Avaliação toxicológica do 3-(4-Clorofenilselanil)-1-metil-1H-indol através do modelo de maturação in vitro de oócitos bovinos

Prévia do material em texto

Toxicological evaluation of 3-(4-Chlorophenylselanyl)-1-methyl-1H-indole through the bovine oocyte in vitro maturation model
Universidade Estadual do Ceará
Faculdade de Veterinária - FAVET
Seminário Bolsistas de Iniciação Científica
“Avaliação toxicológica do 3-(4-Clorofenilselanil)-1-metil-1H-indol através do modelo de maturação in vitro de oócitos bovinos”
PASCHOAL, J., et al. Toxicology in vitro. v. 62, 2020.
Orientadora: Ana Paula Ribeiro Rodrigues
Bolsista: Jorgeanny Barbosa Linhares
Fortaleza
2020
Boa tarde, me chamo Jorgeanny Linhares, sou aluna de iniciação cientifica sob a orientação da profa. Dra. Ana Paula ribeiro rodrigues e hoje irei apresentar o artigo intitulado “avaliação toxicológica do ....”. Esse artigo foi escrito por Paschoal e colaboradores e publicado na revista “toxicology in vitro” no ano de 2020.
1
INTRODUÇÃO
Novas moléculas hibridas sintéticas
Combinação de duas ou mais estruturas biologicamente ativas
3-(4-Clorofenilselanil)-1-metil-1H-indol (CMI) 
Shaveta et al., 2016; Vieira et al., 2015.
átomo de selênio + núcleo indol
Hormônios
	Selênio	Núcleo Indol
	Protege celulas contra danos oxidativos; Previne a oxidação de lipídios, proteinas e DNA. 	Intensifica propriedades fisiológicas 
(Ex.: serotonina, melatonina, e tryptofano); Apresenta funções citoprotetivas, antioxidante, entre outras.
2
Os efeitos toxicológicos do CMI foram pouco analisados
Novas moléculas hibridas vem sendo sintetizadas ao longo dos anos. As Moléculas hibridas são combinações de duas ou mais estruturas biologicamente ativas. No caso da CMI a molécula utilizada nesse estudo, trata-se da junção do átomo de selênio com um núcleo indol. O selênio encontrado em diversos alimentos tem como característica proteger as celulas contra danos oxidativos. Já o núcleo indol presente na estrutura molecular de alguns hormonios tem a capacidade de intensificar as propriedade fisiológicas da molécula a que está associada, podendo apresentar funções citoprotetivas, antioxidantes, dentre outras. Sendo assim, esses dois componentes foram unidos com o intuito de potencializar suas ações e minimizar possíveis efeitos toxicos do selênio. O CMI já foi utilizado em diversos testes apresentando resultados positivos. No entanto, os efeitos toxicológicos do CMI foram pouco analisado.
2
INTRODUÇÃO
3
Testes in vitro;
Maturação in vitro de oócitos;
Diversos compostos;
Qualidade e maturação;
Adler et al., 2011; Hareng et al. 2005; Lazzari et al. 2008.
Por tanto para avaliar os efeitos toxicológicos dos compostos como o CMI, testes in vitro utilizando culturas de células são considerados bons modelos de estudos. Dentre eles, podemos destacar a maturação ín vitro de oócitos, que permite uma análise de diversos compostos com funções biológicas distintas, além de avaliar os efeitos sobre qualidade e maturação das células reprodutivas.
3
PROBLEMA
O CMI demonstrou bons resultados sobre a atividade biológica, entretanto, pouco se sabe a cerca de sua toxicidade em células reprodutivas.
4
Diante do exposto foi proposto que apesar de o CMI ter demonstrado bons efeitos biológicos, pouco se sabe sobre sua toxicidade reprodutiva. 
4
Verificar a toxicidade do CMI na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos.
Taxa de maturação oocitária;
Atividade Antioxidante;
Integridade da membrana;
Atividade mitocondrial.
OBJETIVO
5
Sendo assim o trabalho teve por objetivo verificar a toxicidade do CMI na maturação in vitro de oócitos bovinos. Analisando as taxas maturação oocitária, atividade antioxidante, Integridade da membrana e atividade mitocondrial. 
5
MATERIAL E MÉTODOS
Para Tanto foi utilizada a seguinte metodologia..
