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Fertilização, clivagem e implantação 1. Introdução: O sucesso na reprodução animal está relacionado com múltiplos fatores entre os quais se destacam a produção dos gametas e sua interação no aparelho reprodutor feminino. Essa interação culmina com a fertilização do oócito na ampola da tuba uterina e resulta na formação do concepto (embrião propriamente dito e anexos), que será transportado até o útero onde realizará a implantação e desenvolvimento. O tempo de permanência do embrião/feto no interior do organismo materno é denominado de gestação, que termina naturalmente, no momento do parto, ou precocemente, nos processos de perda embrionária ou abortamento. Durante todo esse processo a progesterona é fundamental para o estabelecimento e manutenção da gestação em todos os seus estágios. Este texto tem como objetivo descrever o processo de união do espermatozoide com o oócito e os eventos fisiológicos mais relevantes relacionados ao seu desenvolvimento inicial do concepto e posterior implantação. 2. Fertilização: A fertilização, também conhecida como fecundação, é definida como a união entre o espermatozoide e o oócito; esse evento é precedido por uma série de eventos complexos tais como: ovulação, transporte do oócito na trompa, ejaculação, transporte dos espermatozoides no trato reprodutivo da fêmea, capacitação espermática, ativação de vários mecanismos moleculares, entre outros. A fertilização culmina com a primeira divisão mitótica do embrião. Após a ovulação, o oócito é rapidamente transportado para o local da fertilização, que acontecerá no terço médio das trompas (ampola). Caso a fêmea tenha sido coberta, os espermatozoides, presentes nos reservatórios espermáticos (junção útero-tubárica e/ou istmo), são liberados e vão ao encontro do oócito para realizar a fertilização. Espermatozoide: é indispensável que aconteça, no interior do trato reprodutor feminino, a remoção de algumas proteínas da sua membrana plasmática, e consequente exposição de receptores que permitirão a sua interação com o oócito. Paralelamente, ocorre também a hiperativação, desestabilização da membrana e aquisição da capacidade de realizar a reação acrossomal. O conjunto dessas modificações é denominado de capacitação espermática. Oócito: durante a fase de folículo pré-ovulatório o pico de LH estimula a produção local de fator de crescimento epidermal (EGF) e PGE2 que, por sua vez, estimulam a produção de duas substâncias: ampirregulina e epirregulina. Estas por sua vez, atuam nas células do cúmulus estimulando a secreção de hialuronidase, o que resulta na expansão do cúmulus. Nesse processo, o espaço entre as células é ocupado por uma “matriz extracelular”, que será de extrema importância para a captação do oócito pelas células ciliadas do infundíbulo. 2.1. Fases da fertilização 2.1.1. Contato e reconhecimento espécie-específico entre espermatozoide e oócito: A ligação dos espermatozoides à zona pelúcida (ZP) não é espécie-específica. Existem vários ensaios laboratoriais que utilizam gametas de espécies diferentes (ex. oócito equino com espermatozoides de hamster) para avaliar a capacidade de ligação espermática. Contudo, a ativação do conjunto de reações locais que culminam com a fertilização e formação dos pró-núcleos masculinos e femininos, só ocorre quando essa ligação é espécie específica, ou seja, só ocorrem quando oócitos e espermatozoides são da mesma espécie. A ZP é formada integralmente por três proteínas: ZP1, ZP2 e ZP3 (Figura 1). A camada externa da ZP é formada por um longo filamento contendo exclusivamente a proteína ZP3, sendo, portanto, a responsável pela união do espermatozoide com a ZP é mediada pela glicoproteína ZP3. Apenas espermatozoides capacitados tem capacidade de se ligar a ZP. Figura 1. Figura representativa da interação entre oócito e espermatozoide (Senger 2006). 