo normalmente para 
tecidos de mamíferos o ideal é entre 12-48h. Se 
passar disso, é melhor colocar na geladeira para 
diminuir a chance de problemas. 
 Outra maneira de fixar mais rapidamente, é 
fazer a perfusão intravascular do fixador, onde 
alcança os tecidos mais rapidamente através dos 
vasos sanguíneos. 
Fixadores mais usados: 
 Formaldeído a 4% ou a 10%; 
 PAS 
 Glutaraldeído 
Fala-se sobre a fixação dupla, onde para 
uma maior fixação usa-se uma solução de 
glutaraldeído tamponado, em seguida uma 
solução de tetróxido de ósmio. 
3º Desidratação 
 A desidratação nada mais é que a retirada 
da água dos tecidos e células. 
A água contida nos tecidos é inicialmente 
extraída pela passagem dos fragmentos por 
diversos banhos de soluções de concentrações 
crescentes de etanol (normalmente desde etanol 
70% em água até etanol 100%). 
 Uso em práticas de rotina, normalmente se 
dá um banho de 70%, outro de 80%, outro de 90% 
e dois de 100% para evitar erros na concentração 
devido a restos de materiais vindos dos banhos 
anteriores. 
 
 
Esquema de Desidratação: 
 
4º Diafanização 
Após a desidratação, o etanol dos 
fragmentos deve ser substituído por uma 
substância intermediária (geralmente um solvente 
orgânico), que é miscível tanto em etanol como no 
meio que foi escolhido para inclusão (parafina ou 
resina). 
Ou seja, se eu quero que o tecido fique duro 
com a resina ou parafina, tenho que tirar o álcool e 
a água, devido a parafina (ou resina) não se 
misturar com água ou álcool. 
Para a Diafanização (também chamada de 
clareamento), se usa o xilol ou toluol, que é tanto 
miscível (misturável) com a água, álcool e a 
parafina ou resina. 
 
Utiliza-se Xilol para permitir melhor a 
penetração de parafina na peça, num total de 2 ou 
3 banhos de xilol. 
Quando os fragmentos de tecidos são 
embebidos no solvente orgânico, eles ficam 
transparentes ou translúcidos. 
 
5º Impregnação 
O processo de impregnar os tecidos com 
parafina é chamado inclusão ou embebição em 
parafina e geralmente é precedido por duas 
etapas: desidratação e clareamento (diafanização). 
A parafina em temperatura ambiente é 
sólida, sendo assim para adentrar no tecido 
precisa-se estar em estado líquido. Dessa forma, 
usa-se a estufa. 
 
Os tecidos são colocados em parafina 
derretida (56 a 60°C). Geralmente são feitos 2 
banhos, cada um com a duração de 1 h. O calor causa 
a evaporação do solvente orgânico (xilol), e os 
espaços existentes dentro dos tecidos tornam-se 
preenchidos com parafina. Depois de os 
fragmentos serem retirados da estufa, a parafina 
solidifica e eles se tornam rígidos 
Com o tecido rígido, dessa forma, pode 
partir para o próximo passo que é a Inclusão. 
6º Inclusão 
Os blocos de parafina que contêm os 
tecidos são então levados a um micrótomo, onde 
são seccionados por uma lâmina de aço ou de 
vidro, de modo a fornecer cortes de 1 a 10 
micrômetros de espessura. 
Geralmente os cortes para lâminas 
histológicas são feitos com espessura de 5-10µm. 
 
Após serem seccionados, os cortes são 
colocados para flutuar sobre uma superfície de 
água aquecida e, depois, sobre lâminas de vidro, 
onde aderem e serão, em seguida, corados 
7º Coloração 
Para ser estudada ao microscópio, a 
maioria dos cortes histológicos deve ser corada, 
porque, com poucas exceções, os tecidos são 
incolores. Com essa finalidade, foram 
desenvolvidos métodos de coloração que tornam 
evidentes os vários componentes dos tecidos, das 
células e da MEC. 
A seletividade com que os corantes coram 
os componentes dos tecidos pode ser maior ou 
menor. Muitos corantes se comportam como 
substâncias de caráter ácido ou básico e tendem a 
formar ligações eletrostáticas (salinas) com 
componentes ionizados dos tecidos. Os 
componentes dos tecidos que se coram bem com 
corantes básicos são chamados de basófilos, e os 
que têm grande afinidade com corantes ácidos, de 
acidófilos. 
Em muitos procedimentos (ver 
“Imunocitoquímica”, adiante), os resultados de 
uma reação são evidenciados por um precipitado 
ou por um corante fluorescente, mas as células e 
os seus limites não são visíveis. Nesse caso é usado 
um contracorante – trata-se de um corante 
aplicado a um corte apenas para tornar possível a 
visualização das células ou dos núcleos. Outra 
maneira de evidenciar componentes de células e 
tecidos é a sua impregnação por metais, como 
prata e ouro, método muito usado para estudar 
tecido nervoso. 
A coloração é um processo demorado, 
geralmente ocorre entre 12-48h. 
O corante mais conhecido é o HE 
(hematoxilina e eosina). Onde a Hematoxilina é 
acidófila (corando DNA, RNA, ribossomos, poli 
ribossomos etc.) e a Eosina, basófila (corando 
membranas, organelas etc.).