6
MATERIAL E MÉTODOS
Abatedouro local
Obtenção dos oócitos
25 - 30°C
TCM-199 HEPES
Complexo Cumulus-oócito (CCO)
Seleção
Transporte
Aspiração
10% soro fetal bovino
0.2 mM piruvato de sódio
83.4 mg/mL amicacina
Coleta
Lavagem
PBS 
7
Pares de ovários bovinos foram coletados em abatedouros locais e transportados ao laboratório em recipiente térmico entre 25-30ºC. No laboratório os ovários foram puncionados e o fluido obtido lavado em PBS. Por fim os complexos cúmulos oocitos foram selecionados em meio TCM-199 HEPES suplementado e destinados a maturação.
7
MATERIAL E MÉTODOS
Maturação in vitro
38,5 °C; 5% CO2
22-24h
TCM-199
10% FCS
1 μg/mL FSH
50 UI/ mL hCG
1 μg/mL estradiol
0.2 mM piruvato de sódio
83.4 μg/mL amicacina
8
Para maturação, os oócitos foram distribuídos em microgotas nas placas de petri contendo meio TCM-199 e incubados a 38,5 °C e 5% CO2, por um período de 22 a 24 horas.
8
MATERIAL E MÉTODOS
Delineamento experimental
CCOs
CMI
Controle
(TCM199)
25µM
50µM
100µM
200µM
MIV (22-24h)
Avaliações: Taxa de maturação; nível de espécies reativas de oxigênio/ROS; produção endógena de glutationa/GSH; atividade mitocondrial e status da membrana.
9
Assim o experimento seguira da seguinte forma: Após a seleção dos ccos, estes serão divididos de forma aleatória nos grupos controle e nas centrações de 25, 50, 100 e 200micromolar de CMI. Ao final esses tratamentos serão destinados a maturação in vitro e após avaliados segundo a taxa de maturação, nível de espécies reativas de oxigênio/ROS, grau de produção endógena de glutationa/GSH, nível de atividade mitocondrial e do status da membrana.
9
MATERIAL E MÉTODOS
Avaliação da maturação nuclear in vitro
Fluorescência (Hoechst 33342);
Configuração da cromatina;
 Estágios da maturação,
A: vesícula germinal (VG)
B: Ruptura da vesícula germinal (RVG)
C: Metáfase I (MI)
D: Metáfase II (MII)
E: Degenerado (DEG)
10
Para avaliação da maturação nuclear foi utilizado o marcador fluorescente HOECHST sendo os oócitos classificados de acordo com a configuração da cromatina segundo os estágios da maturação. 
10
MATERIAL E MÉTODOS
Avaliação da atividade metabólica mitocondrial
Brometo de metiltiazolildildifenil-tetrazólio (MTT);
Citoplasma roxo escuro: oócito viável e mitocôndria ativa; 
Citoplasma não-corado: oócito não-viável e mitocôndria inativa.
11
Para avaliação da atividade metabólica mitocondrial os ccos foram incubados com reagente MTT seguida da avaliação sob o esteromicroscópio. Onde foram classificados os oocitos com citoplasma roxo escuro foram classificados com mitocôndria ativa e os não corados como não-ativa.
11
MATERIAL E MÉTODOS
Avaliação da citotoxicidade e viabilidade
Live/Dead Assay kit;
Calceina – AM (verde);
Etídio homodimero-1 (vermelho);
Calceina - AM
Etídio homodimer-1
12
Para avaliação da citotoxidade e viabilidade do oócito, foram utilizados os marcadores fluorescentes calceina, corando de verde, e o etidio, que cora de vermelho, seguida da microscopia confocal, para avaliar a integridade da membrana plasmática.
12
MATERIAL E MÉTODOS
Níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (EROs)
2',7'diacetato di-hidrodiclorofluoresceína (DCFHDA);
Medida de emissão por intensidade de fluorescência (Cell^F software).
Intensidade DCFHDA
13
Para analisar os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio os oocitos foram incubados com o marcador dcf-hda e verificados de acordo com a medida da intensidade de fluorescência através de pixels no programa Cell f software
13
MATERIAL E MÉTODOS
Níveis intracelulares de glutationa endógena (GHS)
4-chloromethyl-6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin (Cell-Tracker Blue) 
Medida de emissão por intensidade de fluorescência (Cell^F software).
Intensidade Cell Tracker Blue
14
Para verificação dos níveis de antioxidante glutationa endógena intracelular celular foi usado o teste celltracker blue e a medida da intensidade da floresta este também foi através do programa CellF software.