2.1.2. Reação acrossomal e penetração da zona pelúcida: O acrossoma, uma estrutura celular formada a partir do Complexo de Golgi, é uma grande vesícula que reveste a parte apical do núcleo espermático. A membrana acrossomal, na sua parte interna, denominada de membrana acrossomal interna, encontra-se em íntimo contato com a carioteca, enquanto a região externa mantem estreito contato com a membrana nuclear e denominada de membrana acrossomal externa. Após ligação do espermatozoide com a ZP3, ocorre o aumento do cálcio intracelular (Ca++), que age como segundo mensageiro e desencadeia o processo denominado de reação acrossômica. A reação acrossômica caracteriza-se pela fusão da membrana acrossomal externa com a membrana plasmática em várias regiões da superfície espermática. Essa fusão resulta na formação de vesículas e de canais, que permitem que o conteúdo acrossomal, contendo várias enzimas proteolícias (ex. acrosina), seja liberado para o meio externo (Figura 2). As enzimas acrossomais dissolvem a ZP e formam um pequeno orifício pelo qual o espermatozoide pode passar. O aumento do Ca++ intracelular também resulta em um outro processo, denominado de hiperativação espermática, que se caracteriza pela intensificação do padrão de movimentação da cauda do espermatozoide, que se torna mais vigoroso, gerando uma força propulsora que permite que o espermatozoide passe pelo orifício criado na ZP e dirija-se à membrana vitelina. Figura 2. Representação esquemática da reação acrossomal de espermatozoides humanos, (A). A reação acrossomal dos espermatozoides capacitados ocorre após a ligação à zona pelúcida, (B). Após esse evento, a membrana acrossomal externa se funde com a membrana plasmática, liberando o conteúdo do acrossoma, (C). Fonte: https://www.jci.org/articles/vi ew/23213/figure/1 2.1.3. Ligação e fusão do espermatozoide a membrana vitelínica: Uma vez penetrada a ZP, o espermatozoide chega ao espaço perivitelino onde faz contato com a membrana vitelina do oócito. Nesse ambiente, a membrana acrossômica interna, que agora está exposta, se liga às numerosas microvilosidades da membrana vitelina. Essa ligação é mediada pela proteína fertilina, que é formada pelas subunidades a e b. Após essa ligação os movimentos da cauda cessam e a membrana vitelina se invagina e engolfa o espermatozoide. Uma vez no interior do oócito a cauda e as mitocôndrias se http://www.jci.org/articles/vi http://www.jci.org/articles/vi degeneram rapidamente. A membrana nuclear também degenera e libera, no citoplasma do oócito, o conteúdo nuclear. Após a ligação do espermatozoide com o oócito, acontecem duas importantes alterações que bloqueiam aceso de outros espermatozoides, evitando assim a ocorrência da polispermia. Essas alterações são conhecidas como: reação de zona e bloqueio vitelino. A reação de zona caracteriza-se pela perda da capacidade da ZP3 de se ligar aos espermatozoides e o bloqueio vitelino impede que outros espermatozoides se liguem à membrana plasmática do oócito. 2.1.4. Singamia: Fusão do material genético dos pronúcleos masculino e feminino no interior do óvulo: Uma vez presente no citoplasma do oócito, o núcleo haploide do espermatozoide perde membrana e a densa cromatina espermática começa a se descondensar. A seguir forma-se uma nova membrana nuclear. Essa nova estrutura é denominada pró-núcleo masculino. Ao mesmo tempo, no oócito, agora ativado pela fertilização, a segunda divisão meiótica se completa sendo formado o pró-núcleo feminino. Denomina-se singamia a união dos pro-núcleos masculino e feminino, que resulta na formação de um novo núcleo, agora diploide. Após a singamia, espermatozoides e oócito não existem mais, pois se forma um novo ser, que agora é denominado de ovo ou zigoto. 2.1.5. Ativação do metabolismo do óvulo: A fertilização resulta na ativação do oócito. Esse fenômeno é o resultado de uma cascata de reações moleculares consequentesa ativação da proteína G, que por sua vez, ativa a fosfolipase C (PLC). A PLC cliva o fosfatidil inositol 4,5-bifosfato (IP2) em diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3). O DAG, na presença do Ca++ fosforila a proteína quinase C (PKC). 3. Clivagem Cerca de 11 a 20 horas após a sua formação, o zigoto, ainda presente no interior da ZP, passa a sofrer a clivagem, que consiste em uma série de sucessivas divisões mitóticas, sem que, contudo, aumente a sua massa total (as células filhas têm metade do citoplasma da célula mãe). O processo de divisão celular, resulta na formação de novas células, conhecidas como blastômeros. A clivagem ocorre durante a fase inicial do desenvolvimento embrionário que acontece durante a permanência do zigoto/embrião na tuba uterina (Figura 3). A medida que ocorre a clivagem o número blastômeros aumenta e as divisões tornam-se assíncronas, nesta fase ocorre a ativação do genoma embrionário. Nos embriões bovinos, quando já possuem 16 blastômeros, observa-se um fenômeno de compactação das células e a formação de canais entre elas, permitindo assim, intercâmbio de moléculas e íons. Os blastômeros são idênticos e totipotenciais, tendo, portanto, potencial para formar um novo indivíduo. Nesta fase o embrião é denominado de mórula. A partir de 32 células começa a ocorrer a primeira diferenciação celular do embrião. As células mais externas passam a formar o trofectoderma e as internas passam a ser denominadas de massa celular interna (MCI). O trofectoderma dará origem ao trofoblasto, que por sua vez vai originar o cório, membrana fetal que formará a parte materna da placenta e que realizará a oxigenação do feto, secreção de hormônios, regulação da resposta imune, entre outras funções. Após o embrião alcançar o estágio de 64 células, observa-se a individualização da MCI. As células do trofoblasto formam entre si complexos funcionais. Essa modificação associada ao aumento da pressão osmótica no espaço intercelular permite o acúmulo de líquido, resultado da formação de uma cavidade preenchida por fluido. A partir da formação dessa cavidade, que recebe o nome de blastocele, o embrião passa ser denominado de blastocisto. Figura 3. Representação esquemática da clivagem. Fonte: Obstetrícia Veterinária, 2da. Edição, 2017. 3.1. Eclosão do blastocisto: Durante o seu desenvolvimento inicial o embrião permanece no interior da ZP. Nesta fase uma das funções chave da ZP é evitar a aderência do blastocisto ao oviduto; falhas nesse processo resultariam em uma gestação ectópica (gestação tubária), condição de grande risco de hemorragia e provável óbito. Ao chegar ao útero, na fase de mórula, o embrião ainda está contido no interior da ZP. Uma vez no útero, já na fase de blastocisto, a divisão permanente dos blastômeros e o contínuo acúmulo de fluidos no interior da blastocele faz com que o embrião se expanda em tamanho. Nesta fase, as células do trofectoderma, que são as que mais crescem, passam a sintetizar enzimas proteolítias que digerem e enfraquecem a ZP, até a formação de uma pequena fissura, através da qual o embrião escapa. A emergência do embrião para fora da ZP é denominada de eclosão. Os momentos de chegada do embrião ao útero nas diferentes espécies estão apresentados na tabela 1. Tabela 1. Estágio de desenvolvimento, momento da chegada ao útero e período de formação do blastocele nos embriões de diferentes espécies domésticas. Espécie Dias pós- ovulação Estágio de desenvolvimento Formação do blastocele (dias pós-ovulação) Suína 2 4 a 8 5 a 6 Bovina 3 a 3.5 8 a 16 células 7 a 8 Ovina 3 8 a 16 células 6 a7 Equina 4 a 10 Mórula 6 Canina 8 Blastocisto 8 3.2. Diferenças entre espécies: Na égua o embrião chega ao útero entre os dias 5 e 6 após a fertilização no estágio de mórula ou blastocisto inicial. Do mesmo modo, nesta espécie, observa-se a formação de uma cápsula entre a ZP e o trofoblasto, que permanece até o ~20 d da gestação. A semelhança da ZP, esta cápsula é desintegrada pela ação de enzimas proteolíticas provenientes do trofoblasto. Acredita-se que a função da capsula está relacionada à proteção (imune, mecânica, patógenos) do embrião no ambiente uterino. 