14
Teste Qui-Quadrado
 Teste Live/Dead, teste MTT e Hoechst
Análise Estatística
MATERIAL E MÉTODOS
P <0,05
Médias ± EPM
ANOVA + Teste de Tukey (comparações múltiplas)
 ROS e GSH
15
Para analise estatística foram utilizadoso teste qui quadrado, para os dados live/dead, mtt e Hoechst. E ANOVA seguida de teste de tukey para EROS e GHS. Os resultados foram expressos em médias mais ou menos o erro padrão da média e considerados significativos quando p < 0,05.
15
RESULTADOS
Apresentado as metodologias agora irei mostrar os resultados...
16
	Tratamentos	Total de oócitos	Números de oócitos em MII	Porcentagem de oócitos em MII
	Controle	60	19	31,7a
	25µM CMI	57	19	33,3a
	50µM CMI	57	18	31,6a
	100µM CMI	54	14	25,9a
	200µM CMI	55	5	9,1b
TABELA 1: Taxa de oócitos em MII após o tratamento com CMI (Hoechst)
*Número de oócitos em estágio de MII é expresso como porcentagem do total de números de oócitos. # Letras diferentes indicam diferença estatística entre os tratamentos P <0.05. Os dados representam três repetições.
RESULTADOS
17
Na tabela 1 podemos verificar as taxas de maturação após tratamento com CMI. É possível observar que apenas o grupo com maior concentração demonstrou redução na quantidade de oócitos que atingiram a fase de m2, ou seja de maturação nuclear.
17
	Tratamentos	Total de oócitos	Números de oócitos com mitocôndria viável 	Porcentagem de oócitos com mitocôndria viável
	Controle	61	56	91.5a
	Controle Positivo 
(5% etanol)	53	0	0b
	25µM CMI	59	55	93.2a
	50µM CMI	54	50	94.4a
	100µM CMI	57	50	89.5a
	200µM CMI	59	55	93.2a
*Número de oócitos com mitocôndria ativa é expresso como porcentagem do total de números de oócitos. 
# Letras diferentes indicam diferença estatística entre os tratamentos P <0.05. Os dados representam três repetições.
TABELA 2: Avaliação de viabilidade de oócitos bovinos maturados in vitro após o tratamento com CMI (Teste MTT)
RESULTADOS
18
Na tabela 2 podemos verificar a viabilidade dos oocitos bovinos atraves do teste de MTT. È possível verificar que não houve diferença significativa dos tratamentos quando comparado com o controle.
18
	Tratamentos	Total de oócitos	Números de oócitos viáveis	Porcentagem de oócitos viáveis
	Controle	33	30	90.9a
	Controle Positivo 
(5% etanol)	28	0	0b
	25µM CMI	32	29	90.6a
	50µM CMI	33	30	90.09a
	100µM CMI	30	27	90a
	200µM CMI	33	30	90.9a
RESULTADOS
TABELA 3: Viabilidade de oócitos na presença de CMI (Análise Live/Dead)
*Número de oócitos com mitocôndria ativa é expresso como porcentagem do total de números de oócitos. 
# Letras diferentes indicam diferença estatística entre os tratamentos P <0.05. Os dados representam três repetições.
19
Na tabela 3 foi demonstrado a viabilidade dos oócitos após a maturação in vitro. È possível verificar que não houve diferença significativa quando comparado com o controle. 
19
RESULTADOS
Gráfico (A): Mensuração dos níveis de GHS endógeno em oócitos maturados in vitro na presença de CMI
Níveis de EROS (intensidade de pixels)
Concentrações (µM)
A
Letras diferentes acima das barras indicam diferença significativa P <0.05 em relação a intensidade de fluorescência.
Controle
20
No gráfico A podemos observar os níveis de glutationa após a MIV. Todos os tratamentos aumentaram a produção de GSH quando comparados ao grupo controle. No entanto, o nível mais alto de GSH foi observado no grupos de menor concentração de CMI. 
20
RESULTADOS
Gráfico (B): Níveis de EROs em oócitos maturados in vitro no grupo controle e nos grupos de tratamento com CMI. 
Níveis de EROS (intensidade de pixels)
Concentrações (µM)
Controle
Letras diferentes acima das barras indicam diferença significativa P <0.05 em relação a intensidade de fluorescência.
B
21
No gráfico B são apresentados os níveis de EROS após a MIV. Podemos observar que todos os grupos tratados demonstraram aumento significativo no nível de espécies reativos de oxigênio quando comparados ao grupo controle. 
21
CONCLUSÃO
O CMI não apresentou efeitos prejudiciais sobre os oócitos, mantendo sua qualidade, integridade, além de ter sido capaz de aumentar a síntese de GSH nos oócitos analisados.
22
Dessa forma os autores concluíram, que ....