4. Implantação Após a eclosão o trofoblasto permanece no exterior do embrião e na maioria dos mamíferos domésticos vai originar as membranas que darão origem a placenta. O desenvolvimento da placenta é crítico para que o embrião sobreviva além do estágio de blastocisto. Quando ocorre falha neste processo os embriões desenvolvem vários defeitos morfológicos e acabam morrendo. Existem duas etapas principais no processo de placentação. Primeiro, o trofectoderma do embrião se liga ao epitélio luminal do útero. A seguir o embrião desenvolve membranas extraembrionárias que se tornam intimamente associadas ao tecido materno e formam a placenta. Em primatas e roedores as membranas fetais invadem o endométrio e se implantam na submucosa. Esse processo é denominado de nidação e a placenta é dita deciduada. Nos ruminantes, suínos e equinos, praticamente não existe invasão e a implantação é sinônimo de aposição seguida de adesão. Nestes casos a placenta é dita adeciduada. A figura 4 ilustra alguns modelos de implantação e a tabela 2 indica o dia aproximado da implantação em alguns mamíferos. A implantação do embrião ao útero envolve a interação direta entre o trofoblasto e o endométrio. Como já mencionado, esse processo ocorre em duas fases: aposição e adesão. A aposição se refere ao desenvolvimento de um íntimo contato entre dos tecidos embrionários e maternos. O estabelecimento desse contato imobiliza o embrião dentro do útero. No processo de aposição que ocorre nos carnívoros, ruminantes, equinos e suínos, as membranas extra-embrionárias se expandem e preenchem o lúmen uterino, fazendo com que fiquem apostas (em contato) ao endométrio. Uma vez que o contato de trofoblasto com o endométrio esteja estabelecido e estabilizado, o processo de adesão se inicia. Isso envolve o entrelaçamento das microvilosidades das células do trofoblasto com as da mucosa uterina. A partir deste momento é difícil se destacar o embrião do útero. Figura 4. Representação esquemática dos modelos de implantação. (Bowen and Burghardt, 2000). As diferenças em relação ao dia da implantação nas espécies domésticas são mostradas na tabela 2. Tabela 2. Dia aproximado da implantação embrionária conforme a espécie. Espécie Dia Vaca 17 -20 Égua 28 - 40 Ovelha 15 - 16 Porca 11 - 14 5. Considerações finais A fertilização é um processo fisiológico que consta de 5 fases, apresentadas em ordem de ocorrência. A apresentação de uma condição desfavorável numa das fases poderia levar a falhas na fertilização e, consequentemente, no desenvolvimento do concepto. Só espermatozoides totalmente capacitados podem se ligar com as proteínas da ZP e desenvolver as diferentes respostas moleculares e estruturais que vão gerar o futuro embrião. A clivagem é definida com a divisão mitótica de células do zigoto, fenômeno que acontece na tuba uterina e que consta de várias fases nas quais o número de células aumenta exponencialmente até a individualização da MCI. Finalmente, após a eclosão do trofoblasto, processo que acontece no útero, é observada a implantação, caracterizada por a ocorrência de duas fases; aposição e adesão. 6. Referências Bowen, J.A., Burghardt, R.C., 2000. Cellular mechanisms of implantation in domestic farm animals. Semin. Cell Dev. Biol. 11, 93–104. https://doi.org/10.1006/scdb.2000.0155 Prestes, N.C., Da Cruz Landim-Alvarenga, F., 2017. Obstetrícia Veterinária, 2nd ed, Journal of Chemical Information and Modeling. Rio de Janeiro. https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004 Valadão, L., Moreira da Silva, H., Moreira da Silva, F., 2016. Bovineembryonic development to implantation. IntechOpen 1–11. https://doi.org/http://dx.doi.org/10.5772/57353 http://dx.doi.org/10.5772/57353 http://dx.doi.org/10.5772/57353
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