22
OBRIGADA!
Com esse slide finalizo minha apresentação e me disponibilizo para possíveis críticas ou questionamentos, obrigada.
23
Toxicological evaluation of 3-(4-Chlorophenylselanyl)-1-methyl-1H-indole through the bovine oocyte in vitro maturation model
Universidade Estadual do Ceará
Faculdade de Veterinária - FAVET
Seminário Bolsistas de Iniciação Científica
“Avaliação toxicológica do 3-(4-Clorofenilselanil)-1-metil-1H-indol através do modelo de maturação in vitro de oócitos bovinos”
PASCHOAL, J., et al. Toxicology in vitro. v. 62, 2020.
Orientadora: Ana Paula Ribeiro Rodrigues
Bolsista: Jorgeanny Barbosa Linhares
Fortaleza
2020
Boa tarde, me chamo Jorgeanny Linhares, sou aluna de iniciação cientifica sob a orientação da profa. Dra. Ana Paula ribeiro rodrigues e hoje irei apresentar o artigo intitulado “avaliação toxicológica do ....”. Esse artigo foi escrito por Paschoal e colaboradores e publicado na revista “toxicology in vitro” no ano de 2020.
24
RESPOSTAS
Núcleo Indol
Possui uma estrutura bicíclica, que consiste em um anel benzênico (6 carbonos) acoplado a um anel de pirrol (anel de 5 membros com um nitrogênio). O par eletrônico não-ligante do nitrogênio participa do sistema aromático da molécula, e portanto, o indol não é uma base e não se comporta como uma amina simples.
25
Viabilidade da membrana plasmática
RESPOSTAS
Esterases
26
Quanto mais verde mais viável? Quanto mais vermelho menos viável? Pra saber se ta vivo ou morte tem olha calceina e etidio pra afirmar algo ou olhando só um dá certo?
26
MATERIAL E MÉTODOS
NÍVEIS INTRACELULARES DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (eros)
Sonda (?) 2',7'diacetato di-hidrodiclorofluoresceína (DCFHDA) > hidrólise de H2O2;
Incubação DCFHDA dos oócitos por 30 min. (37 °C, no escuro);
Medida de emissão de fluorescência por intensidade de pixels de 10 pontos aleatórios (Cell^F software ).
27
MATERIAL E MÉTODOS
NÍVEIS INTRACELULARES DE GLUTATIONA ENDÓGENA (GHS)
4-chloromethyl-6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin (?) (Cell-Tracker Blue) SERVE PRA Q
Incubação Cell-Tracker Blue dos oócitos por 30 min. (37 °C, no escuro);
Medida de emissão de fluorescência por intensidade de pixels de 10 pontos aleatórios (Cell^F software )
28
RESULTADOS
Figura 2: Óocito bovino submetido à análise Live/Dead após MIV na presença de CMI. 
Síntese de diferentes tratamentos nos oócitos. A primeira coluna mostra oócitos manchados por calceína AM, a segunda coluna mostra oócitos manchados por etídio homodimer-1, e a terceira coluna é uma sobreposição entre as imagens. A cor verde representa oócitos com membrana integral e vermelhos representa oócitos com danos na membranas.
Controle
25µM
50µM
100µM
200µM
Controle +
Calceina - AM
Etídio homodímero
Ambos
Calceina - AM
Etídio homodímero
Ambos
29
INTRODUÇÃO
Celulas endoteliais da artéria coronária;
Ação Antioxidante (protege proteínas da matriz extracelular).
Casaril et al., 2017b
Birmann et al., 2018; Casaril et al., 2017a 
Ratos;
Efeitos antioxidantes (antidepressivo, ansiolítico e antinociceptivo).
In vitro
In vivo
30
In vitro utilizando celulas endoteliais da artéria coronária foi verificado sua ação antioxidante ao proteger proteínas da matriz extracelular, e in vivo, utilizando camundongos demonstrou efeitos antioxidantes, antidepressivo, ansiolítico e antinociceptivo. Porém, pouco se sabe a cerca de sua toxicidade.
30
31
CMI foi sintetizado de forma à potencializar suas ações suas ações e minimizer possível toxicidade do selênio.
Testes in vitro mostram que CMI possui atividade antioxidants e tem capacidade de proteger proteínas contra danos a matriz extracellular causados por oxidantes derivados da inflamação.
CMI tem sido amplamente estudado in vivo, mostrando efeitos antioxidantes, antidepressivos, ansiolítico e antinociceptivo.
Pouco se sabe sobre sua toxicidade 
31